VIỆT NAM
Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus. Một trong những kết quả củ
ế 2 năm 2007-2008:
ậ ống cây trồ
virus” là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen mang gen chọn lọc kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự đã tạo đƣợc dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV với tỷ lệ 74,5% và kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV với tỷ lệ 70,8%. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi trong việc tạo giống cây trồng kháng virus.
Kỹ thuậ ợc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài
trọng điểm cấp nhà nƣớc thuộc chƣơng trình phát triển công nghệ sinh học (KC04-03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng bệnh virus. Đề tài đã đƣợc nghiệm thu cấp nhà nƣớc trong tháng 9/2010. Một trong những kết quả đạt đƣợc của đề tài là đã tạo ra đƣợc các dòng đu đủ chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng.
Bên cạnh cây trồng chuyể ất nhiều thành
kháng côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi mang lại hiểu quả kinh tế cao [8].Tất cả đang mở ra một thời kì mới cho nền nông nghiệp Việt Nam.
Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tạo cây chuyển gen ở Việt Nam nói trên đều đang sử dụng chất chọn lọc kanamicin. Do vậy, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng gen chọn lọc mannose mang tính thân thiện với môi trƣờng sẽ mở ra một hƣớng mới trong nghiên cứu này ở Việt Nam.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguồn gen CP của virus
Plasmid pENTRY mang đoạn gen CP của virus TMV thu thập tại Bắc Giang [9] [10].
2.1.2.Chủng vi khuẩn
E. coli DH5 và One Shot TOP 10 (Invitrogen) Agrobacterium tumefaciens.
2.1.3. Nguồn thực vật:
Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 và C9-1 đang nuôi cấy trong điều kiện in vitro (Phòng Công nghệ Tế bào Thực Vật-Viện Công nghệ sinh học).
2.1.4. Hóa chất
Kít tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit) và tách chiết plasmidZ(Plasmid Extraction Kit) (Bioneer, Hàn Quốc); bộ kit nhân dòng pENTRTM Directional TOPO® Cloning Kit.
Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Glucose, Trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, Nƣớc khử ion. Các loại kháng sinh kanamycin, và các hóa chất thông dụng khác (X- gal, agarose,...) của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…
2.1.5. Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Thiết kế vector RNAi gốc chọn lọc bằng mannose
Hình 2.1: Mô hình thiết kế vector pK7_M
2.2.1.1. Chuẩn bị tế bào khả biến
Tế bào E. coli DH5 và E. coli DB3.1 đƣợc cấy ria trên môi trƣờng LB đặc và nuôi qua đêm ở 370
C. Chọn một khuẩn lạc nuôi cấy trong 5 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, qua đêm. Hút 1% dịch khuẩn ở trên cho vào 50 ml LB lỏng, lắc 200 v/p, ở 370C, trong 2-3 giờ, đo OD600nm đạt 0,4 - 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40C). Ly tâm 4000 v/p, ở 40C, trong 5 phút. Thu cặn và hoà tan trong 30 ml CaCl2 0,1 M, để trong đá 15 phút, sau đó ly tâm 4000 v/p, ở 40
C, trong 5 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100 ml LB ban đầu. Bổ sung 15-20% glycerol. Chia 50 l dịch tế bào khả biến vào mỗi ống
2.2.1.2. Xử lý vector pK7GWIWG2(II)
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
1. Biến nạp vector pK7GWIWG2(II) vào tế bào khả biến E.coli DB3.1 bằng shock nhiệt 42oC trong 1 phút. Cấy trải khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa Str 40 mg/l, spec 100 mg/l. Nuôi qua đêm ở 37oC.
2. Lấy 1 khuẩn lạc, nuôi lỏng qua đêm ở 37oC. Dịch khuẩn đƣợc thu và tách chiết plasmid theo phƣơng pháp Sol [40].
3. Plasmid thu đƣợc đƣợc lần lƣợt xử lý các enzyme cắt giới hạn Sph I, phản ứng cắt đầu 3’ tạo đầu bằng bởi T4 DNA Polymerase, cuối cùng đƣợc xử lý bởi RE Hind III.
Phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) bởi enzyme Sph I
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pK7GWIWG2(II) 10 2 10X Buffer B 3 3 Sph I (10u/ µl) 4 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 13 Tổng 30
- Mix nhẹ nhàng và ly tâm vài giây. - Ủ ở 37o
C trong 1-16 giờ.
- Sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 1% sẽ xuất hiện 3 băng DNA ~ 6500 kb, ~ 5 kb và ~ 1500 Cắt lấy băng có kích thƣớc ~ 5 kb để tinh sạch bằng bộ kít Fermentas.
Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
- Cơ sở lý thuyết
- Trên cột thôi gel có màng chứa các phân tử có ái lực cao với DNA, khi cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA sẽ đƣợc cố định trên màng còn các thành phần khác sẽ đi qua màng và đƣợc loại bỏ. Khi bổ sung nƣớc vào màng, DNA
Quy trình
- Điện di sản phẩm PCR của gen quan tâm trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer theo tỷ lệ :Vmẫu:VBinding buffer = 1:1 ( 1mg mẫu tƣơng ứng với 1 µl); ủ 550C trong 10-15 phút, đảo nhẹ cho đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp sang cột Qiaquick spin, ly tâm hỗn hợp 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, bổ sung 500 µl Wash buffer (hoặc ethanol 700), ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Bổ sung 30µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa màng lọc. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA.
Xử lý bởi T4 DNA Polymerase
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng bởi T4 DNA Polymerase
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 DNA (0,5 – 1 µg / µl) 35
2 Mul ti – CoreTM Buffer (10X) 5
3 dNTP (10 mM) 2 4 T4 DNA polymerase (100/ µl) 1 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 7 Tổng 50 - Ủ 37o C trong 2 giờ.
- Ngừng phản ứng băng cách bổ sung 2 µl của 0,5M EDTA. - Sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch bằng cách:
- Li tâm 12.000 vòng/ phút trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch thấm khô, bổ sung 1000 µl ethanol 70% ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch và để khô trong box.
- Hòa tan 30µl nƣớc deion khử trùng đã xử lý DEPC 0,01% Phản ứng cắt bởi enzyme Hind III
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme Hind III
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 DNA (0,5 – 1 µg / µl) 30 2 Buffer R (10X) 4 3 Hind III (10 u/ µl) 2 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 4 Tổng 40
- Mix nhẹ nhàng và ly tâm vài giây. - Ủ 37 ở 37o
C trong 1-16 giờ.
- Sản phẩm sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Phân đoạn có kích thƣớc khoảng 4700 bp đƣợc thu nhận và tinh sạch theo bộ kit Fermentas.
2.2.1.3. Xử lý vector pNOV-Gusplus
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
1. Biến nạp vector pNOV-gusplus vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng shock nhiệt 42oC trong 1 phút. Cấy trải khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa spec 100 mg/l. Nuôi qua đêm ở 37 oC.
2. Nhặt 1 khuẩn lạc, nuôi lỏng qua đêm ở 37 oC. Dịch khuẩn đƣợc thu và tách chiết plasmid theo phƣơng pháp Sol [40].
3.Plasmid thu đƣợc đƣợc xử lý đồng thời 2 enzyme cắt giới hạn Hind III và Pme I.
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt pNOV-Gusplus bởi Hind III và Pme I -STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pK7GWIWG2(II) 46 2 Buffer Tago (10X) 6 3 Hind III (10 u/ µl) 4 4 Pme I (5 u/ µl) 4 5 Nƣớc khử ion, khử trùng 0 Tổng 60
4. Sản phẩm sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Phân đoạn có kích thƣớc khoảng 7000 bp đƣợc thu nhận và tinh sạch theo bộ kit của Fermentas.
2.2.1.4. Tạo vector chuyển gen pK7_M mang gen chọn lọc mannose
Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
1. Phản ứng ghép nối: Hai phân đoạn DNA sau khi đƣợc tinh sạch ở mục 2.2.1.2 và 2.2.1.3 đƣợc trộn với nhau và gắn kết nhờ enzyme T4 ligase.
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng ghép nối nhờ enzyme T4 ligase.
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pNOV – mannose (100 ng) 3 2 pK7/ TMV (100 ng) 6 2 Buffer T4 ligase (10X) 2 3 50 % PEG 4000 2 4 T4 ligase (5 u/ µl) 1 5 Nƣớc khử ion, khử trùng 6 Tổng 20
2. Sản phẩm của phản ứng đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli
3. Nhặt 1-3 khuẩn lạc, nuôi lỏng qua đêm ở 37oC. Dịch khuẩn đƣợc thu và tách chiết plasmid theo phƣơng pháp Sol [40].
4. Plasmid thu đƣợc đƣợc kiểm tra bởi enzyme cắt giới hạn Hind III và
Xbal I.
5. Sản phẩm sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
2.2.2. Thiết kế vector RNAi chuyển đơn gen TMV chọn lọc bằng mannose
Phản ứng LR
Phản ứng đƣợc thực hiện theo quy trình Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme mix Kit (Invitrogen) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Bổ sung các thành phần sau vào ống ly tâm 1,5 ml ở nhiệt độ phòng và trộn nhẹ. Bảng 2.6. Thành phần phản ứng LR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 plasmid pENTR/CPi (50 – 150 ng) 1 2 Vector pK7-M (150 ng/l) 0,5 3 Nƣớc khử ion, khử trùng 2,5 Tổng 4
- Làm tan hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM trên đá khoảng 2 phút. Vortex 2 lần, mỗi lần khoảng 2 giây.
- Bổ sung vào ống ly tâm 2 µl enzyme LR ClonaseTM để phản ứng và trộn bằng cách voltex nhẹ nhàng 2 lần. Ly tâm nhẹ nhàng.
- Ủ phản ứng ở 25o
C trong 90 phút (thay vì 1 giờ nhƣ trong kit).
- Bổ sung 1 µl dung dịch proteinase K để kết thúc phản ứng. Voltex nhẹ nhàng. Ủ 37oC trong 10 phút.
Biến nạp sản phẩm LR vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt
Cơ sở lý thuyết
Phƣơng pháp biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α đƣợc tiến hành. Màng tế bào vi khuẩn dƣới tác dụng của hóa chất trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử DNA chui vào. Sau đó các tế bào đƣợc phục hồi trong môi trƣờng nuôi cấy và các thể biến nạp trên môi trƣờng thích hợp.
Quy trình
Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sốc nhiệt. Sau khi phục hồi, dịch tế bào đƣợc cấy trải lên đĩa chọn lọc có chứa kháng sinh streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l.
Chọn dòng
Một số khuẩn lạc đƣợc chọn ngẫu nhiên nuôi qua đêm 37oC trong 4 ml LB lỏng có bổ sung streptomycin 40 mg/l, spectinomycin 100 mg/l và chloramphenicol 50 mg/l để tách chiết plasmid. Sau đó, phản ứng cắt plasmid bằng hai enzyme Xba I và Hind III đƣợc thực hiện để xác định sự có mặt DNA tái tổ hợp.
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế
STT Thành phần Thể tích ( l)
1 Buffer Y+/ TangoTM(2X) 2
2 Enzyme Xba I 1
3 Enzyme Hind III 1
4 H2O 1
5 Template 5
Tổng 10
Bổ sung lần lƣợt các thành phần trên vào ống eppendorf 1,5 ml, ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Kỹ thuật PCR và colony-PCR
Cơ sở lý thuyết
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi polymerase) dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và phản ứng kéo dài đoạn trình tự mồi nhờ enzyme Taq DNA polymerase để khuếch đại theo hàm mũ các đoạn DNA mục tiêu lên hàng triệu lần.
Nguyên tắc của colony-PCR cũng giống nhƣ PCR, nhƣng chỉ khác là mẫu DNA đƣợc thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950
C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen bằng cặp mồi đặc hiệu.
Quy trình
Phản ứng PCR khuếch đại vùng gen CPi quan tâm đƣợc tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri [11] với trình tự nhƣ sau:
TMV-Fi: 5’- CACCATGAAACCTTCACCACA-3’ TMV-Ri: 5’- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3’ Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 31,25 2 Buffer PCR (NH+4) (10X) 5 3 MgCl2 (2,5 mM) 5 4 dNTPs (10 mM) 4 5 TMV – Fi (10 pmol/ µl) 2 6 TMV – Ri (10 pmol/ µl) 2
7 Taq polymerase (5u// µl) 0,25
8 DNA khuôn 0,5
Bảng 2.9. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (OC) Thời gian Chu kì
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
25
3 Gắn mồi 52 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
2.2.3. Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc mô/chồi/cây chuyển gen mô/chồi/cây chuyển gen
Cây con của hai giống thuốc lá C9-1 và K326 đƣợc nuôi trong điều kiện in vitro, khi cây con phát triển đƣợc 3-4 lá non là tốt nhất để làm nguyên liệu thực vật.
Các mảnh lá đƣợc cắt với kích thƣớc 1x1cm và ngâm trong dung dịch ½ MS trong 10 phút, sau đó làm khô mảnh lá bằng giấy thấm và đặt trên môi trƣờng MS cơ bản trong tối 2 ngày. Mảnh lá đƣợc nuôi trong tối sau 2 ngày, chuyển 1/2 mảnh lá lên môi trƣờng tạo chồi. Sau khoảng 2-3 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mảnh lá. Tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trƣờng M1-6 có chứa đƣờng mannose ở các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.9. Số mảnh lá còn lại đặt trực tiếp lên môi trƣờng M1-6 có chứa đƣờng mannose ở các nồng độ khác nhau.
Bảng 2.10: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
STT Môi trƣờng Thành phần
1 M1 MS, 8g/l phyto-agar, 30g/l sucrose
2 M2 MS, 8g/l phyto-agar, 20g/l sucrose, 5g/l mannose
3 M3 MS, 8g/l phyto-agar, 10g/l sucrose, 10g/l mannose
4 M4 MS, 8g/l phyto-agar, 5g/l sucrose, 15g/l mannose
Theo dõi sự phát triển của các mẫu trên môi trƣờng chọn lọc sau 4 tuần, đánh giá hình thái và xử lý kết quả.
2.2.4. Chuyển gen vào thuốc lá thông qua Agrobacterium tumefaciens
2.2.4.1. Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium
Chủng khuẩn đƣợc lấy từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc có bổ sung các kháng sinh chọn lọc ( Cefotaxime 25 mg/l, kanamycin 50 mg/l đối với chủng A.tumefaciens mang vector chuyển gen; Rifamycine 50 mg/l, streptomycine 100 mg/l, spectinomycine 100 mg/l đối với chủng vi khuẩn
A.tumefaciens mang vecter chuyển gen chứa cấu trúc TMV_RNAi) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ.
Nhặt một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi trƣờng LB đặc. Bình nuôi lỏng đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 28˚C nuôi qua đêm. Lấy 0,5 ml dịch huyền phù chuyển sang 50 ml LB lỏng (không kháng sinh) nuôi phục hồi khuẩn trong vòng 4 giờ. Ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ở 4˚C và hòa tan trong dung dịch IM (MS, pH 5,8) lỏng. Sử dụng