Phản ứng LR
Phản ứng đƣợc thực hiện theo quy trình Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 plasmid pENTR/CPi (50 – 150 ng) 1 2 Vector pK7-M (150 ng/l) 0,5 3 Nƣớc khử ion, khử trùng 2,5 Tổng 4
- Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Vortex 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
- Bổ sung vào ống ly tâm 2 µl enzyme LR ClonaseTM để phản ứng và trộn bằng cách voltex nhẹ nhàng 2 lần. Ly tâm nhẹ nhàng.
- Ủ phản ứng ở 25o
C trong 90 phút (thay vì 1 giờ nhƣ trong kit).
- Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Voltex nhẹ nhàng. Ủ 37oC trong 10 phút.
Biến nạp sản phẩm LR vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Cơ sở lý thuyết
Phƣơng pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α đƣợc tiến hành. Màng tế bào vi khuẩn dƣới tác dụng của hóa chất trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử DNA chui vào. Sau đó các tế bào đƣợc phục hồi trong môi trƣờng nuôi cấy và các thể biến nạp trên môi trƣờng thích hợp.
Quy trình
Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau khi phục hồi, dịch tế bào đƣợc cấy trải lên đĩa chọn lọc có chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l.
Chọn dòng
Một số khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên nuôi qua đêm 37oC trong 4 ml LB lỏng có bổ sung streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l để tách chiết plasmid. Sau đó, phản ứng cắt plasmid bằng hai enzyme Xba I và Hind III đƣợc thực hiện để xác định sự có mặt DNA tái tổ hợp.
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
STT Thành phần Thể tích ( l)
1 Buffer Y+/ TangoTM(2X) 2
2 Enzyme Xba I 1
3 Enzyme Hind III 1
4 H2O 1
5 Template 5
Tổng 10
Bổ sung lần lƣợt các thành phần trên vào ống eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Kỹ thuật PCR và colony-PCR
Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần.
Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950
C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Quy trình
Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen CPi quan tâm đƣợc tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri [11] với trình tự nhƣ sau:
TMV-Fi: 5’- CACCATGAAACCTTCACCACA-3’ TMV-Ri: 5’- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3’ Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 31,25 2 Buffer PCR (NH+4) (10X) 5 3 MgCl2 (2,5 mM) 5 4 dNTPs (10 mM) 4 5 TMV – Fi (10 pmol/ µl) 2 6 TMV – Ri (10 pmol/ µl) 2
7 Taq polymerase (5u// µl) 0,25
8 DNA khuôn 0,5
Bảng 2.9. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
25
3 Gắn mồi 52 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞