Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN *** Nguyễn Trung Hiếu THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE KHÁNG VIRUS PHỔ RỘNG TRÊN CÂY THUỐC LÁ BẰNG CÔNG NGHỆ RNAi Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS Lê Văn Sơn TS Lê Hồng Điệp Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU  LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thuốc (Nicotiana tabacum L.) công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia giới Việc trồng sản xuất thuốc góp phần tạo công ăn việc làm thu nhập cho nhiều đối tượng lao động Ngoài ra, thuốc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Hơn nữa, với khả dễ tái sinh chấp nhận gene ngoại lai tốt, thuốc xem mô hình nhiều nghiên cứu sinh học như: nghiên cứu trình trao đổi chất thực vật; nghiên cứu vai trò, chức gene protein làm đối tượng để tiếp nhận gene ngoại lai Thuốc trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt bệnh virus gây nên Cho tới nay, 2000 loại virus gây hại thực vật phát nghiên cứu, có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới suất chất lượng trồng như: bệnh khảm chủ yếu Tobaco mosaic virus (TMV) Cucumber mosaic virus (CMV) gây nên; bệnh xoăn đọt vàng lá, héo virus héo đốm cà chua Tomato spotted wilt (TSWV) Tomato yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên Các virus gây thiệt hại nghiêm trọng tới suất trồng lên tới 95% chí 100%, làm ảnh hưởng lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia và có Việt Nam [3] Bệnh virus gây biện pháp diệt trừ mà phòng bệnh Các biện pháp truyền thống áp dụng để phòng ngừa, hạn chế lây lan virus như: loại bỏ bị bệnh phát hiện, trồng luân canh trồng, vệ sinh đồng ruộng không mang lại hiệu cao mà đòi hỏi nhiều thời gian, công sức ảnh hưởng xấu tới môi trường Việc tìm biện pháp để ngăn chặn phát triển lây lan virus thực vật vấn cấp bách Cùng với phát triển công nghệ sinh học, có nhiều ứng dụng sinh học phân tử chọn tạo giống trồng kháng virus, đó, công nghệ RNA interference (RNAi) giải pháp hữu hiệu thông qua việc sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh gene mã hóa protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để chuyển vào trồng tạo trồng chuyển gene kháng lại virus Đã có nhiều nghiên cứu thành công việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo giống trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh kiểm soát virus Y khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV (Rice yellow mottle virus) vào lúa [34]; kháng virus khảm dưa chuột (CMV) [11][26], virus khảm thuốc (TMV) [12] Tuy nhiên, hầu hết công trình công bố chuyển đơn gene gene kép để tạo trồng kháng hai loài virus định, trồng bị nhiễm loài virus khác Trên sở đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng thuốc công nghệ RNAi”  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn nhiều loài virus gây bệnh hại thuốc - Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang cấu trúc gene đa đoạn - Tạo thuốc mang cấu trúc gene chuyển  NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn nhiều loài virus - Sử dụng trình tự gene CP virus để thiết kế mồi đặc hiệu - Ghép nối đoạn gene - Xác định trình tự gene Thiết kế vector RNAi - Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP loại virus - Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II) kỹ thuật Gateway - Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A tumefaciens 3 Chuyển gene vào thuốc nhờ vi khuẩn A tumefaciens - Chuyển gene - Phân tích chuyển gene Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1 Lịch sử phát triển thuốc Thuốc (Nicotiana tabacum Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ châu Mỹ, nhiệt đới nhiệt đới, có hương vị đặc trưng người địa sử dụng nghi lễ tôn giáo dùng làm thuốc chữa bệnh [6] Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dương, ông phát người xứ vừa nhảy múa, vừa hút loại cuộn tròn gọi Tabaccos Các thông tin phân bố sớm thuốc vùng khác số tác giả đưa [13] Thuốc bắt đầu trồng châu Âu vào khoảng năm 1496 - 1498 nhà truyền đạo người Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ Andre Teve mang hạt từ Braxin trồng Tây Ban Nha Bồ Đào Nha năm 1556 [9] Thuốc du nhập vào trồng Trung Quốc Nhật Bản từ kỷ thứ XVI, Ấn Độ vào khoảng năm 1605 Từ đó, nước trở thành nhà sản xuất thuốc lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa thị trường thuốc giới Ở Việt Nam, thuốc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh Tông, phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc thức phát triển Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) số tỉnh miền bắc với giống ban đầu Virginia Bland Cash [10] 1.1.2 Phân loại nguồn gốc Thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín Angiosper, lớp mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35] Chi Nicotiana có khoảng 50-70 loài, đa số là dại, vào hì nh thái, màu sắc hoa người ta phân chia thành loại chính: Loài Nicotiana tabacum L Có hoa màu hồng, đỏ tươi hoặc đỏ thẫm là loài phổ biến nhất chiếm 90% diện tí ch thuốc lá thế giới, hầu hết các giống thuốc sợi vàng thuộc loại Loài Nicotiana rustica L Có hoa màu vàng, chiếm 10% diện tích, hầu hết giống thuốc sợi nâu sợi đen thuộc loại này, thường dùng để nhai, ngửi, làm thuốc xì gà Loài Nicotiana petunioide L Có hoa màu trắng , phớt hồng hay tí m , thường có vườn thực vật học phục vụ nguồn dự trữ gene cho lai , íttacó ̣ o sản xuất Loài Nicotiana polidieide L Có hoa màu trắng, thực tế cũng có í t sản sản xuất, có vườn thực vật học số nước Các giống thuốc sợi vàng có chất lượng cao Virginia gold, Virginia blond cash, Virginia bright… trồng nhiều ở Mỹ, Italia, Bungari, Trung Quốc, Ba Lan, Đức số nước khác ở Nam Mỹ Ở Việt Nam, giống thuốc sợi vàng trồng lâu năm Ba Vì Cao Bằng, giống Trung Hoa Bài trồng ở các tỉ nh phí a Bắc, giống C-83, K 51E, Coker 176, K326, C9-1, Burley Flue-Cured virginia trồng phổ biến ở Nam và Trung bộ Hiện nay, giống thuốc N tabacum L K326 C9-1 trồng phổ biến [3] 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị khoa học thuốc Thuốc loại công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm quan trọng bậc kinh tế giới.Việc trồng thuốc không trực tiếp tạo công ăn việc làm cho 33 triệu nông dân 120 quốc gia giới mà đóng vai trò quan trọng cho toàn công nghiệp thuốc [13] Các hãng sản xuất thuốc lá giới đều phải thừa nhận thuốc lá đem đến cho họ nguồn lợi nhuận khổng lồ Ở số nước Brazil, Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari… thuốc lá là một mặt hàng chiến lược, cho thu nhập lớn các các loại trồng khác Các số liệu thống kê đã ước tí nh khoảng ¼ sản lượng thuốc lá thế giới đã đưa vào kim ngạch xuất khẩu Ngoài ra, thuốc còn giải quyết nhiều vấn đề khác luân canh, tăng vụ, tận dụng đất đai, lao động và thu nhập cao một số trồng khác Ở Việt Nam, thuốc trồng phổ biến tỉnh thuộc Bắc Bộ Nam Bộ Đây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu kinh tế cao cho nông dân thu nhập cho quốc gia Theo thống kê Tổng công ty thuốc Việt Nam (Vinataba) [3] năm (2006-2008) tổng doanh thu thuốc đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nước 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất đạt 192,136 triệu USD, việc làm người lao động bảo đảm, đời sống bước nâng cao Ngoài giá trị to lớn kinh tế, thuốc có giá trị mặt khoa học, thuốc mô hình quan trọng nghiên cứu đối tượng thực vật như: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… dễ tái sinh chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trưởng chống chịu tốt [40] Trong y dược học, thuốc dược liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng chấy, rận, ghẻ, khô giã đắp vào vết thương để cầm máu [50] 1.2 MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƯỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1 Bệnh virus thuốc Hiện nay, suất chất lượng thuốc giảm sút nghiêm trọng bệnh virus hoành hành Trong đó, phổ biến nghiêm trọng bệnh khảm TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm loài virus TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1.1) Năm 2008, theo thống kê Nguyễn Văn Chín Nguyễn Ngọc Bích thuộc Tổng công ty thuốc Việt Nam, TMV CMV hai loài virus gây hại chủ yếu thuốc Việt Nam Bệnh khảm xuất sớm với tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) tăng dần tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng, từ 18,526,5% chí lên tới 100% xã Lâu Thượng, tỉnh Thái Nguyên, giống thuốc mẫn cảm với TMV chủ yếu K326 Thiệt hại virus gây thuốc lên đến hàng chục tỷ đồng [3] Đối với bệnh virus nói chung bệnh khảm nói riêng chưa có loại thuốc hoá học phòng trị cách hữu hiệu, biện pháp phòng bệnh tốt sử dụng hạt giống bệnh để trồng, không sử dụng hạt giống từ ruộng trước bị bệnh nói để làm giống cho vụ sau Thường xuyên vệ sinh, kiểm tra đồng ruộng để phát sớm phun thuốc diệt trừ loại côn trùng chích hút mang mầm bệnh như: bọ cánh tơ, bọ phấn trắng, rệp muội, loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan Bảng 1.1 Bệnh virus thường gặp thuốc [49] Tên bệnh Tên virus gây bệnh Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus (Virus khảm linh lăng) Quăn cúc tần Beet curly top virus (Virus gây bệnh quăn cúc tần) Ngọn bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (Virus gây biến dạng gân thuốc lá) Tobacco bushy top virus (Virus bụi thuốc lá) Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (Virus gây bệnh khảm dưa chuột) Vàng chết hoại rau diếp Lettuce necrotic yellows virus (virus dây bệnh vàng chết hoại rau diếp) Nicotiana glutinosa Còi cọc lạc Peanut stunt virus Bệnh hình hoa hồng Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus bây biến dạng gân thuốc lá) Tobacco mottle virus (virus gây bệnh đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc Tobacco etch virus (Virus gây bệnh kỵ axit thuốc lá) Xoăn vàng cà chua Tomato yellow leaf curl virus (Virus gây xoăn vàng cà chua) Khảm thuốc Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) Satellite Tobacco mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc vệ tinh) Hoại tử thuốc Tobacco necrosis virus (Virus gây hoại tử thuốc lá) Bung hạt thuốc Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) Sọc thuốc Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân thuốc Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua) Viền gân Potato virus Y (Virus Y khoai tây) U vết thương Wound tumor virus (Virus gây bệnh khối u vết thương) 1.2.2 Sơ lược TMV, CMV, TYLCV, TSVV gây bệnh thuốc 1.2.2.1 Virus khảm thuốc (Tobacco mosaic virus - TMV) Virus khảm thuốc TMV virus gây bệnh khảm phổ biến thực vật thuộc loài Tobamovirus mô tả sớm Mayer (1886) [30], Iwanowski (1892) [25], Allard (1914) [14] Stanley (1935) [43] Virus khảm thuốc có phổ ký chủ rộng, gây bệnh 120 loại thực vật khác nhau, nhiều thuốc TMV lây truyền theo cách thức tiếp xúc giới thâm nhập vào tế bào qua vết thương, khí khổng qua rễ [7] Biểu bệnh khảm non chuyển sang màu vàng nhạt, nhỏ lại, bề mặt xuất vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm chỗ nhạt Bên cạnh đó, có biểu khác phiến nhăn, mặt không phẳng mà chuyển sang lồi lõm gân bị kìm hãm sinh trưởng, thịt phát triển bình thường Dạng tiềm ẩn bệnh mức độ khác nhau, bao gồm [5]: - Dạng tiềm ẩn toàn phần: hoàn toàn biểu triệu trứng bệnh - Dạng tiềm ẩn cục bộ: triệu trứng bệnh xuất phần non, không rõ ràng - Dạng tiềm ẩn tạm thời: xuất giai đoạn bệnh, thường giai đoạn sau - Tiềm ẩn vĩnh viễn: bệnh không biểu triệu chứng suốt thời gian phát triển Giải thích cho tượng tiềm ẩn bệnh thời gian ủ bệnh virus TMV tương đối dài, bị nhiễm bệnh giai đoạn trưởng thành, TMV không kịp biểu triệu trứng Tuy nhiên, suất chất lượng sản phẩm sau thu hoạch bị ảnh hưởng nghiêm trọng Ngoài ra, điều kiện nhiệt độ cao (> 30 oC) làm triệu chứng bệnh Hình 1.1 Bệnh khảm thuốc virus TMV gây (Nguồn: internet) Nghiên cứu cấp độ phân tử, vật liệu di truyền TMV sợi đơn RNA đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb chứa khung đọc mở (ORF) Đầu 5’ RNA có gắn với 7-methyl guanosine Những khung đọc mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa protein có trọng lượng phân tử 126 kDa 183 kDa (Hình 1.2) [20] RNA đơn dương, có chiều dài khoảng 6,4 Kb chứa khung đọc mở (ORF) Đầu 5’ RNA có gắn với 7-methyl guanosine Những khung đọc mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa protein có trọng lượng phân tử 126kDa 183kDa [18] 6,395 nt RdRp CP Helicase MP Hình 1.2.1.2 Sơ đồ trúctrúc genome của TMVTMV Hình Sơ cấu đồ cấu genome RdRp - replicase; replicase; CP CP protein proteinvỏ; vỏ;helicase helicase- -enzyme enzymeliên liênquan quan trình duỗi tớitới trình duỗi xoắn; - protein vận chuyển Chiều chiều xoắn; MP -MP protein vận chuyển Chiều mũimũi tên tên thể thể hiệnhiện chiều dịchdịch mãmã 1.2.2.2 Virus Viruskhảm khảmtrên trêncây câydưa dưaleo leo(Cucumber (Cucumbermosaic mosaic virus, virus, CMV) CMV) Bệnh môđược tả lầnmô đầu 1916, Bệnh khảm khảm trêncây câydưa dưaleo leođược CMV tả tiên lần vào đầu năm tiên 1916, vào năm mộtmột bệnhbệnh virusvirus gây gây nên nên thực vật thựcđược vật phát đượchiện phátsớm hiệnnhất sớm Hiện nay, nay, có cónhiều nhiềudòng dòngCMV CMVđãđãđược đượcmô mô di truyền Hiện tả tả vớivới dữ liệuliệu di truyền chứachứa khoảng 60 khoảng khác 60 protein trình tựvirus genome hoàn chỉnh protein khác 15nhau trìnhvà tự15 genome hoànvirus chỉnh Virus thuộc loài Cucumovirrus, họ Bromovirus Virus khảm khảm dưa dưa leo leo (CMV) thuộc loài Cucumovirrus, họ Bromovirus biết biết đến virus có phổ gây bệnh rộng với 1000 loài thực đến virus có phổ gây bệnh rộng với 1000 loài thực vật [33] Phương thức lan truyền CMV thông qua vật trung gian loài rệp, loài ! 9! chủ yếu Myzus persicae Aphis gossypii [27] Hình 1.3 Cây thuốc bị bệnh khảm virus CMV gây (Nguồn: internet) Các chủng CMV chia thành hai nhóm I II dựa phân tích huyết [24, 46], lai acid nucleic giải trình tự gene [32] Giữa nhóm I II có mối quan hệ xa nhau, hệ gene chúng có 75% nucleotide tương đồng 10 Trong nhóm I lại chia thành phân nhóm IA IB với độ tương đồng chúng lên tới 92 – 95% [33, 37] Các chủng CMV phân nhóm IA nhóm II xuất gần toàn giới, chủng thuộc phân nhóm IB lại chủ yếu xuất Châu Á [12] Khi xem xét cấp độ tế bào phân tử, CMV có dạng hình cầu, đường kính khoảng 28 – 30 nm trọng lượng phân tử từ 5,0 – 6,7.106 Da Vật liệu di truyền CMV gồm sợi RNA thông tin (RNA1, RNA2, RNA3) có khung đọc mở (ORF) RNA1 gồm có 3357 nucleotide mã hoá cho protein 1a (khoảng 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình cộng (2006), Báo cáo tổng kết đề tài “Thu thập phân lập gene virus gây bệnh ba trồng thuộc họ Cà (Solanaceae) thuốc lá, khoai tây cà chua nhằm xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh virus tạo vật liệu di truyền cho tạo giống kháng bệnh virus” Báo cáo đề tài cấp viện giai đoạn 2005 – 2006 Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 11 Lê Trần Bình (2008), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo giống trồng chuyển gene kháng bệnh virus” Báo cáo đề tài cấp viện giai đoạn 2007 – 2008 Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008), Báo cáo theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc làm sở dự báo nghiên cứu biện pháp phòng trừ, Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc Việt Nam Chu Hoàng Hà (2010), “Nghiên cứu tạo trồng kháng bệnh virus gây công nghệ ức chế RNA (RNAi)” Báo cáo tổng kết đề tài Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trần Văn Hai (2009), Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ Trần Đình Long, Mai Thạch Hoành, Hoàng Tuyết Minh, Phùng Bá Tạo, Nguyễn Thị Trâm (1997), Chọn giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh chuyên khoa chuyên ngành Bảo vệ thực vật Trường ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), Giáo trình Cây công nghiệp NXB Nông nghiệp, Hà Nội Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật gieo trồng, chế biến thuốc lá, NXB Lao động Hà Nội 10 Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng, NXB Giáo dục 11 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008), “Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi” Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4A): 679-687 12 Phạm Thị Vân , Nguyễn Minh Hùng , Hà Viết Cường , Lê Văn Sơn , Lê Trần Bình Chu Hoàng Hà (2009), Tạo thuốc kháng virus TMV kỹ 12 thuật RNAi Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 Viện Nghiên cứu Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận Tr 32-40 Tiếng Anh 13 Akehurt B C (1981), “Tobacco”, Longman group Ltd, New York 764pp 14 Allard, H.A (1914), “The mosaic disease of tobacco”, US Dep Agric Bull 40 15 Avidov, H Z (1944), “Tobacco whitefliy in Israel”, Tel Aviv: Hassadeh (in Hebrew), pp 1-33 16 Baulcombe D (2004), “RNA silencing in plants”, Nature 431(7006): 356-63 17 Chicas and Macino (2001), “Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing”, EMBO (11): 992-6 18 Cho, J J., Mau, R F L., Mitchell, W C., Gonsalves, D., and Yudin, L S (1987), “Host list of plants susceptible to tomato spotted wilt virus (TSWV)” Res Ext Ser Univ Hawaii, Honolulu 19 Cohen, S N., Chang, A C Y & Hsu, L (1972), Proc Nat Acad Sci., U.S.A 69, 2110-2114 20 Collmer, Vogt, and Zaitlin (1983), “The H protein was comprised of a backbone of TMV”, Virology 126:429-448 21 Czosnek, H., Ber, R., Antignus, Y., Cohen, S., Navot, N., & Zamir, D (1988), Isolation of tomato yellow leaf curl virus, a geminivirus Phytopathology 78, 508-512 22 Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, and Sonnowald U (1996), “Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase possible hexose sensing in the secretory pathway” Plant Cell 8: 793-803 23 Hull R, Davies JW (1992), “Approaches to nonconventional control of plant virus diseases”, Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 13 24 Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M (1995), “Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber
mosaic cucumovirus on tomato”, EPPO Bulletin 25: 321- 327 25 Iwanowski, D (1892), “Concerning the mosaic disease of the tobacco plant”, St Petersb Acad.Imp Sci Bul 35: 67-70 26 Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M (2002), “The occurrence of CMV2 specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus derived doublestranded RNA is indicative of resistance to the virus”, MPMI 15(8): 8262833 27 Karen_Beth G Scholthof (2004), “Tobacco Mosaic Virus: A Model system for plant biology”, Annu Rev Phytopathol 42:13-34 28 Kormelink, R., Kitajima, E W., De Haan, P., Zuidema, D., Peters, D., and Goldbach, R (1991), “The nonstructural protein (NSs) encoded by the ambisense S RNA segment of tomato spotted wilt virus is associated with fibrous structures in infected plant cells”, Virology 181: 459-468 29 Lazarowitz, S G (1992), “Geminiviruses: Genome structure and gene function”, Crictic Rev Plant Sci 11: 327 - 349 30 Mayer, A (1886), “Concerning the mosaic disease of tobacco” Die Landwirtschaftliche Versuchsstationen 32:451-467 Translation published in English as Phytopathological Classics Number (1942) American Phytopathological Society Press St Paul, MN 31 Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., & Cozosnek, H (1991), “Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component” Virology 185, 131-161 32 Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E and Robbins T.W (1990), “Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions in Man”, Neuropsychologia, 28 (10), 10211034 14 33 Palukaitis, P., Roossinck, M J., Dietzgen, R G., and Francki, R i B (1992), “Cucumber mosaic virus”, Adv, Virus Res 41: 281-348 34 Pinto YM, Kok RA, Baulcombe D C (1999), “Resistance to rice yellow mottle virus (RYMV) in cultivated African rice varieties containing RYMV transgenes”, Nat Biotechnol 17: 702-707 35 Reed S M (1993), “Use of stomatal size to distinguish between haploid and dihaploid tobacco plants”, Tobbaco Sciences 37: 84-86 36 RN (1999), “Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation” Phil Trans R Soc Lond B 354: 659-664 37 Roossinck MJ (2002), “Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as deduced by phylogentic analyses”, J Virol 76: 3382- 3387 38 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T (1989), “Molecular Cloning: a Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 39 Samuel, G., J G Bald, and H A Pittman (1930), “Investigations on spotted witl of tomatoes” Australian Counc Sci Indus Res Bull No 44 64 pp 40 Shinichiro K, Atsuko M, Masamichi N, and Yutaka T (2007), “Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing” Plant cell report 1283-1288 41 Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson A O (1993), “Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants”, Plant Physiol 102: 7-12 42 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse P M (2000), “Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”, Nature 407: 319-20 43 Stanley, W.M (1935), “Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco mosaic virus”, Science 81:644-645 15 44 Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004), “RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants”, Virus Res 102(1): 85-96 45 Topping J F (1998), “Tobacco transformation” In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance Humana Press, Totowa, NJ 81: 365-485 46 Wahyuni, W.S., Dietzegen, R G., Hanada, K., and Francki, R.I.B (1992), “Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus”, Plant Pathol 41: 282- 297 47 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998), “Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA”, Proct Natl Acad Sci USA 95(23): 13959-13964 48 Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007), “Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus”, Transgenic Res 16(3): 385-98 Nguồn Internet 49 http://www.apsnets.org/online/common/names/tobacco.asp 50 http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/44070_Cay-bien-doi-genephat-trien-khong-ngung.a 16