Xba I và Hind III là hai enzyme giới hạn có các vị trí cắt trên vector pK7- M (Hình 3.8). Theo tính toán lý thuyết sản phẩm plasmid pK7M/TMV-CPi cắt bởi hai enzyme này thu đƣợc hai phân đoạn DNA có kích thƣớc nhƣ trình bày trong bảng 3.1, cả hai phân đoạn đều có kích thƣớc thấp hơn so với đối chứng âm là vector pK7M nguyên vẹn.
Hình 3.7. Bản đồ cấu trúc pK7M/TMV-CPi.
P35S, promoter 35S của Cauliflower mosaic virus; attB1 và attB2, các vị trí tái tổ hợp trong phản ứng LR. LB, left T-DNA border; RB, right T-DNA border; T35S, terminator 35S; PMI, gen kháng mannose; CmR, gen kháng Chloramphenicol. Vị trí các điểm cắt giới
hạn của enzyme Xba I và Hind III; CPi, đoạn gen CP của virus TMV.
Bảng 3.1. Các phân đoạn thu đƣợc theo tính toán lý thuyết khi cắt plasmid
pK7M/TMV-CPi và pK7M bằng enzyme Xba I và Hind III
(Đơn vị: bp)
Phân đoạn pK7M pK7M/TMV-CPi
1 8660 8050
Hình 3.8. Phân tích sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M/TMV-CPi bằng enzyme
Xba I và Hind III
M: Thang DNA chuẩn GeneRuler™1kb DNA Ladder Plus (Fermentas). Đƣờng chạy 1-2: Sản phẩm cắt plasmid từ dòng khuẩn lạc 1-2.
Đƣờng chạy 3: Sản phẩm cắt plasmid từ dòng khuẩn lạc mang vector pK7M– làm
đối chứng âm.
Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng enzyme hạn chế trên hình 3.8 cho thấy, dòng khuẩn lạc số 1 và 2 thu đƣợc các phân đoạn có kích thƣớc nhƣ dự tính. Điều này khẳng định hai dòng khuẩn lạc này đều chứa vector chuyển gen pK7M/TMV-CPi có cả hai vị trí tái tổ hợp chứa đoạn gen CPi chèn vào.
3.2.2. Kết quả chọn dòng bằng phản ứng PCR
Để kiểm tra đoạn gen CPi có đƣợc chèn vào vector chuyển gen đúng chiều ở các dòng khuẩn lạc này hay không. Phản ứng PCR với các cặp mồi: P35F2/TMV-Ri, T35R/TMV-Ri và TMV-Fi/TMV-Ri đƣợc tiến hành. Trong đó, mồi TMV-Fi và TMV-Ri nằm trên gen CPi, còn P35F2 và T35R nằm trên vector nên cặp mồi TMV-Fi/TMV-Ri sẽ kiểm tra sự có mặt của đoạn gen CPi trên vector, cặp mồi P35F2/TMV-Ri sẽ kiểm tra đoạn gen CPi có đƣợc gắn vào theo chiều sense hay không, còn cặp mồi T35R/TMV-Ri sẽ kiểm tra sự gắn theo chiều antisense (Hình 3.9). Do đó, theo tính toán sản phẩm PCR với cặp mồi TMV-Fi/TMV-Ri, P35F2/TMV-Ri và T35R/TMV-Ri sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng là 313, 490 và 445 bp. bp M 1 2 3 10000 7000 3000
Từ kết quả điện di trên (hình 3.10), chúng tôi nhận đƣợc dòng có kết quả PCR dƣơng tính với kích thƣớc đúng nhƣ mong đợi. Điều này chứng tỏ hai vị trí tái tổ hợp trên vector đều mang đoạn gen CPi chèn vào đúng chiều.
Hình 3.9. Các vị trí gắn của các cặp mồi trên pK7M/TMV-CPi
T35R : Mồi trên T35S; P35F2: Mồi trên P35S; TMV-Fi và TMV-Ri: Mồi xuôi và
ngƣợc trên đoạn gen CPi của TMV.
Hình 3.10. Phân tích sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang pK7M/TMV-CPi
A: Sử dụng cặp mồi TMV-Fi/TMV-Ri. B: Sử dụng cặp mồi P35S-F2/TMV-R2. C: Sử dụng cặp mồi T35S-R/TMV-Ri. M: Thang Marker chuẩn DNA 1kb.
Đƣờng chạy 1-3: Sản phẩm colony-PCR với DNA khuôn là các khuẩn lạc đƣợc đánh số theo thứ tự từ 1-3.
Đƣờng chạy (+): Sản phẩm colony-PCR làm đối chứng dƣơng với DNA khuôn là pENTMV-CPi, mồi TMV-Fi/TMV-Ri.
Đƣờng chạy (-): Sản phẩm colony-PCR làm đối chứng âm – là mẫu có chứa tất cả các thành phần của phản ứng ngoại trừ DNA khuôn.
Kết quả chọn dòng bằng phản ứng PCR và phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn đã thu đƣợc dòng khuẩn lạc dƣơng tính mang vector pK7M/TMV-CPiquan
bp M 1 2 3 (-) (+) A bp M 1 2 3 (-) 1 2 3 (-) B C T35R Fi Ri Fi Ri P35F2 750 500 250 750 500 500 250
giữa dƣới sự điều khiển của promoter 35S. Cấu trúc này sẽ tạo ra RNA CPi dạng kẹp tóc bổ sung chính nó có intron (intron-hairpin RNA, ihpRNA) sau khi đƣợc chuyển vào cây trồng. Khả năng cấu trúc ihpRNA bổ sung chính nó có hiệu quả làm bất hoạt gen ở thực vật đã đƣợc Smith et al .,(2000) chứng minh. Cấu trúc RNAi pK7M/TMV-CPinày tiếp tục đƣợc sử dụng để chuyển vào thuốc lá thông qua tế bào A.tumefaciens chủng CV58C1 pGV2260.
3.3. Nghiên cứu nồng độ đƣờng mannose thích hợp để chọn lọc mô/chồi/cây chuyển gen chuyển gen