Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
1. Biến nạp vector pK7GWIWG2(II) vào tế bào khả biến E.coli DB3.1 bằng shock nhiệt 42oC trong 1 phút. Cấy trải khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa Str 40 mg/l, spec 100 mg/l. Nuôi qua đêm ở 37oC.
2. Lấy 1 khuẩn lạc, nuôi lỏng qua đêm ở 37oC. Dịch khuẩn đƣợc thu và tách chiết plasmid theo phƣơng pháp Sol [40].
3. Plasmid thu đƣợc đƣợc lần lƣợt xử lý các enzyme cắt giới hạn Sph I, phản ứng cắt đầu 3’ tạo đầu bằng bởi T4 DNA Polymerase, cuối cùng đƣợc xử lý bởi RE Hind III.
Phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) bởi enzyme Sph I
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pK7GWIWG2(II) 10 2 10X Buffer B 3 3 Sph I (10u/ µl) 4 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 13 Tổng 30
- Mix nhẹ nhàng và ly tâm vài giây. - Ủ ở 37o
C trong 1-16 giờ.
- Sản phẩm đƣợc điện di trên gel agarose 1% sẽ xuất hiện 3 băng DNA ~ 6500 kb, ~ 5 kb và ~ 1500 Cắt lấy băng có kích thƣớc ~ 5 kb để tinh sạch bằng bộ kít Fermentas.
Thôi gel và tinh sạch sản phẩm thôi gel
- Cơ sở lý thuyết
- Trên cột thôi gel có màng chứa các phân tử có ái lực cao với DNA, khi cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA sẽ đƣợc cố định trên màng còn các thành phần khác sẽ đi qua màng và đƣợc loại bỏ. Khi bổ sung nƣớc vào màng, DNA
Quy trình
- Điện di sản phẩm PCR của gen quan tâm trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm.
- Bổ sung dung dịch Binding buffer theo tỷ lệ :Vmẫu:VBinding buffer = 1:1 ( 1mg mẫu tƣơng ứng với 1 µl); ủ 550C trong 10-15 phút, đảo nhẹ cho đến khi gel tan hết.
- Chuyển hỗn hợp sang cột Qiaquick spin, ly tâm hỗn hợp 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, bổ sung 500 µl Wash buffer (hoặc ethanol 700), ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch chảy qua cột, tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút.
- Bổ sung 30µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa màng lọc. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA.
Xử lý bởi T4 DNA Polymerase
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng bởi T4 DNA Polymerase
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 DNA (0,5 – 1 µg / µl) 35
2 Mul ti – CoreTM Buffer (10X) 5
3 dNTP (10 mM) 2 4 T4 DNA polymerase (100/ µl) 1 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 7 Tổng 50 - Ủ 37o C trong 2 giờ.
- Ngừng phản ứng băng cách bổ sung 2 µl của 0,5M EDTA. - Sản phẩm cắt đƣợc tinh sạch bằng cách:
- Li tâm 12.000 vòng/ phút trong 15 phút.
- Loại bỏ dịch thấm khô, bổ sung 1000 µl ethanol 70% ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch và để khô trong box.
- Hòa tan 30µl nƣớc deion khử trùng đã xử lý DEPC 0,01% Phản ứng cắt bởi enzyme Hind III
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme Hind III
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 DNA (0,5 – 1 µg / µl) 30 2 Buffer R (10X) 4 3 Hind III (10 u/ µl) 2 4 Nƣớc khử ion, khử trùng 4 Tổng 40
- Mix nhẹ nhàng và ly tâm vài giây. - Ủ 37 ở 37o
C trong 1-16 giờ.
- Sản phẩm sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Phân đoạn có kích thƣớc khoảng 4700 bp đƣợc thu nhận và tinh sạch theo bộ kit Fermentas.