đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương và các đặc tính nông sinh học của các con lai soma khoai tây sau dung hợp tế bào trần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ HỒNG THÁI ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY SAU DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ HỒNG THÁI ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY SAU DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI – 2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, kết số liệu nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị Tôi xin cam ñoan, giúp ñỡ việc thực luận văn ñã ñược cảm ơn, thông tin trích dẫn luận văn ñều ñã ñược rõ nguồn gốc Tác giả Phạm Thị Hồng Thái Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, ñã nhận ñược nhiều quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình thầy cô, lời ñộng viên giúp ñỡ bạn bè người thân Nhân dịp này, xin trân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Công nghệ sinh học ñã trực tiếp giảng dạy, trang bị cho kiến thức bổ ích suốt thời gian học tập rèn luyện trường ðặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch; NCS Hoàng Thị Giang người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ ñộng viên trình thực ñề tài hoàn thiện luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo khoa sau ñại học, cán phòng Công nghệ sinh học khoai tây-Viện sinh học nông nghiệp ñã giúp ñỡ tạo ñiều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực ñề tài Viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn ñến bạn ñồng nghiệp, người thân gia ñình ñã ñộng viên giúp ñỡ tạo ñiều kiện cho suốt thời gian học tập hoàn thành tốt luận văn này./ Hà Nội ngày 15 tháng năm 2013 Học viên Phạm Thị Hồng Thái Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình x MỞ ðẦU 1 ðặt vấn ñề Mục ñích, yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thông tin chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tầm quan trọng khoai tây 1.2 Tình hình sản xuất khoai tây giới nước 1.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây giới 1.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây Việt Nam 1.3 Những nghiên cứu nấm mốc sương Phytopthora infestans (Mont.) de Bary (P.I.) bệnh mốc sương khoai tây 11 1.3.1 Giới thiệu nấm Phytopthora infestans 11 1.3.2 Bệnh mốc sương khoai tây 16 1.3.3 Triệu chứng 19 1.3.4 Giải pháp khắc phục 19 1.4 Tính kháng bệnh mốc sương khoai tây 24 1.4.1 ðặc ñiểm xâm nhiễm nấm Phytopthora infestans 24 1.4.2 Cơ sở phân tử tính kháng bệnh mốc sương nấm Phytopthora infestans gây Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 26 iv 1.4.3 Các nghiên cứu gen kháng bệnh mốc sương khoai tây 28 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu, ñịa ñiểm thời gian nghiên cứu 33 2.1.1 ðối tượng 33 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 34 2.1.3 ðịa ñiểm 34 2.1.4 Thời gian 35 2.2 Nội dung nghiên cứu 35 2.3 Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô 36 2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm chậu vại 36 2.3.3 Phương pháp phân lập nấm Phytopthora infestans chuẩn bị dịch lây nhiễm 2.3.4 36 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo tách rời –detached – leaflet assay 38 2.3.5 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ -“Tuber slice test” 39 2.3.6 Phương pháp ñánh giá có mặt gen kháng bệnh mốc sương vật liệu maker phân tử 2.3.7 40 Các tiêu ñánh giá ñặc tính nông sinh học lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ 43 2.3.8 Phương pháp phân tích tiêu hóa sinh 43 2.4 Phương pháp phân tích xử lý số liệu 44 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Kết phân lập mẫu nấm mốc sương phục vụ lây nhiễm nhân tạo 45 3.2 Kết ñánh giá ñặc tính kháng/nhiễm lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ phương pháp lây nhiễm nhân tạo Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 47 v 3.2.1 Kết ñánh giá khả kháng /nhiễm bệnh mốc sương lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ phương pháp lây nhiễm nhân tạo ñơn tách rời 3.2.2 48 Kết ñánh giá khả kháng/ nhiễm bệnh mốc sương các lai soma dòng/ giống khoai tây bố mẹ phương pháp lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ (tuber slice test) 3.3 52 Kết ñánh giá có mặt gen kháng mốc sương RPi thị phân tử 55 3.3.1 Kết chiết tách ñiện di kiểm tra ADN tổng số 56 3.3.2 Kết chạy PCR với cặp mồi kháng bệnh mốc sương 57 3.4 Kết ñánh giá tính trạng nông sinh học lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ 3.4.1 60 Kết ñánh giá khả sinh trưởn, phát triển, khả cho chọn lọc, hoa lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ 3.4.2 Kết ñánh giá yếu tố hình thành suất, phẩm chất củ thu ñược dòng/giống khoai tây bố mẹ lai soma 3.4.3 64 Kết ñánh giá tiêu hình thái củ dòng/giống bố mẹ lai soma 3.4.4 60 68 Phân tích số tiêu hóa sinh ñánh giá chất lượng củ ñối tượng thí nghiệm 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 Kết luận 73 ðề nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC 78 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên ñầy ñủ MS Murashige Skoog SSR Simple sequence repeat PCR Polymerase Chain reaction NSLT Năng suất lý thuyết NSTT Năng suất thực thu M Ladder ADN Acid Deoxyribonucleic bp Base pair cs Cộng 10 PVY Potato virus Y 11 PVX Potato virus X 12 PA Polyacrylamid Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii DANH MỤC BẢNG STT 1.1 Tên bảng Trang Diện tích, suất sản lượng khoai tây khu vực giới năm 2011 1.2 Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam giai ñoạn 2006 – 2010 2.1 Các giống/dòng khoai tây trồng, dại ñược chọn bố mẹ 2.2 Các dòng lai soma dòng khoai tây dại giống 34 khoai tây trồng chọn tạo giống 2.3 Các cặp mồi ñược sử dụng thí nghiệm xác ñịnh có mặt gen kháng 3.1 ðặc ñiểm riêng biệt tiêu theo dõi 42 bào tử nấm Phytopthora infestans 3.2 55 Bảng tổng hợp có mặt gen kháng mốc sương lai soma dòng bố mẹ 3.6 53 Các lai soma cho mức kháng thí nghiệm ñánh giá lây nhiễm nhân tạo 3.5 49 Kết ñánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ 3.4 46 Kết ñánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai soma dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo ñơn tách rời 3.3 33 57 Kết ñánh giá khả sinh trưởng, phát triển, khả cho chọn lọc, hoa lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ 3.7 61 Năng suất yếu tố cấu thành suất củ dòng/giống khoai tây bố mẹ lai soma Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 65 viii 3.8 Kết ñánh giá tiêu hình thái củ lai soma dòng/giống khoai tây bố mẹ 3.9 68 Kết ñánh giá số tiêu hóa sinh dòng/giống nghiên cứu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 71 ix (Các tiêu ñánh giá phụ lục 5) Qua Bảng 3.8 cho thấy lai có ñặc ñiểm hình thái củ ña dạng khác biệt so với bố mẹ chúng Về ñặc ñiểm ñộ sâu mắt củ quan trọng, ñộ sâu mắt củ liên quan ñến trình chế biến sau này, dòng có mắt sâu làm cho việc chế biến công nghiệp gặp nhiều khó khăn trình sơ chế Qua quan sát cho thấy, hầu hết dòng khảo sát ñều có mắt ngủ nông (= - ñiểm) phù hợp với giống khoai tây trồng cho chế biến Màu sắc thịt củ thường liên quan ñến phẩm chất khoai tây chế biến chíp Nếu thịt củ có màu vàng ñậm sau chế biến qua xử lý nhiệt ñộ cao (chiên) có mầu tối không ñẹp mắt, thịt củ có màu vàng nhạt sau xử lý qua chế biến có màu sáng, vàng tươi ñẹp mắt Hình dạng củ yếu tố quan trọng ñể ñánh giá thẩm mĩ việc sơ chế chế biến công nghiệp sau Bằng quan sát trực quan thấy, dòng/giống thu ñược Hình 3.10 Hình ảnh ñặc ñiểm hình thái củ số tổ hợp lai: 1- củ lai tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat, 2- củ lai tổ hợp lai S pinnatisectumvà Delikat, 3- củ lai tổ hợp lai S tarnii Agave, 4- củ lai tổ hợp lai S pinnatisectum Atlantic Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 69 Các lai tổ hợp lai có khác hình dạng củ lai bố mẹ chúng Như lai tổ hợp lai S Bulbocastanum Delikat bố mẹ có hình dạng ovan ovan dài, lai có dòng giống bố mẹ có dạng ovan 2283/5; 2292/4, có lai có củ dạng hình dài 2281/10; 2295/1 Tương tự lai tổ hợp lai S tarnii Delikat, S tarnii Agave, S bulbocastanum Rasant; S tarnii Rasant củ có dạng ovan, ovan dài ñến dài ðồng thời củ chúng có hình dạng củ ñẹp, phù hợp với ăn tươi chế biến Bên cạnh ñó có dòng xảy biến dị phong phú hình dạng Nhiều lai có kiểu hình xuất biến dị lai 1/6; 3/9 tổ hợp lai trn3G + Rasant 851/2 tổ hợp lai trn3G + Delikat Hình 3.11 Hình ảnh ñặc ñiểm hình thái củ số tổ hợp lai có lai soma bị biến dị 3.4.4 Phân tích số tiêu hóa sinh ñánh giá chất lượng củ ñối tượng thí nghiệm Khi tiến hành nghiên cứu dòng khoai tây việc theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển hình thành suất, ñã tiến hành phân tích số tiêu sinh hóa nhằm ñánh giá phẩm chất củ dòng phục vụ công tác chọn tạo dòng tốt tính kháng bệnh mốc sương, suất chất lượng Sau phân tích số tiêu hóa sinh, kết thu ñược sau: Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 70 Bảng 3.9 Kết ñánh giá số tiêu hóa sinh dòng/giống nghiên cứu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Kí hiệu ðường khử (%) Tinh bột (%) Các dòng/giống chọn làm bố mẹ Atlantic 0,025 18,45 Agave 0,030 15,96 Delikat 0,026 16,76 Rasant 0,029 16,53 pnt2G 0,052 14,25 blb2G 0,069 15,17 trn3G 0,058 13,67 Con lai tổ hợp lai Trn3G + Agave 4/12 0,064 13,00 4/22 0,059 13,91 7/4 0,064 15,95 7/7 0,071 14,57 Con lai tổ hợp lai Trn3G + Rasant TR 1/6 0,072 13,14 TR 3/7 0,093 12,85 TR 3/9 0,079 15,15 Con lai tổ hợp lai blb2G + Delikat 2281/10 16,27 0,041 2283/5 0,038 17,05 2292/4 0,042 18,06 2295/1 0,046 16,62 Con lai tổ hợp lai pnt2G + Delikat 2195/2 0,048 14,86 2196/4 0,086 13,29 2235/1 0,042 13,50 Con lai tổ hợp lai pnt2G +Atlantic 245/6 0,072 16,78 248/1 0,081 20,53 Con lai tổ hợp lai pnt2G + Rasant 2044/1 0,073 18,10 Con lai tổ hợp lai trn3G + Delikat 838/11 0,067 17,63 851/2 13,8 0,041 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 71 Qua Bảng 3.9 ta nhận thấy Hàm lượng ñường khử: tiêu quan trọng ñể ñánh giá chất lượng giống khoai tây chế biến Chỉ tiêu thấp tốt chế biến miếng khoai tây không bị ñổi màu, thâm, không bị vụn chế biến lai soma (2281/10,2295/1, 2292/4 2283/5) tổ hợp lai dòng dại S bulbocastanum giống khoai tây trồng Delikat , lai soma (851/2, 2195/2, 2235/1) tổ hợp lai Delikat dòng dại S tarnii , S pinnatisectum ñều giữ ñược phẩm chất củ giống khoai tây trồng, hàm lượng ñường khử thấp so với dòng dại dòng lai soma khác Thấp dòng 2283/5 (0,038), dòng 2281/10 (0,041) dòng 851/2 (0,041), dòng 2292/4 (0,042), dòng 2295/1 (0,046), 2235/1 (0,042) Hàm lượng tinh bột: ñối với khoai tây chế biến hàm lượng tinh bột cao tốt Qua ñánh giá số dòng lai ñã có hàm lượng tinh bột cao bố/mẹ Trong ñó ñáng ý lai 248/1 tổ hợp S pinnatisectum Atlantic có hàm lượng tinh bột cao 20,53%, sau ñó tới lai 2044/1 tổ hợp lai S.pinnatisectum Delikat 18,10%; 2292/4 tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat 18,06%; 838/11 tổ hợp lai S.tarnii Delikat 17,63%; 2283/5 tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat 17,05% Qua phân tích số tiêu hóa sinh ta thấy dòng lai soma (2292/4 2283/5) tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat có hai tiêu hàm lượng ñường khử hàm lượng tinh bột phù hợp so với với tiêu giống khoai tây chế biến Như vậy, việc chuyển khả kháng bệnh, phẩm chất khoai tây bị thay ñổi sau dung hợp ðiều nói lên dung hợp mở khả tạo nhiều biến dị ñể chọn lọc ñược dòng lai soma khoai tây có ñặc tính ưu việt phù hợp với nhu cầu khác chọn tạo giống Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua thí nghiệm ñã tiến hành rút số kết luận sau: Có thể chuyển ñược ñặc tính kháng bệnh mốc sương từ dòng khoai tây dại sang giống khoai tây trồng qua phương pháp dung hợp tế bào trần Trong dòng khoai tây dại nghiên cứu, dòng dại S bulbocastanum dòng có khả chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương thành công vào giống khoai tây trồng Bằng phương pháp chọn lọc sau lây nhiễm nhân tạo ñơn tách rời lát cắt củ ñã chọn lọc ñược dòng lai soma tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat (2281/10; 2283/5; 2292/4; 2295/1) ñều mang ñặc tính kháng bệnh mốc sương nấm Phytophthorainfestans gây ra, lai soma tổ hợp pnt 2G + Delikat (2195/2; 2196/4; 2235/1) Gen Rpi-blb1 Rpi-blb3 có mặt loài khoai tây dại S bulbocastanum lai soma blb2G (2281/10; 2283/5; 2292/4; 2295/1), ñược phát nhờ phương pháp PCR với cặp mồi ñặc blb1 1/1’; blb3 ðã chọn ñược dòng lai soma 2283/5 2292/4 tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat, có sức sinh trưởng phát triển hình thành suất chất lượng, phẩm chất cao dòng khác Và dòng lai có hàm lượng tinh bột cao 18,06%; 17,05%, hàm lượng ñường khử thấp 0,046% 0,038% thích hợp làm khoai tây chế biến Hai dòng lai soma 2283/5 2292/4 tổ hợp lai S bulbocastanum Delikat dòng có triển vọng cả, giới thiệu ñể phát triển thành giống khoai tây chế biến vừa có ñặc tính nông sinh học tốt vừa kháng bệnh mốc sương cao Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 73 ðề nghị Tiếp tục nghiên cứu ñánh giá dòng vật liệu lai soma có triển vọng diện rộng (ñồng ruộng) ñặc tính nông sinh học khả kháng bệnh mốc sương Tiếp tục phát triển hai dòng lai soma 2283/5 2292/4 tổ hợp lai S bulbocastanumvà Delikat thành giống trồng phục vụ sản xuất Mở rộng phạm vi thu thập mẫu nấm mốc sương Phytopthora infestans phạm vi ñối tượng nghiên cứu Mở rộng phạm vi sử dụng thị phân tử nghiên cứu kiểm tra gen kháng, tiến tới việc ứng dụng phương pháp thị phân tử chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ðỗ Kim Chung (2003) Thị trường khoai tây việt nam NXB Văn hóa thông tin 2.Hồ Hữu An (2005) Cây có củ kỹ thuật thâm canh-cây khoai tây NXB Lao ñộng xã hội Mai Thạch Hoành (2003) Giống kỹ thuật thâm canh có củ Nhà xuất nông nghiệp, Tr 98-130 Ngô Thị Xuyên Hoàng Văn Thọ (2003) ảnh hưởng môi trường nuôi cấy nấm thuốc Metalaxyl ñến sinh trưởng, phát triển nấm Phytophthora infestans (Mont.) de Bary số giống cà chua, khoai tây Tạp chí KHKTNN Tập 1, số 3, tr 197-202 Ngô Thị Xuyên, Lê Hồng Vĩnh, Burger Hermansen (2005), Nghiên cứu ñặc ñiểm nấm Phytophthora infestans Việt Nam Nguyễn Quang Thạch (1993) Một số biện pháp khắc phục thoái hóa giống khoai tây (Solanum tuberosum.L) ðồng Bắc Bộ Luận văn Phó tiến sỹ Nông nghiệp Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn cộng (1993) Một số kết nghiên cứu trình già hoá củ giống khoai tây bảo quản Tạp chí nông nghiệp công nghệ thực phẩm NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Kim Thanh Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất củ giống khoai tây bệnh có kích thước nhỏ bắt nguồn từ nuôi cấy In virtro Luận văn Tiến sỹ khoa học Nông nghiệp 1998 Trường ðHNN I- Hà Nội PGS.TS Lê Lương Tề (2007) Giáo trình bệnh nông nghiệp 10 PGS.TS Tạ Thu Cúc (2007) Giáo trình rau, Tr 141-169 11 Trương Văn Hộ (1990), Những kết nghiên cứu tiến kỹ thuật, NXB Hà Nội 12 QCVN 01 – 59: 2011/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia khảo nghiệm giá trị canh tác sử dụng giống khoai tây 13 QCVN 01 – 69: 2011/BNNPTNT Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia khảo nghiệm tính khác biệt, tính ñồng tính ổn ñịnh giống khoai tây TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Abad, G.Z & J.A.Abad (1997) “Another look at the origin of late Blight of potato, tomato and pear Melon in the Andes of South American” Plant disease/Vol 81No.6, P.682-687 15 A J Haverkort & P C Struik & R G F Visser & E Jacobsen (2009) Applied Biotechnology to Combat Late Blight in Potato Caused by Phytophthora infestans Potato Research, 52: 249-264 16 Andrivon, D (1995) Biology, Ecology and epidemilogy of the potato late blight pathogen Phytophthora infestans in soil Phytopathology, Vol 85, P 10531056 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 75 17 Brian J Haas et al ( 2009) Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen P.infesstan Vol 461/ 17 september 2009/ doi: 10.138/nature08358 18 Didier Andrivon, Fabian Pilet, Josselin Montarry, Majida Hafidi, Roselyne Corbière, El Hassan Achbani, Roland Pellé, and Daniel Ellissèche (2007), Adaptation of Phytophthora infestans to Partial Resistance in Potato: Evidence from French and Moroccan Populations, Phytopathology, Vol 97, P 338-343 19.Erwin D C and O.K Ribeiro (1996) Phytophthora Diseases Wordwide The American Pathological Society APS Press st.nl p 346 -349 20 Fry W E., S B Goodwin, A T Dyer, J.M Matuszak, A Dreth, P.W Tooley, L.S Sujkowski, Y.J, Koh, B.A Cohen, L.J Spielman,K.L Dheal, D.A Inglis and K.P Sandlan (1993), Historical and recent migrations of Phytophthora infestans, chronology, pathways, implications, Plant disease, vol 77, P 653661 21.Hartman, G.L and Huang, Y.H (1995), Characterization of Phytophthora infestans isolates and development of late blight on tomato in Tawain, Plant disease, vol 79, P 849-852 22 Jonh E Bradshaw, Glen J Bryan, Alison K Lees, Karen Mclean, Ruth M SolomonBlackburn ( 2005) Mapping the R10 and R11 genes for resistance to late blight ( Phytophthora infestans ) present in the potato (Solanum tuberosum) R-gene differentials of Black Thoer Appl Genet 112:744-751 23 Kazuyuki Mori, Yu Sakamoto, Nobuhiro Mukojima, Seiji Tamiya, Takashi Nakao, Takashige Ishii, Kazuyoshi Hosaka (2011) Development of a multiplex PCR method for simultaneous detection of diagnostic DNA markers of five disease and pest resistance genes in potato Euphytica (2011) 180: 347-355 24 Kwang- Ryong Jo, Marjon Arens, Tok- Yong Kim, Maarten A Jongsma, Richard G.F Visser, Evert Jacobsen, Jack H Vossen (2011) Mapping of the S demissum late blight resistance gene R8 to a new locus on chromosome IX Theor Appl Genet (2011) 123: 1331- 1340 25 Leontine Colon, Bent J Nielsen and Ulrich Darsow (2004) Eucablight protocol Detached leaflet assay for foliage blight resistance 26 Leontine Colon, Bent J Nielsen and Ulrich Darsow (2004) Eucablight protocol Tuber slice test for foliage blight resistance 27 M Y Adillah Tan (2008) Genetic Mapping and Pyramiding of Resistance Genes in Potato ISBN 978-90-8504-977-7 28 M Y Aadillah Tan, Ronald C B Hutten, Carolina Celis, Tae- Ho Park, Rients E Niks, Richard G F Visser, and Herman J van Eck (2008) The Rpi-mcdl Locus from Solanummicrodontum Involved in Resistance to Phytophthorainfestans, Causing a Delay in Infection, Map on Potato Chromosome in a Cluster of NBS-LRR Genes The American Phytophthogical Society, MPMI Vol 21, No 7, 2008, pp 909-918 29 M Y Adillah Tan, Ronald C B Hutten, Richard G F Visser and Herman J van Eck( 2010) The effect of pyramiding Phytophthora infestans resistance genes RPi-mcdl and PRi-ber in potato Theor Appl Genet (2010) 121:117-125 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 76 30 Paul R J Birch1,2, Miles Armstrong2, Jorunn Bos3, Petra Boevink2, Eleanor M Gilroy2, Rosalind M Taylor2,4, Stephan Wawra5, Leighton Pritchard2, Lucio Conti4, Richard Ewan4, Stephen C Whisson2, Pieter van West5, Ari Sadanandom4 and Sophien Kamoun (2008) Towards understanding the virulence functions of RXLR effectors of the oonycete plant pathogen Phytophthora infestans Jourrnal of Experimental Botany, Vol 60, No.4, pp 1133-1140 31 Tae- Ho Park, Vivianne G.A.A Vleeshouwers, Ronald C.B Hutten, Herman J van Eck, Edwin van der Vosen, Evert Jacobsen and Richard G.F Visser (2005) High-resolution mapping and analysis of the resistance locus Rpi-abpt against Phytophthora infestans in potato Molecular Breeding (2005) 16:33-43 32 Tung Pham Xuan, Nguyen Tuyet Hau and Ho Ngoc Anh 2011 Evaluation of CIP Potato Germplasm and Selection of Late Blight Resistance Processing Varieties in Dalat Results from 2004-2010 Presentation at Potato Workshop of the Potato Breeder’s Network in South East Asia held by InternationalPotato Center (CIP), Baguio city, the Philippines, March 15-20, 2011 33 Vivianne G.A.A Vleeshouwers1, Hendrick Reitman1, Pavel Krenek1, Nicolas Champouret1, Carolyn Young2, Sang-Keun Oh2, Miqia Wang1 Klaas Bouwmeester3, Ben Vosman1 , Richard G F Visser1, Francine Govers3, Sophien 34 Nguồn internet: http://agris.fao.org/agrissearch/search/display.do?f=1989/TT/TT89001.xml;TT8800960 http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&m=4634 http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&m=4634 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/khoai-tay-co-nguon-goc-tu-peru-.399012.html http://vi.wikipedia.org/wiki/Khoai_t%C3%A2y http://vietbao.vn/index.php http://www.cipotato.org/potato/facts/growth.asp http://www.fao.org/docrep/010/i0200e/I0200E12.htm http://www.potato2008.org/en/aboutiyp/index.html http://www.potato2008.org/en/world/index.html http://www.vietlinh.vn/dbase/LVCNNShowContent.asp?ID=1491 http://www.vinanet.com.vn/tin-thi-truong-hang-hoa-vietnam.gpprint.139635.gpside.1.asmx www.kinhtenongthon.com.vn/Story/kinhte-thitruong/2008/1/9091.html Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 77 PHỤ LỤC Phụ lục Hóa chất nuôi cấy mô: Thành phần môi trường MS (Musashige Skoog 1962) - ða lượng: NH4NO3 33g KNO3 38g MgSO4.7H2O 10g KH2PO4 2,4g CaCl2.H2O 6,6g - Vi lượng: 1240mg H3PO3 MnSO4.4H2O 4460mg ZnSO4.4H2O 1720mg KI 166mg MoO4Na.2H2O 50mg CoCL2.6H2O 5mg CuSO4.5H2O 5mg - Vitamin: Glycine 400mg 100mg Acid nicotinic (B5) Pyridoxin (B6) 100mg 20mg Thiamin HCL (B1) - Sắt: FeSO4.7H2O 5,56g Na2EDTA 7,46g 100mg/l - Inositol: 30g/l - ðường : - Agar 6-6,2g/l Phụ lục 2: Hóa chất chiết tách DNA - Dung dịch I: NaCl 10,37g; CTAB (Cethrimethyl amonium bromind) 0,25g, tổng thể tích 100ml - Dung dịch II (CI): Hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) - Dung dịch TE: 1ml Tris-HCl 1M; 0,2ml EDTA 0,5M, tổng thể tích 100ml, PH=8 - Ethanol 90% 70% Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 78 Phụ lục Các bước chiết tách DNA Bước 1: Cân 0,13 – 0,15 gam tươi từ in vitro cho vào cối sứ sạch, bổ sung 500µl CTAB ñã ủ waterbath 60OC 10 phút Sau ñó dùng chày sứ nghiền nhanh, ñều ñến nhuyễn, ñồng bổ sung tiếp 500µl CTAB, cuối chuyển toàn mẫu sang tube 1,5ml Tube mẫu ñược giữ waterbath 60OC 10 phút Bước 2: Tiến hành ly tâm tube mẫu 12000 rpm phút, máy ly tâm lạnh khoảng 4OC Bước 3: Sau ñó hút 700 µl dịch phía chuyển sang tube bổ sung dung dịch CI theo tỷ lệ : 1, giữ 10 phút ñá lạnh Bước 4: Tiếp tục ñem ly tâm 12000 rpm 10 phút Bước : Sau ly tâm hút 500 µl dịch phía chuyển sang tube bổ sung dung dịch CI theo tỷ lệ : 1, giữ 10 phút ñá lạnh Bước 6: Ly tâm mẫu 12000rpm 10 phút Bước 7: Hút 300 µl dịch phía chuyển sang tube bổ sung dung dịch isopropanol theo tỷ lệ : ñể tủa DNA, giữ 30 phút tủ lạnh sâu 20OC Bước 8: Ly tâm tube 12000rpm 15 phút Bước 9: Hút bỏ nước phía rửa tủa DNA ethanol 70% (3 lần), sau ñó ñể khô tự nhiên 30 phút Bước 10: Sau khô bổ sung 50 µl TE ñể hòa tan tủa DNA, giữ tủ lạnh -20OC sử dụng lâu dài Phụ lục 4: Phản ứng PCR Bảng 1: Thành phần phản ứng PCR STT Tên hóa chất Thể tích PCR buffer 10x 2µl dNTP 2,5mM µl Forward primer 10ppmol/µl 1,0µl Reverse primer 10ppmol/µl 1,0µl Nước cất 10,5µl MgCl2 1,5µl Taq polymerase 5U/µl µl DNA tổng số 1,0µl Tổng 20µl Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 79 STT Phụ lục 5: Chỉ tiêu theo dõi phương pháp ñánh giá Giai ñoạn ðơn vị tính Phương pháp Chỉ tiêu Mức ñộ biểu ñánh giá ñiểm ñánh giá Tròn Ô van ngắn Sau thu Ô van Quan sát Dạng củ Ovan dài củ ñánh giá hoạch Dài Rất dài Kem nhạt Quan sát vỏ củ Vàng ñánh giá ðỏ ðỏ phần Màu vỏ củ Thu hoạch Xanh Xanh phần Nâu ñỏ Màu khác Trắng Kem Vàng nhạt Vàngtrung bình Cắt ñôi củ Khi thu Vàng ñậm Màu thịt củ quan sát thịt hoạch ðỏ củ ðỏ phần Xanh Xanh phần 10 Màu khác Rất nông Nông ðộ sâu mặt Quan sát mắt Thu hoạch Trung bình ngủ củ ñánh giá Sâu Rất sâu Củ to: ñường kính >50mm Số củ Củ trung bình Phân loại Thu hoạch % khối lượng ñường kính 30- ñếm số củ theo củ/khóm ñường kính 50mm Củ nhỏ ñường kính[...]... tài:“ðánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương và ñặc tính nông sinh học của các con lai soma khoai tây sau dung hợp tế bào trần Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 2 2 Mục ñích, yêu cầu 2.1 Mục ñích Sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo kết hợp với chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ñược khả năng chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương từ khoai tây dại sang khoai tây. .. sương của các con lai soma và các dòng/giống khoai tây bố mẹ qua lây nhiễm nhân tạo trên các lá ñơn tách rời và trên các lát cắt củ ðánh giá ñược sự có mặt của các gen kháng mốc sương của một số dòng con lai soma và các dòng/giống khoai tây bố mẹ bằng chỉ thị phân tử ðánh giá khả năng sinh trưởng phát triển, hình thành năng suất, chất lượng của các con lai soma và các dòng/giống khoai tây bố mẹ trong... phải tiến hành tiếp theo là việc ñánh giá khả năng chuyển ñặc tính kháng bệnh từ các dòng khoai tây dại cho khoai tây trồng cũng như các ñặc tính nông sinh học của các con lai soma thu ñược Trên cơ sở này sẽ giới thiệu ñược các vật liệu khởi ñầu quan trọng cho chương trình phát triển tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương và mang những ñặc tính nông sinh học (năng suất, phẩm chất) mong muốn với những... = 2x) còn các giống khoai tây trồng lại là thể tứ bội (2n =4x) và ở các chi, loài khác nhau nên việc lai tạo hữu tính nhằm chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương từ khoai tây dại sang khoai tây trồng là bất khả thi Trong bối cảnh này việc lựa chọn kỹ thuật dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng là cách tiếp cân sáng suốt, mới mẻ và khả thi Con ñường dung hợp protoplast là con ñường... dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng nhằm tạo ra các dòng khoai tây vừa phù hợp với yêu cầu chế biến vừa có khả năng kháng bệnh mốc sương làm vật liệu khởi ñầu cho việc phát triển tạo giống khoai tây chế biến kháng bệnh mốc sương Các nghiên cứu về dung hợp tế bào trần của Viện Sinh học nông nghiệp ñã ñạt ñược các kết quả có ý nghĩa, tạo ñược hàng loạt các dòng con lai soma Công việc bắt buộc... vật liệu lai lại (BC) với chính bố mẹ của chúng Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang ñặc tính kháng bệnh mốc sương rõ rệt cùng với các ñặc tính nông sinh học tốt của bố mẹ ðã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại ñể chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính: S Chacoense (Butenko và cs, 1982); S.niggrum (Binding và cs, 1982;... hiện các dòng khoai tây dại có ñặc tính kháng bệnh mốc sương ñã mở ra những triển vọng mới mẻ và khả thi cho công cuộc chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ñang có nhiều khó khăn Các nhà khoa học ñã có trong tay nguồn vật liệu kháng bệnh mốc sương hết sức Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 quý giá Thế nhưng, do các dòng khoai tây dại là các. .. qua dung hợp tế bào trần, ñồng thời ñánh giá các ñặc tính sinh trưởng, phát triển, năng suất, phẩm chất củ của các con lai soma nhằm chọn lọc ñược các dòng con lai có triển vọng phục vụ cho chương trình chọn tạo giống 2.2 Yêu cầu Phân lập và chuẩn bị nguồn mẫu bệnh mốc sương Phytopthora infestans tại Việt Nam nhằm phục vụ các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo ðánh giá ñược ñặc tính kháng mốc sương của các. .. ðại học Nông nghiệp Hà Nội Tại ñây, phương pháp dung hợp tế bào trần ñã và ñang ñược nghiên cứu áp dụng cho mục ñích chọn tạo giống khoai tây ñó là chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương từ dòng khoai tây dại sang giống khoai tây trồng Phương pháp chọn tạo giống này ñã thu ñược một số kết quả có triển vọng như sau: * Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới Hầu hết khoai. .. 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993) Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh virus từ bố mẹ ñã chọn lọc (2x) cũng ñược rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp ñược các ñặc tính kháng bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các ñặc tính này có ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ HỒNG THÁI ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG VÀ CÁC ðẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CỦA CÁC CON LAI SOMA KHOAI TÂY... giống khoai tây kháng bệnh mốc sương mang ñặc tính nông sinh học (năng suất, phẩm chất) mong muốn với lý ñã ñược giao thực ñề tài:“ðánh giá khả kháng bệnh mốc sương ñặc tính nông sinh học lai soma. .. việc lai tạo hữu tính nhằm chuyển ñặc tính kháng bệnh mốc sương từ khoai tây dại sang khoai tây trồng bất khả thi Trong bối cảnh việc lựa chọn kỹ thuật dung hợp tế bào trần khoai tây dại khoai tây