Thiết kế vector chuyển gen kháng virut trên cây thuốc lá mang gen chọn lọc thân thiện môi trường

I ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG VĂN SÔNG THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUT TRÊN CÂY THUỐC LÁ MANG GEN CHỌN LỌC THÂN THIỆN MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Lê Văn Sơn Thái Nguyên, năm 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ II LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết nêu trọng luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình nghiên cứu khác Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2013 Tác giả Hoàng Văn Sông Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ III LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ suốt trình thực khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Chu Hoàng Hà, ThS Phạm Thị Vân, KS Nguyễn Thị Thu Hiền, KS Nguyễn Văn Đoài, tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên Phòng công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu suôt trình hoàn thành khóa luận Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh thầy cô giáo Khoa khoa học sông – Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người bên tôi, động viên góp ý cho suốt trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2013 Học viên Hoàng Văn Sông Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ IV MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN III MỤC LỤC IV DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT VII DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH IX MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1 Nguồn gốc thuốc ồn gốc 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị khoa học thuốc 1.2 MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1 Bệnh virus thuốc 1.2.2 Sơ lƣợc virus gây bệnh khảm TMV thuốc 1.2.3 Biện pháp phòng chống bệnh virus 10 1.2.3.1 Sử dụng giống kháng bệnh 10 1.2.3.2 Sử dụng giống bệnh 10 1.2.3.3 Các biện pháp canh tác 11 1.2.3.4 Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học 11 1.3 Ứ 15 1.3.1 Giới thiệu chung 15 1.3.2 Phƣơng pháp để tránh loại bỏ gen chọn lọc 16 1.3.3 Gen mã hóa biến dƣỡng đƣờng mannose 17 1.4 MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ V 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Nguồn gen CP virus 20 2.1.2 Chủng vi khuẩn 20 2.1.3 Nguồn thực vật: 20 2.1.4 Hóa chất 20 2.1.5 Thiết bị 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc mannose 21 2.2.1.1 Chuẩn bị tế bào khả biến 21 2.2.1.2 Xử lý vector pK7GWIWG2(II) 22 2.2.1.3 Xử lý vector pNOV-Gusplus 24 2.2.1.4 Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose 25 2.2.2 Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc mannose 26 2.2.3 Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc 29 2.2.4 Chuyển gen vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 30 2.2.4.1 Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium 30 2.2.4.2 Tạo nguyên liệu chuyển gen 30 2.2.4.3 Nhiễm khuẩn đồng nuôi cấy 30 2.2.4.4 Tái sinh chọn lọc chuyển gen 31 2.2.4.5 Tạo rễ hoàn chỉnh 31 2.2.4.6 Phân tích có mặt cấu trúc chuyển gen 31 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc mannose 33 3.1.1 Kết xử lý vector pK7GWIWG2(II) 33 3.1.2 Kết xử lý vector pNOV-gusplus 34 3.1.3 Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose 35 3.2 Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc mannose 36 3.2.1 Kết chọn dòng phản ứng cắt emzyme hạn chế 37 3.2.2 Kết chọn dòng phản ứng PCR 38 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ VI 3.3 Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc 40 3.3.1 Xác định nồng độ mannose mảnh thuốc 40 3.3.2 Ảnh hƣởng mannose tới phát triển chồi/cây thuốc 41 3.4 Chuyển gen tái sinh vào thuốc 42 3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi TMV-M-CPi vào giống thuốc C9-1 K326 thông qua Agrobacterium tumefaciens 42 3.4.2 Phân tích chuyển gen 44 3.4.2.1 Phân tích khả kháng TMV chuyển gen 44 3.4.4.2 Kết phản ứng PCR 46 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ VII DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp Base pair CP Coat protein (protein vỏ) DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine tetra-acetate acid EtBr Ethidium Bromide et al Đồng tác giả Kb Kilobase kDa Kilodalton LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNAi RNA interference RNase Ribonuclease TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TMV Tobacco mosaic virus v/p vòng/phút Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ VIII DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh virus thuốc Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I 22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng T4 DNA Polymerase 23 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt enzyme Hind III 24 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt pNOV-Gusplus Hind III Pme I 25 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ghép nối nhờ enzyme T4 ligase 25 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng 26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt enzyme hạn chế 27 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 2.9 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 29 Bảng 2.10: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 29 Bảng 3.1 Các phân đoạn thu đƣợc theo tính toán lý thuyết cắt plasmid 37 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng mannose tới khả sống sót sinh trƣởng 40 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng mannose tới khả sống sót sinh trƣởng 42 Bảng 3.4 Kết biến nạp cấu trúc RNAi TMV-M-CP vào thuốc 44 Bảng 3.5 Kết lây nhiễm virus dòng thuốc chuyển gen 45 Bảng 3.6 Kết PCR kiểm tra có mặt gen cần chuyển 47 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ IX DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây thuốc Hình 1.2 Cấu trúc TMV tổ chức hệ gen Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi virus TMV Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc genome TMV 10 Hình 1.5: Cơ chế hoạt động RNAi 13 Hình 1.6: Quy trình chuyển gen sử dụng mannose làm chất chọn lọc 17 Hình 2.1: Mô hình thiết kế vector pK7_M 21 Hình 3.1: Biến nạp vector pK7GWIWG2(II) vào tế bào khả biến E.coli DB 3.1 33 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid pK7GWIWG2(II) 33 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pK7GWIWG2(II) 34 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid pNOV-gusplus 35 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm cắt pNOV-gusplus 35 Hình 3.6: Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid 36 Hình 3.7 Bản đồ cấu trúc pK7M/TMV-CPi 37 Hình 3.8 Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M/TMV-CPi 38 Hình 3.9 Các vị trí gắn cặp mồi pK7M/TMV-CPi 39 Hình 3.10 Phân tích sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang 39 Hình 3.11: Hình ảnh ảnh hƣởng mannose tới khả sống sót 41 Hình 3.12 Hình ảnh qua bƣớc nghiên cứu thí nghiệm 43 Hình 3.13 Hình ảnh chuyển gen sau lây nhiễm 45 Hình 3.14 Hình ảnh điện di DNA tổng số số dòng thuốc 46 Hình 3.15 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển mẫu thuốc 46 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thuốc (Nicotiana tabacum L.) công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia giới Việc trồng sản xuất thuốc thu hút nhiều nhân công, góp phần tạo công ăn việc làm thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động Cây thuốc đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Ngoài ra, thuốc đƣợc xem mô hình cho nhiều nghiên cứu sinh học nhƣ nghiên cứu trình trao đổi chất thực vật, hay vai trò, chức gen protein,… với khả dễ tái sinh chấp nhận gen ngoại lai Vì vậy, thuốc đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nghiên cứu ứng dụng đặc biệt làm đối tƣợng chuyển gen Tuy nhiên, thuốc chịu thiệ ởi bệ bệnh khảm thuốc TMV (Tobacco mosaic virus) Đây loại virus gây thiệt hại nặng nề làm giảm suất chất lƣợng cho hầu hết ruộng trồng thuốc Để hạn chế lây lan virus thực vật, biện pháp truyền thống đƣợc áp dụng nhƣ loại bỏ bị bệnh phát hiện, phun thuốc vệ sinh đồng ruộng không mang lại hiệu mà đòi hỏi nhiều thời gian, công sức ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng Việc tìm biện pháp để ngăn chặn phát triển lây lan virus thực vật vấn cấp bách Cùng với phát triển công nghệ sinh học, có nhiều ứng dụng sinh học phân tử chọn tạo giống trồng kháng virus, đó, công nghệ RNA interference (RNAi) tỏ giải pháp hữu hiệu thông qua việc sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gen mã hóa protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) chuyển vào trồng tạo trồng chuyển gen kháng virus Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 41 Quan sát hình thái phát triển giống thuốc C9-1 K326 cho thấy, mannose có tác động tới khả sinh trƣởng phát triển hai giống thuốc Tuy nhiên tác động không gây chết thuốc Ở ngƣỡng mannose 20 mg/l mảnh thuốc không khả tái sinh bắt đầu ngả vàng Tới ngƣỡng nồng độ mannose 30 mg/l, toàn mảnh ngả vàng rõ rệt hoàn toàn khả tái sinh 3.3.2 Ảnh hƣởng mannose tới phát triển chồi/cây thuốc Những chồi thuốc tạo thành từ việc đặt mảnh môi trƣờng tái sinh mannose tiếp tục đƣợc tách đặt môi trƣờng chọn lọc mannose nồng độ khác Kết đƣợc thống kê bảng 3.3 hình 3.11 Hình 3.11: Hình ảnh ảnh hƣởng mannose tới khả sống sót sinh trƣởng chồi thuốc Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 42 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng mannose tới khả sống sót sinh trƣởng chồi thuốc Số mẫu Tỷ lệ chồi in vitro Hình thái mẫu cấy rễ (%) cấy Môi Mannose trƣờng (mg/l) M1 30 100 M2 30 52,34 M3 10 30 41,15 M4 15 30 28,17 M5 20 30 7,67 M6 30 30 0,00 (điểm) Ghi chú: Hình thái mẫu cấy: điểm-cây phát triển bình thường xanh tốt; điểmcây phát triển chậm hơn, chiều dài thân rễ giảm 2/10 so với đối chứng âm; điểmcây phát triển chậm hơn, chiều dài thân rễ giảm 4/10 so với đối chứng âm; điểmcây phát triển chậm hơn, chiều dài thân rễ giảm 6/10 so với đối chứng âm; điểm: phát triển chậm với chiều dài thân rễ giảm 8/10 so với đối chứng âm, mảnh không tạo chồi; điểm- phát triển chậm không rễ, chiều dài thân giảm 9/10 so với đối chứng âm Quan sát hình thái phát triển giống thuốc C9-1 K326 cho thấy, mannose có tác động tới khả sinh trƣởng phát triển thuốc tƣơng tự hai giống Tuy nhiên tác động không gây chết thuốc Ở ngƣỡng mannose 20 mg/l chồi thuốc sống sót nhiên phát triển gần nhƣ không rễ, tỷ lệ rễ với chồi thuốc thấp chiếm khoảng 7% Tới ngƣỡng nồng độ mannose 30 mg/l, toàn chồi in vitro phát triển kém, còi cọc không rễ 3.4 Chuyển gen tái sinh vào thuốc thông qua Agrobacterium tumefaciens 3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi TMV-M-CPi vào giống thuốc C9-1 K326 thông qua Agrobacterium tumefaciens Quy trình chuyển gen vào giống thuốc K326 C9-1 [49] Theo quy trình này, bánh tẻ đƣợc cắt thành mảnh có kích thƣớc cm2 đặt Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 43 lên môi trƣờng tái sinh GM ngày trƣớc biến nạp sau đƣợc nuôi cộng sinh với dung dịch huyền phù Agrobacterium ngày chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn Giống thuốc C9-1 K326, đƣợc đặt mảnh môi trƣờng GM trƣớc biến nạp cho hiệu tái sinh thấp Do vậy, việc cắt mảnh C9-1 K326 phải hình vuông kích thƣớc khoảng 0,5 cm2 đƣợc cắt từ in vitro ngâm vào dung dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0,7-1) có lắc nhẹ 10 phút Việc giảm kích thƣớc mảnh xuống nửa đồng thời lắc nhẹ dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc vết thƣơng thực vật dịch khuẩn, biện pháp làm tăng khả xâm nhập vi khuẩn vào tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu chuyển gen Ngâm khoảng 30 mảnh đĩa petri chứa 20 ml dung dịch huyền phù vi khuẩn vòng 10 phút Sau đặt vào bình chứa môi trƣờng cảm ứng GM ngày ( MS, 1mg/l BAP, 30 g/l mannose, g/l agar, pH 5,8) A B D C E F Hình 3.12 Hình ảnh qua bƣớc nghiên cứu thí nghiệm A Cảm ứng thuốc lá; B Ngâm mảnh dịch khuẩn; C Đồng nuôi cấy D Tái sinh chồi cây; E Tạo rễ cây; F Cây sau tuần in vitro đưa môi trường Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 44 Bảng 3.4 Kết biến nạp cấu trúc RNAi TMV-M-CP vào thuốc Lô thí Mẫu Mẫu tạo Chồi tái Chổi rễ MT chọn chồi sinh lọc nghiệm Số lƣợng Tỷ lệ(%) K326 2x36 72 162 131 80,86 C9-1 2x36 72 86 61 70,93 ĐC 2x4 16 4 100 3.4.2 Phân tích chuyển gen 3.4.2.1 Phân tích khả kháng TMV chuyển gen phương pháp lây nhiễm nhân tạo Quan nghiên cứu tạo đƣợc dòng thuốc K326 C9-1 chuyển gen có kháng virus TMV Vì để kiểm tra đƣợc tính kháng, 100 dòng thuốc chuyển gen 10 đối chứng WT không chuyển gen đƣợc lây nhiễm nhân tạo với virus TMV qua lần, lần cách 15 ngày Sau lần lây nhiễm virus, dòng thuốc đƣợc quan sát biểu bệnh virus cảm quan Theo kết thống kê bảng 3.5 tỷ lệ kháng hoàn toàn dòng thuốc chuyển gen cấu trúc pK7M/TMV-CPi (K326 = 53,1% C9-1 = 44,5%), dòng thuốc biểu bệnh nhiễm virus TMV còi cọc, đầu nhọn vừa bị khảm (Hình 3.13) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 45 Bảng 3.5 Kết lây nhiễm virus dòng thuốc chuyển gen pK7M/TMV-CPi hệ T0 WT Lần lây nhiễm Các dòng chuyển gen Số Số WT Số Tỷ lệ Tổng Số Số Tỷ lệ đƣợc kháng có kháng số kháng lây hoàn biểu (%) lây biểu biểu (%) nhiễm toàn nhiễm hiện bệnh bệnh bệnh K326 C9-1 64 41 23(++) 64,1 10 5(+++) 41 39 2(+) 95 5(+++) 39 34 5(+) 87 0 Tổng 64 34 30 53,1 10 10 36 22 14(++) 61 10 5(+++) 22 19 3(+) 86 5(+++) 19 16 3(+) 84 0 Tổng 36 16 20 44,5 10 0 Ghi chú: (+), (++), (+++) mức độ biểu bệnh nhẹ, trung bình nặng a b a Cây biểu bệnh sau lây nhiễm b Cây không bị nhiễm bệnh Hình 3.13 Hình ảnh chuyển gen sau lây nhiễm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 46 3.4.4.2 Kết phản ứng PCR Để thực phản ứng PCR trƣớc tiên phải tiến hành tách DNA tổng số có chất lƣợng tốt Bƣớc trình tách chiết DNA nghiền mẫu nitơ lỏng Sau nghiền thành dạng bột mịn bổ sung dung dịch đệm, dung dịch có tác dụng tách pha tốt trình ly tâm Hình 3.14 Hình ảnh điện di DNA tổng số số dòng thuốc chuyển gen kháng virus gel agarose 0,8% Kết điện di cho thấy băng rõ nét, kết luận tách chiết thành công DNA tổng số phục vụ cho phản ứng PCR Các không nhiễm bệnh đƣợc thu mẫu để khẳng định có mặt cấu trúc chuyển gen phƣơng pháp PCR 313 bp Hình 3.15 Kết PCR kiểm tra có mặt gen chuyển mẫu thuốc K326 C9-1 M: Thang DNA chuẩn kb (Fermentas) Đƣờng chạy: 1-> 14 Sản phẩm PCR cặp mồi TMV Fi/TMV Ri mẫu thuốc chuyển gen C9-1 K326 Đƣờng chạy: (+) Đối chứng dƣơng plasmid TMV-RNAi Đƣờng chạy : (-) Đối chứng âm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 47 Bảng 3.6 Kết PCR kiểm tra có mặt gen cần chuyển Giống Số Số Kiểm tra PCR bầu sống Số kiểm Số dƣơng sót tra tính Tỷ lệ (%) K326 68 64 34 33 97% C9-1 36 36 5 100% Kết phân tích cho thấy, dòng K326 có 33 cây/ 34 đạt tỷ lệ 97% C91 có cây/ đạt tỷ lệ 100% cho kết dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.15) Đối chứng dƣơng plasmid TMV-RNAi làm khuôn mẫu Đối chứng âm sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu DNA tổng số tách chiết từ thuốc không chuyển gen (1 mẫu) cho kết âm tính Nhƣ vậy, kết dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri dòng thuốc chuyển gen chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc gen cần chuyển Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế thành công vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose pK7M/TMV-CPi mang gen chọn lọc mannose cấu trúc RNAiTMV-CPi Với nồng độ mannose 30 g/l thích hợp cho chọn lọc thuốc chuyển gen mang gen chọn lọc mannose Đã chuyển thành công cấu trúc RNAi TMV-M-CPi mang gen chọn lọc mannose vào giống thuốc C9-1 K326, tỷ lệ chuyển gen dƣơng tính PCR tƣơng ứng 97% 100% tỷ lệ kháng virus 44,5% 53% Kiến nghị Tiếp tục theo dõi đánh giá tính kháng mẫu thuốc chuyển gen hệ nhằm tạo đƣợc dòng thuốc có khả kháng TMV ổn định qua nhiều hệ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006) Kỹ thuật gieo trồng, chế biến thuốc NXB Lao động Hà Nội [2].Chu Hoàng Hà (2010): Nghiên cứu tạo trồng kháng bệnh virus gây công nghệ ức chế RNA (RNAi – Báo cáo tổng kết đề tài [3] Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996) Giáo trình Cây công nghiệp NXB Nông nghiệp, Hà Nội [4] Lê Trần Bình cộng (2006) Báo cáo tổng kết đề tài “Thu thập phân lập gen virus gây bệnh ba trồng thuộc họ Cà (Solanaceae) thuốc lá, khoai tây cà chua nhằm xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus tạo vật liệu di truyền cho tạo giống kháng bệnh virus” Đề tài cấp Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam giai đoạn 2005-2006 [5] Lê Lƣơng Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng, NXB Giáo dục [6] Lê Quỳnh Liên, (2010) Nghiên cứu tạo giống thuốc kháng bệnh khảm xoăn đọt kỹ thuật chuyển gen Thuyết minh đề tài thuộc nông nghiệp phát triển nông thôn [7] Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc làm sở dự báo nghiên cứu biện pháp phòng trừ Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc Việt Nam: http://ww.vinataba.com.vn [8] Nguyễn Đức Thành (2003) Chuyển gen thực vật NXB KH&KT Hà Nội [9] Phạm Thị , Hà Viết Cƣờ (2009) Tạo thuốc kháng virus TMV kỹ thuật RNAi 26/7 tạ , 25- Tr 32-40 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 50 [10] Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo thuốc kháng bệnh khảm virus bằ ật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái Tài nguyên sinh vật [11] Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A): 679-687 [12] Trần Đình Long, Mai Thạch Hoành, Hoàng Tuyết Minh, Phùng Bá Tạo, Nguyễn Thị Trâm (1997), Chọn giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [13] Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình bệnh chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH [14] Akehurt BC (1981): Tobacco.longman group Ltd, New York 764pp [15] Aswath CR, Mo SY, Kim DH, Park SW (2006) Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic selection marker phosphomannose isomerase Plant Cell Rep 5: 92–99 [16] Baulcombe D (2004) “RNA silencing in plants” Nature 431: 356-363 [17] Boscariol RL, Almeida WAB, Derbyshire MTVC, Mour˜ao Filho FAA, Mendes BMJ (2003) The use of the PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orange plants (Citrus sinensis L Osbeck) Plant Cell Rep 22:122–128 [18] Chapmam, (1998) Tobamovirus Isolation and RNA Extraction 11: 385-6 [19] Chicas and Macino, (2001) Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO (11): 992-6 [20] Collmer, Vogt, and Zaitlin, Virology (1983) showed the H protein was comprised of a backbone of TMV 126: 429-448 [21] Deblaere R, Bytebier B, DeGreve H, Beboeck F, Schell J, Van Montagu M, and Leemanns J (1985) Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium mediated gene transfer to plants Nucleic Acids Res 13: 4777–4788 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 51 [22] Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res 14(6): 989-94 [23] Gallitelli D (2000) The ecology of cucumber mosaic virus and sustainable agriculture Virus Res 71: 9-21 [24] Gallie DR, Sleat DE, Watts JW, Turner BC, and Wilson MA (1987) The 5’-Leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo Nucleic Acids Res 15: 3257 – 3273 [25] Goelet P, Lomonossoff GP, Akam ME, Gait MJ, and Ka J (1982) Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA Proc Natl Acad Sci USA 79 (19): 5818 -5822 [26] Gibbs A (1999) Evolution and origins of tobamoviruses Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354 (1383): 593-602 [27] Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogenderived resistance and practical approaches to plant virus disease control Adv Virus Res 75:161-83 [28] Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 [29] He Z, Duan Z, Liang W, Chen F, Yao W, Liang H, Yue C, Sun Z, Chen F, Dai J (2006) Mannose selection system used for cucumber transformation Plant Cell Rep 25(9): 953–958 [30] Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, and Sonnowald U (1996) Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase: possible hexose sensing in the secretory pathway Plant Cell 8: 793-803 [31] Joersbo M, Donaldson I, Kreiberg J, Petersen SG, Brunstedt J, Okkels FT (1998) Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet Mol Breed 4:111–117 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 52 [32] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing Plant Cell Rep 26 8: 1283-8 [33] Kawakami S, Watanabe Y, and Beachy RN (2004) Tobacco mosaic virus infection spreads cell to cell as intact replication complexes Proc Natl Acad Sci USA 101: 6291-6296 [34] Kim JY, Jung M, Kim HS, Lee YH, Choi SH, Lim YP, Min BW, Yang SG, Harn CH (2002) A new selection system for pepper regeneration by mannose J Plant Biotechnol 4(3):129–134 [35] Kung SD and Yang SF (1998) Discoveries in Plant Biology The Discovery of the Causal Agent of the Tobacco Mosaic Disease Chaper 7:105-110 [36] Leather V, Tanguay R, Kobayashi M, and Gallie DR (1993) A phylogenetically conserved sequence within viral 3’ untranslated RNA pseudoknots regulates translation Mol Cell Biol 13: 5331-5347 [37] Miles JS, and Guest JR (1984) Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli Gene 32: 41-48 [38] O’Kennedy MM, Burger JT, Botha FC (2004) Pearl millet transformation system using the positive selectable marker gene phosphomannose isomerase Plant Cell Rep 22: 684–690 [39] Ramesh SA, Kaiser BN, Franks T, Collins G, Sedgley M (2006) Improved methods in Agrobacterium-mediated transformation of almond using positive [40] Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 53 [41] Sigareva M, Spivey R, Willits MG, Kramer CM, Chang YF (2005) An efficient mannose selection protocol for tomato that has no adverse effect on the ploidy level of transgenic plants Plant Cell Rep 23: 236–245 [42] Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants Plant Physiol 102: 7-12 [43] Saito T, Yamanaka K, and Okada Y (1990) Long-distance movement and viral assembly of tobacco mosaic virus mutants Virology 176: 329-336 [44] Shinichiro K, Atsuko M, Masamichi N, and Yutaka T (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing Plant cell report 1283-1288 [45] Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319-20 [46] Stryer Lubert (1988) Third Edition W H Freeman and Company Biochemistry ISBN 0-7167-1843-X [47] Shew and Lucas (1991) Compendium of Tobacco Diseases American Phytopathological Society Press, St Paul, MN [48] Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res 102(1): 85-96 [49] Topping JF (1998) Tobacco transformation In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance Humana Press, Totowa, NJ 81: 365-485 [50] Todd R, Tague GW (2001) Phosphomannose isomerase: a versatile selectable marker for Arabidopsis thaliana germ-line transformation Plant Mol Biol Rep 19: 307–319 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 54 [51] Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dosedependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop cassava Plant Mol Biol 70(3):265-72 [52] Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64 [53] Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Lie Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, and Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants Plant J 27: 581–590 [54] Wang AS, Evans RA, Altendorf PR, Hanten JA, Doyle MC, Rosichan JL (2000) A mannose selection system for production of fertile transgenic maize plants from protoplasts Plant Cell Rep 19:654–660 [55] Wright M, Dawson J, Dunder E, Suttie J, Reed J, Kramer C, Chang Y, Novitzky R, Wang H, Artim-Moore L (2001) Efficient biolistic transformation of maize and wheat using the phosphomannose isomerase gene, pmi as the selectable marker Plant Cell Rep 20:429–436 [56] Yan PQ, Bai XQ, Wan XQ, Guo ZK, Li LJ, Gong HY, and Chu CC (2007) Expression of TMV coat protein gene RNAi in transgenic tobacco plants confer immunity to tobacco mosaic virus infection Yi Chuan 29(8):1018-22 [57] Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, and Bartel DP (2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101: 25–33 [58] Zhang P, Puonti-Kaerlas J (2000) PIG-mediated cassava transformation using positive and negative selection Plant Cell Rep 19:1041–1048 [59] Zhu YJ, Agbayani R, McCafferty H, Albert HH, Moore PH (2005) Effective selection of transgenic papaya plants with the PMI/Man selection system Plant Cell Rep 24:426–432 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 55 [60] Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus Transgenic Res 16(3): 385-98 TÀI LIỆU INTERNET [61].http://www.hanghoaviet.com/vietnamproducts/vi/news/Trong-caygi/DV2962-giong-ca-chua-chiu-nhiet-va-khang-benh-xoan-la-virus-4637/ [62] http://www.apsnet.org/online/comcom/names/tobacco.asp [63].http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/44070_Cay-biendoi-gene-phat-trien-khong-ngung.aspx [64] http://thienho.com/w1/index.php?title=Bệnh_khảm_(hại_thuốc_lá Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ [...]... đề tài: Thiết kế vector chuyển gen kháng virus trên cây thuốc lá mang gen chọn lọc thân thiện môi trường MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU -Thiết kế đƣợc vector RNAi chuyển gen mang các gen đặc thù của virus khảm thuốc lá - Tạo chủng Agrobacterium mang vector chuyển gen - Tạo cây thuốc lá mang gen chọn lọc mannose NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu phân lập gen mã hóa đƣờng mannose từ vector gốc và gắn gen mã hóa... tạo cây chuyển gen kháng virus Một trong những kết quả củ ế ậ 2 năm 2007-2008: ống cây trồ virus” là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen mang gen chọn lọc kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự đã tạo đƣợc dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV... vào vector RNAi gốc tạo thành vector RNAi chọn lọc bằng mannose - Nghiên cứu thiết kế các đoạn đơn gen CP của virus gây bệnh thuốc lá - Nghiên cứu thiết kế vector RNAi đơn của TMV chọn lọc bằng đƣờng mannose Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1 Nguồn gốc cây thuốc lá Thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trên. .. ốc lá Tobacco etch virus (Virus gây bệ ốc lá) và ốc lá) Xoăn lá thuốc lá Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn lá thuốc lá) Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite Tobacco mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh) Hoạ ốc lá Tobacco necrosis virus (Virus gây hoạ ốc lá) Bung hạt thuốc lá Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc. .. các enzyme này đƣợc gắn bên cạnh các gen chọn lọc Một khi các tế bào mang gen đích đã đƣợc chọn, các gen recombinase có thể đƣợc kích hoạt bởi những yếu tố bên ngoài và loại bỏ các gen chọn lọc và chính nó ra khỏi genome thực vật, tạo ra các cây chuyển gen không mang các gen chọn lọc Có ba hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu đã đƣợc ứng dụng thành công để loại bỏ gen chọn lọc Thƣờng đƣợc dùng nhất là hệ thống... lo ngai trên, thực tế đã làm chậm quá trình sử dụng nguồn lợi từ cây chuyển gen [6] Vì thế, đã có nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành theo hƣớng phát triển các phƣơng pháp chuyển gen không sử dụng gen chọn lọc hoặc loại bỏ các gen chọn lọc Bên cạnh việc giảm bớt những lo lắng của công chúng, việc vắng mặt các gen chọn lọc trong cây chuyển gen đồng thời giảm chi phí trong việc phát triển cây chuyển gen và... quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật Các bƣớc chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen [48] Tính hiệu... tự gen CP của TMV gây bệnh trên cây thuốc lá thu thập tại một số vùng chuyên canh đã đƣợc xác định và đánh giá đa dạng di truyền [4] Dựa vào kết quả nghiên cứu này vùng gen CP của TMV Việt Nam có độ bảo thủ cao đã đƣợc sử dụng trong “Nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus bằng công nghệ RNAi” [2] Tuy nhiên vector chuyển gen đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này mang gen chọn lọc đƣợc dùng là các gen kháng. .. mang gen chuyển Thông thƣờng các gen chọn lọc đƣợc dùng là các gen kháng lại kháng sinh nhƣ hygromycin (hpt) và kanamycin (nptII) hoặc kháng lại các chất diệt cỏ nhƣ phosphinothricin (bar) và chlorosulfuron (als) Các chất này đƣợc gọi là các chất chọn lọc và có tác dụng diệt các tế bào không mang các gen kháng lại nó nhƣng không làm ảnh hƣởng đến các tế bào có mang gen chuyển Trong thực tế, những gen. .. lá) Đốm vòng thuốc lá Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân lá thuốc lá Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân lá thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua) Viền gân lá Potato virus Y ... [37] Trên sở tiến hành nghiên cứu đề tài: Thiết kế vector chuyển gen kháng virus thuốc mang gen chọn lọc thân thiện môi trường MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU -Thiết kế đƣợc vector RNAi chuyển gen mang gen. .. 2.2.1.4 Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose 25 2.2.2 Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc mannose 26 2.2.3 Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc ... sinh chuyển gen, việc sử dụng gen có khả chọn lọc kèm với gen đích cần thiết nhằm tách đƣợc số lƣợng ỏi tế bào chuyển gen vô số tế bào không mang gen chuyển Thông thƣờng gen chọn lọc đƣợc dùng gen