Tổng hợp enzyme cellulase

TỔNG HỢP ENZYME CELLULASELỜI MỞ ĐẦUSự phát triển nhanh chóng của công nghệ thực phẩm trong hai thập niên gần đây đòi hỏi sự hiểu biết toàn diện về khả năng phân tích các chất trong thực

TỔNG HỢP ENZYME CELLULASELỜI MỞ ĐẦU

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ thực phẩm trong hai thập niên gần đây đòi hỏi sự hiểu biết toàn diện về khả năng phân tích các chất trong thực phẩm và phương pháp sản xuất thực phẩm mà Enzyme là loại protein, Enzyme rất quan trọng với cơ thể con người, nếu không có enzyme thì mọi sự chuyển hóa trong cơ thể con người bị đình trệ và không thể sống được

Ngoài ra nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm,trong y học,trong bảo vệ môi trường Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận rất lớn cho nhiều nước.Trong tương lai,đây sẽ là một ngành công nghiệp được đầu tư phát triển rộng bởi những ứng dụng và tính tiện lợi của nó trong nhiều lĩnh vực và đời sống

Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò quan trọng trong

chuyển hóa chất hữu cơ có trong thiên nhiên, và có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm (rựơu, bia, ), bảo vệ môi trường

I Lịch sử, nguồn gốc, những nghiên cứu phát triển của enzyme cellulose:

1 Lịch sử nghiên cứu của enzyme:

Do enzyme học được coi như cột sống của hóa sinh học nên phần

lớn các nghiên cứu hóa sinh từ trước đến nay đều liên quan nhiều đến enzyme

Về sự phát triển của học thuyết enzyme, có thể chia thành 4 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: trước thế kỷ thứ XVII

- Giai đoạn 2: từ thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XIX

- Giai đoạn 3: từ giữa thế kỷ XIX đến 30 năm đầu của thế kỷ XX

- Giai đoạn 4: từ những năm 30 của thế kỷ XX đến nay

2 Nguồn gốc của enzyme cellulase:

- Được thu nhận từ các nguồn khác nhau:

+Động vật: dịch tiết dạ dày bò, các nhóm thân mềm…

+ Thực vật: trong hạt ngũ cốc nảy mầm như đại mạch, yến mạch, lúa mì mạch đen…

+Vi sinh vật: các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi, nấm men…

-Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các

chủng vi sinh vật thường sử dụng:

– Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus candidus… – Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli…

– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis…

3 Những nghiên cứu phát triển sản phẩm như:

Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sửdụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên Năm 1998, YU đã nuôi cấy T reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose và1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g Năm 2000, Sonia Couri khảosát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase

và protease từ A niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác nhaubằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầuthực vật Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuôi cấy A nigertrong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa0,2% CMC) phát hiện có hai vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lầnlượt là 83.000 và 50.000 Dalton

Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặctính của cellulase (typ CMCase) ở A niger VS-1 trên MT lên men bán rắn Năm

2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T reesei sinh tổng hợp enzym cellulase

trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinhtổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bãmía, vỏ cà phê Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

và đặc điểm cellulase của A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ cũng nghiên cứu thunhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T reesei bằng phương pháp lênmen bán rắn Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợpenzym cellulase từ T reesei và A niger trên MT lên men bán rắn Năm 2005, LêThị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase củamột số chủng nấm mốc

II Tổng quan hệ enzyme cellulase: (1)

Cellulase là phức hệ enzyme có tác dụng quan trọng trong việc thủy phân cellulose Đây là enzyme thuộc nhóm enzyme hydrolase thường chi thấy ở vi sinh vật

1 Cellulose: (1)

Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật; trong bông chiếm khoảng 90%, còn trong gỗ chiếm hơn 50% Hằng năm cellulose do thực vật tổng hợp khoảng 1011 tấn Sự tạo cellulase chủ yếu do thực vật còn phân hủy nó thì chủyếu do vi sinh vật

Cellulose có nhiều hơn tất cả hợp chất hữu cơ khác của cơ thể sống vì nó là nguyên liệu chính của tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi

Cellulase là chất được trùng hợp từ các đơn phân tử glucose, mạch thẳng được tạo bởi bằng liên kết glucoside

Cellulase là chất rắn, trắng, không mùi vị, không tan trong nước ngay cả khi đemđun nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường( rượu, ether,

benzen) Trong tế bào cây xanh, các vi sợi cellulose sắp xếp dưới dạng các lớp xen phủ,như thế tạo nên một cấu trúc rất dai và chắc Đôi khi thành tế bào còn được củng cố bằng một nguyên liệu gọi là lignin, chất này chèn vào khoảng không giữa các vi sợi cellulose.

Hình 1 Liên kết glucosidecellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì trong cơ thể người

không có enzyme phân hủy được cellulose Động vật nhai lại có thể tiêu hóa dễ dàng cellulose vì trong dạ dày chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzym cellulase có tác dụng thủy phân cellulose

Hình 2 Thành tế bào thực vật

Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật Đơn vị cấu tạo

cellulose gắn với nhau nhờ liên kết glucoside

Hình 4 Trật tự sắp xếp của Fibrils, Microfibrils and Cellulose in Cell Walls

Mỗi đơn vị cấu trúc nên cellulose là một anhydride d-glucose Mỗi gốc glucose chứa ba nhóm –OH ở nguyên tử carbon thứ 2, thứ 3 và thứ 6 (trong nhóm đó –OH đính trên C6 là nhóm rượu bậc 1, còn lại nhóm rượu bậc 2)

Gốc anhydride d-glucose có 6 cạnh piranose (nhờ 5 nguyên tử C và nguyên tử O) liên kết 1-4 glucoside

Phân tử cellulose chứa từ 1.400-10.000 gốc glucose không xoắn mà duỗi thẳng Phân tử lượng của cellulase thu được từ các nguồn gốc khác nhau xê dịch trong giới hạn khá rộng(từ 5.104-106 hoặc cao hơn)

Hình 4 Chuỗi phân tử cellulose

Dùng phương pháp phân tích tia rơghen, người ta xác định được phân tử cellulose

có các dạng sợi

Hình 5.Chuỗi phân tử cellulose

Các dạng sợi của cellulose lại gắn vào nhau nhờ liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen của cellulose.

Hình 7 Liên kết hydro giữa các phân tử cellulose tạo cấu trúc Micele

Hình 8 Các sợi cellulose liên kết liên kết với nhau tạo thành bó sợi, các bó sợi lại

liên kết với nhau tạo thành đại phân tử cellulose

1.1.Cơ chế thủy phân cellulose của enzyme cellulase: (2)

Endocellulase : xúc tác quá trình cắt liên kết trong cellulose, lignin và một cách ngẫu nhiên sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân tử nhỏ,

2 Cellulase : là hệ phức hydrolase bao gồm C1 đến Cx và , có vai trò là thủy phân

cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose

Hình 9 Mô hình phân tử cellulase

2.1.Tổng hợp cellulase:

2.2.Cơ chế tác dụng của cellulase :

Ở giai đoạn đầu dưới sự ảnh hưởng của enzyme C1 Những mảnh

polyanhydroglucose có kích thước lớn được tách ra khỏi cellulose không hòa tan ban đầu, sau đó dưới tác dụng của enzyme Cx mãnh vừa tạo thành sẽ bị tạo thành oligosaccarit cho đến cellobiose Như vậy C1 tác dụng trên cellulose nguyên thủy, cellulase C2 tác dụng trên cellulose đã biến hình nhưng không hòa tan, cellulase Cx tác dụng trên cellodextrin hòa tan hoặc các dẫn xuất hòa tan, còn cellobiase thì tác dụng lên các disaccaritcellobiose để tạo ra glucoso

Sơ đồ minh họa tổng quát cơ chế tác dụng của cellulase:

Cellulose cellulose phản ứngcellobiose glucose

Hình 10.Mô hình cellulase tác dụng lên cơ chất cellulosePhức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ một số loại nấm Ví dụ: nấm morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử, Polyporus versicolor tạo cellulase

Cellulase có bản chất là một protein được cấu tạo từ các đơn vị axit amin, các axit amin được nối với nhau bởi liên kết peptid-CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase(EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấmsợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose(CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân hủy cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân

2.4.Phân loại enzyme cellulase:

Dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc:

+Endoglucanase hoặc , phân cắt tạo ra các chuỗi oligosaccharide

+Endoglucanase, bao gồm (cellodextrinase) và (cellobiohydrolase)

+Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra các sản phẩm chính glucose tinh thể

+ hoặc Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose

2.5.Tính chất của enzyme cellulase: (3)

Enzyme cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như

cacboxymethyl cellulase(CMC) hoặc hydroxyethyl cellulase(HEC)

Cellulase cắt liên kết trong cellulose, lichenin và các

của ngũ cốc

Nhiệt độ thích hợp hoạt động ở 550C , bền ở 35-450C

Hoạt tính của cellulase bị pha hủy hoàn toàn ở 800C trong vòng 10-15 phút

Bền PH=5,5 và hoạt tính cao ở PH=6.

Ít ảnh hưởng từ các dung môi hữu cơ (trừ n-butanol)

Các ion kim loại và EDTA nồng độ 4-12Mm ảnh hưởng làm giảm hoạt tính của enzyme

2.6.Tổng hợp enzyme bằng phương pháp vi sinh vật:

Các phương pháp thu hồi enzyme cellulase từ vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là phương pháp lên men rắn(SSF), phương pháp lên men lỏng(SMF),

+phương pháp lên men bán lỏng SMF( lên men ngập nước)

+Lên men rắn SSF

Hình11.Côngnghệsản xuấtcellulase

III Phương pháp sản xuất enzyme Cellulase: (3)

Theo truyền thống, enzyme thương mại được sản xuất bằng lên men ngâpj nước(SMF), là phương pháp vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường nước giàu dinh dưỡng.tuy nhiên sẽ có sự tổn thất đáng kể trong quá trình cô dặc và tách chiết enzyme từ môi trường chủ yếu là nước Thay thế cho phương pháp truyền thống là phương pháp nuôi cấy trong môi trường rắn (SSF)

Khi so sánh với SMF trên lý thuyết, SSF đơn giản và ít tốn kém hơn nhưng lại không được sử dụng rộng rãi Trong khi ở các nước châu á, thực phẩm lên men từ các chất rắn như nước tương, miso được sản xuất cách đây hàng nghìn năm bằng

phương SSF thì chúng ta đã không được chú ý ở các nước phương tây do áp dụng các phương pháp SMF (theo Pandey, 2003).

Kể từ những năm 1990, SSF được quan tâm phát triển nhiều hơn, một phần do sự thừa nhận rằng nhiều vi sinh vật có thể sản xuất eyme hiệu quả hơn SSF

1 Phương pháp lên men bán lỏng SMF( lên men ngập nước): (4)

Lên men môi trường lỏng là sự nuôi cấy vi sinh vật trong nước có chứa các chất dinh dưỡng Khi vi sinh vật sử dụng các chất dinh dưỡng, chúng ta sẽ tạhs được các enzyme mong muốn Nguồn chất nền sử dụng dựa trên các nguyên vật liệu tái tạo như ngô, đường và đậu nành Trong suốt quá trình nuôi cấy, chất dinh dưỡng đã tiệt trùng được thêm vào để làm tăng quá trình lên men Các thông số như nhiệt độ, pH, oxi, CO2 được kiểm soát để tối ưu hóa qua trình lên men Để thu hoạch các enzyme từ môi trường lên men, người ta phải loại bỏ các sản phẩm không hòa tan, ví dụ như tế bào vi sinh vật, được thực hiện bằng cách ly tâm

Ưu điểm:

+Đo các thông số trong quá trình dễ dàng hơn so với quá trình lên men rắn

+Tế bào vi khuẩn và nấm men được phân bố đều khắp môi trường

+Có hàm lượng nước cao, là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn

Nhược điểm:

+Chi phí cao do môi trường dinh dưỡng đắt tiền

+Lò phản ứng làm chiếm diện tích, khó kiểm soát sự hoạt động của các vi sinh vật

+Nguy cơ ô nhiễm cao do lượng nước thải ra môi trường sau quá trình muôi

trường sau quá trình nuôi cấy

Hình 1 Quy trình sản

xuất enzyme

Sau đó, hỗn hợp môi trường được chuyển lên hệ thống lên men số 2(SF-102) để lên men lần thứ 3, tiếp tục cung cấp môi trường và cellulase, sau đó trộn lẫn(MB-102) và tiệt trùng lần thứ 2(HS-102) Sau cùng hỗn hợp môi trường được chuyển lên hệ thống lên men lỏng chính(LF-101) và lên men lần thứ 4, sử dungk bột giấy được chứa trong phễu(HP-101)

Quyets nito được thực hiện trong tất cả các ống, bình lắc, hệ thống lên men và máypha để đảm bảo môi trường yếm khí Tất cả khí thải từ các bình lắc và hệ thống lênmen thải ra ngoài không khí thông qua máy trộn(MX-101) và bộ lọc không

khí(AF-101) Còn các khí thải ra từ máy pha được thải trực tiếp ra không khí, vì máy pha chứa vi khuẩn

Các sản phẩm lên men SMF là các enzyme cellulase cùng với một số dư lượng và nước Một máy cô đặc(EV-101) được sử dụng để loại bỏ nước,máy sấy nhiệt bằng(FDR-101) tiếp tục loại bỏ nước trước khi tạo thành sản phẩm cuối cùng là cellulase Máy cô đặc và sấy nhiệt bằng hoạt động trong trình sản xuất cellulase bằng phương pháp SMF

2 Lên men rắn SSF:

Lên men rắn là quá trình lên men xảy ra trong môi trường không hoặc gần như không có nước tự do Quá trình lên men rắn sử dụng nguyên liệu tự nhiên như nguồn cung cấp carbon và năng lượng SSF cũng có thể sử dụng nguồn nguyên liệu như chất nền rắn, sử dụng nguồn nguyên liệu này thì cần bổ sung dung dịch dinh dưỡng cần thiết như một nguồn cung cấp carbon Chất nền rắn thì phải có đủ

độ ẩm Tùy thuộc vào bản chất của bề mặt chất nền, lượng nước hấp thu có thể gấpmột hoặc nhiều lần so với trọng lượng khô của nó Duy trì độ ẩm cùng với hoạt độ nước thích hợp là những yếu tố cần thiết cho quá trình SSF

Nói chung, chất nền rắn cung cấp môi trường tốt để vi khuẩn, nấm mốc và nấm men phát triển Nấm mốc được nghiên cứu nhiều nhất cho phương pháp SSF do khả năng tăng trưởng, phát triển không chỉ trên bề mặt của chất nền mà còn đâm sâu vào chất nền Một số cây trồng nông nghiệp như sắn, lua mạch, phế liệu công nghiệp như cám, bã, bánh dầu, vỏ cà phê là các chất nền thường được sử dụng cho phương pháp SSF

Một số yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến sự phát triển dựa trên phương pháp SSF: Ph môi trường nhiệt độ và thời gian nuôi cấy, kích thước, độ tuổi của vi khuẩn cấy, bản chất chất nền, loại vi sinh vật sử dụng,

Ưu điểm:

+Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được một khối lượng cơ chất 4-5 lần lên men lỏng

+Môi trường rắn dễ bảo quản

+Lượng nước ít nên tiêu hao cho việc khử trùng và xử lý sản phẩm ít

+Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm

+Đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật đơn giản

+Tuy mức độ sử dụng cơ chất thành sản phẩm thấp nhưng tính theo mật độ cơ chấtthì năng suất vẫn cao

Nhược điểm:

+Khí, sự truyền nhiệt bị hạn chế làm ảnh hưởng đến sự khuếch tán qua bề mặt Nếu không được kiểm soát, sự tích tụ nhiệt và giảm năng lượng oxy có sẵn có thể dẫn đến chấm dứt hoạt động của vi sinh vật hiếu khí mesophilic và hậu quả là ngừng sản xuất enzyme

+Tính đồng nhất khi cây, vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc phục khó do khối lượng lên men lớn

Hình 2 Quy trình sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men bán rắn

SSFPhần lớn phương pháp này tượng tự như SMF nhưng có 2 sự khác biệt do tính chất của chất nền rắn:

(1)Bột giấy và môi trường tăng trưởng được khử trùng trong một cái trống khử trùng(SD-101), khuấy mạch và trộn rồi chuyển đến hệ thống lên men số 2(SF-102)

và chuyển vào hệ thống lên men rắn chính(SMF-101) bằng cách sử dụng một băng