tumefaciens
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi TMV-M-CPi vào giống thuốc lá C9-1 và K326 thông qua Agrobacterium tumefaciens thông qua Agrobacterium tumefaciens
Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 và C9-1 [49]. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc cắt thành những mảnh có kích thƣớc 1 cm2 và đặt
lên môi trƣờng tái sinh GM 2 ngày trƣớc khi biến nạp sau đó đƣợc nuôi cộng sinh với dung dịch huyền phù của Agrobacterium trong 2 ngày và chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn. Giống thuốc lá C9-1 và K326, đƣợc đặt các mảnh lá trên môi trƣờng GM trƣớc biến nạp cho hiệu quả tái sinh cây thấp. Do vậy, việc cắt các mảnh lá C9-1 và K326 phải hình vuông kích thƣớc khoảng 0,5 cm2
đƣợc cắt ra từ cây in vitro và ngâm vào dung dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0,7-1) có lắc nhẹ trong 10 phút. Việc giảm kích thƣớc các mảnh lá xuống một nửa đồng thời lắc nhẹ trong dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thƣơng thực vật và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen.
Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20 ml dung dịch huyền phù vi khuẩn trong vòng 10 phút. Sau đó đặt vào bình chứa môi trƣờng cảm ứng GM trong 2 ngày. ( MS, 1mg/l BAP, 30 g/l mannose, 8 g/l agar, pH 5,8).
A B C
D E F
Hình 3.12. Hình ảnh qua các bƣớc nghiên cứu của thí nghiệm
A. Cảm ứng thuốc lá; B. Ngâm mảnh lá trong dịch khuẩn; C. Đồng nuôi cấy
Bảng 3.4. Kết quả của biến nạp cấu trúc RNAi TMV-M-CP vào thuốc lá. Lô thí
nghiệm
Mẫu Mẫu tạo chồi Chồi tái sinh Chổi ra rễ trên MT chọn lọc Số lƣợng Tỷ lệ(%) K326 2x36 72 162 131 80,86 C9-1 2x36 72 86 61 70,93 ĐC 2x4 16 4 4 100