khảo sát histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

gian bảo quản Bảng 16 Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian bảo quản Bảng 25 Hàm lượng histamine có trong một số mẫu thủy sản mua tại các siêu thị tại thà

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT HISTAMINE TRONG SẢN PHẨM

THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO

ThS ĐỖ TẤN KHANG LÊ ANH VŨ

MSSV: 3082568 LỚP: CNSH TT34

Cần Thơ, Tháng 01/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành luận văn này ngoài những cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô, bạn bè và gia đình đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn Đặc biệt tôi xin hết lòng cảm ơn:

Th.S Đỗ Tấn Khang đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, cung cấp những tài liệu cần thiết và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài luận văn của mình trong thời gian quy định

Cám ơn các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Enzyme tại Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học: Anh Nguyễn Ngọc Phú và bạn Nguyễn Văn Tính đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học, và thực hiện tốt luận văn này Cuối lời, tôi xin chúc Quý thầy, cô, cha mẹ và các anh chị nhiều sức khỏe và thành đạt trên lĩnh vực mà mình yêu thích

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

Lê Anh Vũ

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các dung môi khác nhau trong phân tích hàm lượng histamine trong hải sản Kết quả cho thấy histamine trong các mẫu hải sản được ly trích hiệu quả nhất với perchloric acid 0.6M và trichloroacetic acid 6% Ngoài ra, nghiên cứu còn so sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình bezoyl trong phân tích hàm lượng amine trong hải sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kết quả thu được cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình này trong định lượng histamine trên mẫu cá ngừ Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản (0 o

C, 4 o C) đến sự gia tăng hàm lượng histamine và mật số vi khuẩn trong cá ngừ cũng được nghiên cứu Cá ngừ bảo quản ở 4 o C cho thấy hàm lượng histamine sinh ra cao hơn so với khi được quản ở 0 o C Các mẫu bảo quản ở 0 o C có hàm lượng histamine khá thấp (49.1 mg/kg sau 11 ngày bảo quản), trong khi đó khi được bảo quản ở 4 o C, các mẫu

có chứa hàm lượng cao histamine (161.29 mg/kg sau 7 ngày bảo quản) Sự tăng mật

số vi khuẩn theo thời gian bảo quản cũng đã được ghi nhận ở các mẫu thí nghiệm Mật

số vi khuẩn tăng từ 4.54 log 10 cfu/g đến 5.88 log 10 cfu/g trong các mẫu bảo quản ở

0 o C, trong khi đối với các mẫu bảo quản ở 4 o C, mức tăng này khá đáng kể với mật số

vi khuẩn tăng từ 4.54 log 10 cfu/g đến 8.88 log 10 cfu/g Bên cạnh đó, hàm lượng histamine trong một số sản phẩm hải sản cũng được báo cáo trong nghiên cứu này

Từ khóa : HPLC, histamine, hải sản, trichloroacetic acid, perchloric acid, nhiệt

độ bảo quản

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về biogenic amine và histamine 3

2.1.1 Biogenic amine 3

2.1.2 Histamine và ngộ độc histamine 4

2.1.3 Sự hình thành biogenic amine 5

2.1.4 Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản 5

2.1.5 Các vi khuẩn sinh histamine 6

2.1.6 Ảnh hưởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic amine khác 7

2.1.7 Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lượng thủy sản 10

2.1.8 Giới hạn cho phép của histamine trong thủy sản 11

2.1.9 Phương pháp xác định histamine trong thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 12

2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

2.2.1 Giới thiệu 14

2.2.2 Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 15

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.1.2 Hóa chất 16

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 16

3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Tối ưu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản 16

3.2.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản 19

3.2.3 Sự phát triển của hàm lượng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản 20

3.2.4 Xác định hàm lượng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản 21

3.2.5 Phương pháp xử lý thống kê 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Tối ưu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản 22

4.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản 23

4.3 Sự phát triển của hàm lượng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản 26

4.4 Xác định hàm lượng histamine trong một số sản phẩm thủy sản 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

Bảng 7 Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định

lượng bởi quy trình dansyl

Phụ lục

Bảng 8 Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định

lượng bởi quy trình benzoyl

Phụ lục

Bảng 9 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 1)

Phụ lục

Bảng 10 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 2)

Phụ lục

Bảng 11 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 3)

Phụ lục

Bảng 12 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 4)

Phụ lục

Bảng 13 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 5)

Phụ lục

Bảng 14 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong

phân tích hàm lượng histamine (mẫu 6)

Phụ lục

Bảng 15 Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 4oC theo thời Phụ lục

gian bảo quản

Bảng 16 Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời

gian bảo quản

Bảng 25 Hàm lượng histamine có trong một số mẫu thủy sản mua tại các

siêu thị tại thành phố Cần Thơ

Phụ lục

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase

trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản

3

Hình 3 Các con đường chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine 9 Hình 4 Giá trị trung bình hàm lượng histamine thu được khi ly trích bằng

các dung môi khác nhau

Hình 7 Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở

4oC theo thời gian bảo quản

27

Hình 8 Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở

0oC theo thời gian bảo quản

27

Hình 9 Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC

theo thời gian bảo quản

29

Hình 10 Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC

theo thời gian bảo quản

29

Hình 11 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình dansyl) Phụ lục Hình 12 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình benzoyl) Phụ lục

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical Chemists

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points

HMT Histamine-N-methyltransferase

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay ngộ độc histamine đang là một trong những mối nguy phổ biến nhất đối với sức khỏe của người tiêu dùng Ngộ độc histamine xảy ra sau khi ăn phải một số hải sản có chứa hàm lượng cao histamine và có thể là một số biogenic amine khác Các loài cá có liên quan bao gồm cá thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá khác thuộc họ Scombroidiae Các loài cá này có chứa hàm lượng cao histidine tự do trong mô của chúng Và khi điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (ví dụ khi cá được bảo quản trong nhiệt độ không thích hợp), enzyme decarboxylase do vi khuẩn sinh ra

sẽ chuyển hóa histidine thành histamine Một vài biogenic amine khác sinh ra trong quá trình phát triển của vi khuẩn có thể làm tăng độc tính của histamine Các triệu chứng ngộ độc có thể khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng histamine và sự nhạy cảm của mỗi người đối với histamine Tại một số nơi trên thế giới, ngộ độc histamine chiếm tỷ lệ lớn nhất trong các trường hợp ngộ độc liên quan đến cá (FAO/WHO, 2012) Tại Việt Nam, ngộ độc histamine thường xảy ra và các loài cá thường liên quan đến các trường hợp này là cá ngừ, cá thu (Bộ Thủy Sản, 2003)

Sau khi đánh bắt, cá tươi có hàm lượng histamine rất thấp nhưng hàm lượng này tăng lên cùng với sự phân hủy của cá Do đó, histamine cũng đã được sử dụng làm chất chỉ thị hóa học để đánh giá chất lượng của cá Cơ quan FDA đã thiết lập tiêu chuẩn cho hàm lượng histamine trong cá ăn được là 50 mg/kg (FDA, 2005) và các loại

cá có hàm lượng histamine cao hơn quy định này sẽ bị cấm bán cho người tiêu dùng

Để cung cấp cơ sở cho thực hành phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP) trong cá và các sản phẩm từ cá một phương pháp nhanh chóng, chính xác,

độ tin cậy cao để xác định hàm lượng histamine là cần thiết

Nhiều phương pháp định lượng histamine đã được phát triển Phương pháp chính thức của AOAC (AOAC, 1995) sử dụng quang phổ để định lượng histamine có ưu điểm là nhạy, tính lặp lại cao nhưng phức tạp và tốn thời gian Bên cạnh đó, nhiều phương pháp sắc ký cũng đã được áp dụng để phân tách và định lượng histamine trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng, và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Histamine có tầm quan trọng cao trong công nghiệp thực phẩm Những năm gần đây xuất hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào histamine do tiềm năng ứng dụng to lớn của amine này trong đánh giá chất lượng hải sản và các sản phẩm làm từ hải sản Ngoài ra, hàm lượng cao histamine trong hải sản cũng là một mối nguy đối với sức khỏe người tiêu dùng

Vì tầm quan trọng của histamine, nhằm mục đích nghiên cứu quy trình định

lượng histamine nhanh chóng, chính xác trong thực phẩm nên đề tài “Khảo sát histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Tối ưu hóa quy trình ly trích và định lượng histamine bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Khảo sát sự gia tăng hàm lượng histamine trong sản phẩm thủy sản theo thời gian

và nhiệt độ bảo quản

Định lượng histamine trong một số sản phẩm thủy sản phổ biến trên thị trường,

từ đó so sánh với tiêu chuẩn cho phép

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về biogenic amine và histamine

2.1.1 Biogenic amine

Biogenic amine là những hợp chất hữu cơ có một hoặc nhiều nhóm amine trong phân tử và có trọng lượng phân tử nhỏ (Hình 1) Các hợp chất này hiện diện trong nhiều loại thực phẩm, bao gồm cá và các sản phẩm làm từ cá Dựa vào cấu trúc hóa học, các biogenic amine có thể được chia thành 3 nhóm: aromatic amine (histamine, tyramine, serotonin, β-phenylalanyl, và tryptamine), aliphatic amine (putrescine và cadaverin), hoặc aliphatic polyamine (agmatine, spermidine, và spermine) (Smith, 1980)

Hình 1 Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase

trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản

(Nguồn: Nollet và Toldra, 2011)

Quá trình trao đổi chất ở động vật, thực vật và vi sinh vật tạo thành một trong các chất trên (putrescine, spermidine, cadaverine và agmatine và spermine) một cách tự nhiên Một vài trong số các amine này đóng vai trò quan trọng đối với sinh lý người và

động vật Chúng cần thiết cho sự phát triển tế bào và có vai trò quan trọng trong điều hòa tổng hợp nucleic acid và protein (Barzdoc và cs, 1995) Ngoài ra, biogenic amine cũng được sinh ra từ sự khử nhóm carboxyl của các amino acid tự do (Smith, 1980; Halasz et al., 1994; Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996) Các biogenic amine quan trọng vì hai lý do Thứ nhất, việc tiêu thụ thực phẩm chứa nhiều biogenic amine có thể nguy hiểm cho sức khỏe (Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996; Lehane và Olley, 2000) Thứ hai, chúng có thể dùng làm chất chỉ thị để đánh giá chất lượng thủy sản (Mietz và Karmas, 1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1989)

2.1.2 Histamine và ngộ độc histamine

Histamine là ―một amine được tạo thành trong quá trình chuyển hóa amino acid histidine dưới sự xúc tác của các enzyme thuộc nhóm decarboxylation enzyme; một chất kích thích mạnh mẽ cho sự tiết dịch vị, chất gây giãn mạch máu và đồng thời cũng là chất dẫn truyền của các dây thần kinh trung tâm‖ (Pubchem, 2012) Histamine

có công thức hóa học là C5H11Cl2N3 (Hình 1) Phân tử này có danh pháp theo IUPAC

là 2-(3H-imidazol-4-yl)ethanamine dihydrochloride và có trọng lượng phân tử là 111.14506 g/mol (Pubchem, 2012)

Hình 2 Cấu trúc hóa học của histamine

(Nguồn: Pubchem, 2012)

Ngộ độc histamine (histamine poisoning) thường được biết đến như ngộ độc scrombroid (scrombroid poisoning) do các triệu chứng ngộ độc xảy ra là kết quả của việc ăn phải các loài cá bị ôi, ươn thuộc họ Scombridae và Scombresocidae như cá thu,

cá dũa (mahi mahi), cá bluefish, cá ngừ, cá skipjack, cá thu đao (saury), cá nục và một

số loài cá khác Ngộ độc histamine thường được phát hiện trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm liên quan đến các biogenic amine (Halasz et al., 1994) Tuy nhiên, các

biogenic amine khác như putrescine và cadaverine cũng có thể gây ngộ độc, thậm chí ngay cả khi không có sự hiện diện của histamine (FDA, 2001) Các enzyme histidine decarboxylase và histaminase là những enzyme được biết đến nhiều nhất trong vai trò chuyển hóa histidine thành histamine (Taylor, 1986; Middlebrooks et al 1988; Flick et al., 2001)

2.1.3 Sự hình thành biogenic amine

Sự hình thành các biogenic amine có thể xảy ra theo hai cách: bằng quá trình decarboxylation nội sinh hoặc quá trình decarboxylation ngoại sinh Quá trình decarboxylation nội sinh bao gồm sự hình thành các biogenic amine bởi các enzyme decarboxylase có trong tế bào của các loài cá và các loài sinh vật biển khác, trong khi quá trình decarboxylation ngoại sinh diễn ra dưới sự hoạt động của các vi sinh vật có khả năng tạo ra các enzyme decarboxylase ngoại bào Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp histamine và các biogenic amine cũng có thể được thực hiện bởi động vật Ở trạng thái bình thường, tế bào động vật có chứa sẵn histamine, nhưng không có hoạt tính vì

ở dạng phức hợp protein Khi cơ thể động vật bị mẫn cảm hay bị kích thích, kháng nguyên ức chế yếu tố kháng protease; protease không bị kiềm chế nữa, tác động lên phức hợp protein và giải phóng histamine (Medina et al., 2003; Rodrigues-Caso et al., 2003)

2.1.4 Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản

Sự tích lũy histamine là kết quả của sự lạm dụng thời gian/ nhiệt độ trong quá trình chế biến và bảo quản dẫn đến hư hỏng thực phẩm Để giảm thiểu nguy cơ này, tổ chức FDA (2001) đề xuất các loại cá sau khi đánh bắt cần được bảo quản dưới 4oC Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá được bảo quản không được quá 6 giờ Mức nhiệt độ

4oC hoặc thấp hơn được xem như đủ để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật mang mầm bệnh

Các vi khuẩn sinh histamine có mặt khá phổ biến trong môi trường nước biển Chúng thường có mặt trong mang và ruột của các loài cá biển Theo Letker et al (1978), hàm lượng histamine trong cá ngừ bị ôi, ươn có thể cao đến 9190 ppm Hàm lượng histamine ở phần thân trên của cá thường cao hơn hàm lượng ở phần thân dưới

Do đó, phần thân trên của cá thường được lựa chọn để thực hiện phân tích hàm lượng histamine (FDA, 2004)

Sau khi chết, cơ chế bảo vệ các cơ quan của cá trước sự nhiểm khuẩn không còn hoạt động (Connell, 1990) Từ đó, vi khuẩn có thể xâm nhập qua da, qua các lỗ trên cơ thể, qua đường ruột hoặc thâm nhập qua các mạch máu ở mang và thận (Gram và Huss, 1996) Những vi khuẩn này có thể sinh histamine trong quá trình phát triển của chúng Do đó, việc moi ruột và loại bỏ mang cá trong quá trình sơ chế có thể làm giảm

số lượng vi khuẩn sinh histamine, và kết quả là tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao hơn (Craven et al., 2001) Tuy nhiên, những biện pháp này không thể loại bỏ hoàn

toàn sự phát triển của vi khuẩn

2.1.5 Các vi khuẩn sinh histamine

Enterobacter, Clostridium, Hafnia, Klebsiella, Lactobacillus, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas và Vibrio spp là những loài vi khuẩn có khả năng sinh các

enzyme decarboxylase, nhất là enzyme histidine decarboxylase (Taylor et al., 1979; Eitenmiller et al., 1982; Yoshinaga và Frank, 1982; Ababouch, 1991; Ben-Gigirey et al., 2000; Flick et al., 2001; Kim et al., 2001; Takahashi et al., 2003)

Vi khuẩn sinh histamine có thể phát triển trong một khoảng nhiệt độ rộng Nhiều nghiên cứu về khả năng sinh sinh histamine đã được thực hiện trên những điều kiện khác nhau và trên những loài cá khác nhau (Lerke, 1978; Eitenmiller et al., 1982; Kim

et al., 2002; Ozogul, 2004) Sự phát triển của vi khuẩn hay khả năng sinh ra histamine thường không xuất hiện ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn Nghiên cứu của Cravel et al (2001) cho rằng cá ngừ albacore được làm lạnh ngay lập tức ở nhiệt độ 10oC hoặc thấp hơn có hàm lượng histamine thấp Kết quả phân tích ngay sau khi cá được đưa lên bờ cho thấy hàm lượng histamine cao nhất ghi nhận được chỉ có 1.5 ppm, mặc dù các mẫu

cá này đã được làm lạnh từ 6 đến 8 ngày trong quá trình đánh bắt

Nghiên cứu về vi khuẩn sinh histamine trên các mẫu cá ngừ albacore tươi bởi

Kim et al (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn Hafnia alvi, Photobacterium

damselae, Acinetobacter lwoffi, Enterobacter cloacae từ mang; H alvei, E cloacae, E aerogenes và A lwoffi từ da; A lwoffi và 3 chủng chưa được định danh từ ruột Mật số

vi khuẩn cao nhất được tìm thấy trên mang dao động từ 6.9x104

đến 7.7x104 cfu/g

Trong số các vi khuẩn tìm thấy, P damselae được cho là vi khuẩn sinh histamine

nhiều nhất

Klausen và Huss (1987) cho rằng enzyme histidine decarboxylase được tạo ở nhiệt độ cao vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều Tuy nhiên, sự hình thành histamine có vẻ thường là kết quả của sự ôi thiu thực phẩm ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn hơn là sự ôi thiu ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài (FDA, 2001) Nhận định này được ủng hộ bởi nghiên cứu của Eitenmiller et al (1982) về hoạt động của enzyme decarboxylase và sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ vây vàng bị nhiễm vi

khuẩn Proteus morganii

2.1.6 Ảnh hưởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic amine khác

Các biogenic amine được xem như là các yếu tố kháng dinh dưỡng tự nhiên và là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Khả năng của chúng trong việc kích thích các phản ứng dược lý trong cơ thể con người là mối quan tâm hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng

2.1.6.1 Ảnh hưởng dược lý của các biogenic amine

Histamine có thể gây ra nhiều hiệu ứng dược lý như giải phóng adrenaline và noradrenaline; kích thích cử động cơ trơn của dạ con, ruột non và đường hô hấp; kích thích các neuron thần kinh vận động và cảm giác; điều khiển sự tiết dịch vị Putrescine

và cardaverine có thể gây hạ huyết áp, cứng hàm, giảm nhịp tim, gây liệt các chi và tăng tiềm lực độc tố của các amine khác Tryptamine có thể làm tăng huyết áp, trong khi tyramine có thể tác dụng như chất làm giảm sự co mạch, tăng lượng máu ra khỏi tim, gây chảy nước mắt, tăng hô hấp, tăng lượng đường huyết, giải phóng noradrenaline từ hệ thống thần kinh giao cảm, và có thể gây ra hội chứng đau nửa đầu (Shalaby, 1996)

Triệu chứng ngộ độc histamine có thể chia ra làm bốn nhóm chính: đường tiêu hóa, da, thần kinh và máu Các triệu chứng xuất hiện trên da bao gồm nổi mẩn ngứa, rát, nổi mề đay, phù da và viêm da tại chỗ (Purohit et al., 2002) Các triệu chứng đường tiêu hóa có thể gồm buồn nôn, ói mửa và tiêu chảy (Scoging, 1998) Đau đầu, cảm giác nóng ran, phồng rộp và nóng trong miệng là những triệu chứng ảnh hưởng của amine đến hệ thần kinh Các triệu chứng về máu bao gồm sự tăng huyết áp Sabroe

và Black (1998) cho rằng phát ban đỏ, tức ngực, cảm giác hồi hộp, lo lắng, hoa mắt, chóng mặt, khó thở cũng là những triệu chứng của ngộ độc histamine

2.1.6.2 Sự chuyển hóa histamine

Histamine có thể được tìm thấy ở nhiều bộ phận ở nhiều sinh vật, trong đó có cả con người Nhìn chung, hàm lượng histamine thường tập trung nhiều nhất ở tế bào nội tiết (ở biểu mô) và trong các dưỡng bào (Befus et al., 1999) Theo Klawasser et al (1994), tế bào bạch cầu và tế bào lympho ở người chứa khoảng 0.05 pg histamine trên mỗi tế bào Cũng có nhiều báo cáo cho rằng rất nhiều loại tế bào khác, bao gồm đại thực bào có chứa histamine Ngộ độc histamine và triệu chứng ngộ độc chỉ xuất hiện khi amine này xâm nhập vào đường máu Cơ thể người có hệ thống khử độc khá hiệu quả trong ruột non giúp chuyển hóa histamine bởi các vi khuẩn đường ruột (Shalaby, 1996)

Các enzyme monoamine oxidase (MAO), diamine oxidase (DAO) và N-methyltransferase (HMT) là một trong số những enzyme trong ruột non đã được xác định có thể chuyển hóa histamine thành các chất không độc (Taylor, 1986; Bodmer et al., 1999)

histamine-Hệ thống khử độc này hoạt động khá hiệu quả để xử lý một lượng histamine mà con người hấp thụ trong bữa ăn hằng ngày Tuy nhiên, hệ thống này là không đủ để xử

lý một lượng lớn histamine có trong các sản phẩm cá bị ôi, ươn

2.1.6.3 Sự tăng tiềm lực ngộ độc histamine

Các chất có khả năng ức chế/ngăn chặn sự chuyển hóa histamine được gọi là các chất tăng tiềm lực histamine Các chất này làm tăng ảnh hưởng ngộ độc histamine và

có thể đi vào cơ thể qua thức ăn Cơ chế tăng tiềm lực có thể giải thích qua một trong những cơ chế sau:

- Gây ức chế các enzyme chuyển hóa histamine (Sattler et al., 1988),

- Cạnh tranh vị trí bám với histamine trong cơ chế bám vào phức hợp histamine (Lehane và Olley, 2000),

mucine Kích thích sự giải phóng histamine nội bào từ các dưỡng bào (Veien et al., 2000)

Ảnh hưởng đến sức khỏe gây ra bởi ngộ độc histamine do ăn phải cá bị ôi, ươn nhìn chung nguy hiểm hơn những trường hợp bị ngộ độc do tiêm một lượng tương đương histamine vào cơ thể (FAO, 2003) Có những đề xuất cho rằng các amine khác

có thể đóng vai trò như chất làm tăng độc tính của histamine Theo Durand et al (1973) thì lượng độc tố gây ra bởi 150 ppb putrescine dihydrochloride hấp thụ cùng lúc với 300 ppb histamine dihydrochloride bằng với lượng độc tố gây ra bởi 1200 ppb putrescine dihydrochloride hay 300 ppb histamine dihydrochloride

Rượu và một số loại thuốc như d-Tubocurarine, pancuronium, alcuronium và aminoguanidine được biết đến như những chất làm tăng hoạt lực (Sattler et al., 1985; Sattler và Lorenz, 1990; Stratton et al., 1991) Các chất này ức chế enzyme diamine oxidase trong quá trình chuyển hóa histamine Các amine khác, ví dụ như spermine, spermidine, putrescine, cadarverine, tryptamine, tyramine và b-phenylethylamine cũng

có thể hoạt động như chất tăng tiềm lực bằng cách làm tăng sự vận chuyển histamine qua màng dạ dày (Chu và Bjeldanes, 1981)

Hình 3 Các con đường chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine

(Nguồn: Halasz et al., 1994)

2.1.7 Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lƣợng thủy sản

Mặc dù sự kiểm soát các biogenic amine trong thủy sản thường được cam kết vì

sự liên quan của các amine này trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm, sự định lượng các biogenic amine này cũng được đề xuất như là chỉ tiêu chất lượng để phát hiện cá ôi, ươn hay sai sót trong quá trình bảo quản, chế biến thủy sản (Mietz và Karzas, 1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1987; Yamanaka et al., 1989) Các biogenic amine thường được sử dụng như chất chỉ thị chất lượng vì chúng biến đổi hàm lượng trong quá trình chế biến và bảo quản Các biogenic amine này được tìm thấy ở nồng độ thấp ở cá tươi và có xu hướng tăng lên trong quá trình bảo quản và thường gắn với sự ôi thiu thực phẩm do vi khuẩn (Halasz et al., 1994; Emborg

Danh mục biogenic amine của Mietz và Karmas (1977) được dùng phổ biến như tiêu chuẩn để đánh giá sự ôi, ươn của cá dựa trên hàm lượng một số biogenic amine phổ biến (histamine, cadaverine, putrescine, spermidine, and spermine) (Bảng 1) Giới hạn chấp nhận được cho danh mục chất lượng này được thiết lập là 10 Sau đó, một số tác giả khác đề xuất chỉ số được tính toán từ việc cộng hàm lượng histamine, tyramine, cadaverine, và putrescine cho thấy mối tương quan tốt với thời gian lưu trữ và đánh giá cảm quan trong đánh giá chất lượng cá ngừ (Veciana-Nogues, 1997) Một số biogenic amine cũng đã được sử dụng riêng lẻ để đánh giá chất lượng thủy sản Tổ chức Food and Drug Administration (Commission Regulation, 2005) khuyến cáo không chỉ histamine có thể chỉ ra mức độ khiếm khuyết trong bảo quản thực phẩm, mà các số liệu khoa học khác cũng có thể sử dụng để đánh giá độ tươi của cá, ví dụ như sự hiện diện của các biogenic amine khác liên quan đến sự thối rữa của cá

Bảng 1 Danh mục biogenic amine trong đánh giá chất lƣợng thủy sản

Rockfish, cá hồi, tôm Quality index = (histamine + putrescine +

cadaverine)/(1 + spermidine + spermine)

(Nguồn: Mietz và Karmas, 1977)

2.1.8 Giới hạn cho phép của histamine trong thủy sản

Sự ăn phải các biogenic amine có thể gây nguy hiểm cho người tiêu dùng, và do

đó đã có nhiều cố gắng để thiết lập giới hạn an toàn cho người tiêu dùng, đặc biệt là đối với trường hợp của histamine Liên minh Châu Âu (Commission Regulation, 2005) đã thiết lập cho phép đối với histamine ở một số loài cá dựa vào công nghệ sử dụng trên các loài cá này Hàm lượng histamine tối đa cho phép trong các sản phẩm cá tươi thuộc họ Combridae và Clupeidae là 100 mg/kg và lên đến 400 mg/kg cho các sản phẩm đã qua sơ chế thuộc cùng một họ (Commission Regulation, 2005) Tổ chức FDA

đã thiết lập hàm lượng histamine ở mức 50 mg/kg, trên mức này thì sản phẩm được xem như có nguy cơ gây hại cho sức khỏe (FDA, 2005) Tại Australia thì giới hạn cho phép của nồng độ histamine được coi là an toàn cho sức khỏe là 200 mg/kg và tại Nam Phi giới hạn này là 100 mg/kg (Auerswald et al., 2006) Tuy nhiên, mối liên quan giữa

hàm lượng histamine và độc tính của một mẫu cá chưa rõ ràng và sự hiện diện của các chất làm tăng cường hoạt tính của histamine cũng cần được xem xét

2.1.9 Phương pháp xác định histamine trong thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Vì tầm quan trọng của histamine trong đánh giá chất lượng thủy sản do đó cần thiết phải có những phương pháp phân tích phù hợp Histamine trong những thực phẩm khác nhau, bao gồm cá và sản phẩm từ cá, được xác định theo nhiều cách như bằng kỹ thuật sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, điện di mao dẫn và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Onal, 2007) Trong những phương pháp có sẵn để xác định histamine trong hải sản, phương pháp được dùng nhiều nhất là sắc ký, đặc biệt là HPLC với cột trao đổi ion hoặc cột pha đảo bằng cách dùng các cặp ion để tách histamine (Batange et al., 2005) Quy trình này có ưu điểm là độ nhạy, độ linh hoạt cao Ngoài ra, việc chuẩn bị mẫu cũng tương đối đơn giản

2.1.9.1 Quy trình ly trích

Việc xác định histamine từ cá thường gặp nhiều vấn đề do nhiều nguyên do Các biogenic amine chính yếu trong cá thường hiện diện ở những nồng độ khác nhau Hơn nữa, loại mẫu này rất phức tạp, chứa nhiều nồng độ protein và nhiều thành phần chất béo (0.5% - 30%) Vì thế, hầu hết phương pháp xác định biogenic amine (BA) bao gồm nhiều bước sơ bộ để ly trích những hợp chất này từ phần thịt cá và sau đó tiến hành lý trích và tinh sạch

Chuẩn bị mẫu và ly trích histamine từ cá là một bước quyết định trong phân tích histamine Nhiều dung môi đã được sử dụng để ly trích BA từ sản phẩm cá, bao gồm hydrochloric acid, trichloroacetic acid (TCA), perchloric acid (PCA), và một số dung môi khác như methanol, dichloromethane, acetone, và acetonitrile (Moret và Conte, 1996) Được dùng nhiều hơn cả là PCA và TCA bởi tác dụng của nó trong sự tủa protein, làm cho chúng thành những chất ly trích BA hữu hiệu nhất cho cá Sự ly trích thường bao gồm bước đầu tiên 5-15 gram cơ cá được đồng nhất với 10-50 ml acid nhiều nồng độ (5%, 6%, và 7,5%); hỗn hợp này sau đó được ly tâm và lọc (Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Veciana-Nogues et al., 1997) Phần tủa được rửa nhiều với acid, ly tâm, và lọc thêm lần nữa Dịch trích thu được có thể sử dụng cho việc xác định

những hợp chất khác như trimethylamine, volatile base nitrogen, amonia, urea, và một

ít amino acid tự do (FAA) (Capillas và Moral, 2001)

Trong một số trường hợp, bước đầu tiên trong quá trình định lượng histamine ở

cá và các sản phẩm làm từ cá có thể bao gồm việc tinh sạch và rửa các dịch chiết sau cùng dựa trên cột nhựa trao đổi ion và pha rắn Trong phương pháp HPLC, cột tách chính dùng để định lượng histamine thường được thiết lập bên cạnh một cột trao đổi ion nhỏ (cột bảo vệ) (Capillas và Moral, 2001)

2.1.9.2 Quy trình xác định

Các biogenic amine phản ứng chậm với hệ thống dò tìm bởi dễ bay hơi và thiếu sắc thể Nhiều biogenic amine trong thực phẩm không có tính hấp thụ lẫn huỳnh quang chuyên biệt, trong đó có histamine Do đó, một chất dẫn xuất thường được dùng để làm tăng độ nhạy Có nhiều chất dẫn xuất đã được biết như dansyl và dabsyl chloride, benzoyl chloride, fuoresceine, 9-fuorenylmethyl chloroformate, o-phthalaldehyde (OPA), và naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (Onal, 2007) Trong số này, OPA và dansyl chloride được dùng nhiều nhất Dansyl chloride tạo thành chất bền vững sau khi phản ứng với nhóm amino thứ nhất và thứ hai và sản phẩm thường bền hơn các sản phẩm được tạo dẫn xuất với OPA Tuy nhiên, OPA lại phản ứng nhanh với nhóm

amine đầu tiên dưới sự có mặt của những chất khử như của N-acetylcysteine,

2-mercaptoethanol hoặc thiofluor Dưới điều kiện cơ bản (pH>9) và nhiệt độ phòng, phản ứng hoàn thành trong vòng 1-30 giây Sản phẩm của phản ứng này, 1-alkyl-2-alkylthio-substituted isoindoles, cho thấy sự kích thích tối ưu ở 330 nm và bức xạ tối

đa ở 465 nm (Capillas và Moral, 2001) Ngoài ra, phương pháp tạo dẫn xuất bằng OPA đơn giản hơn, có thể dùng tự động với máy tự load mẫu Tuy nhiên, dẫn xuất OPA thì kém bền và cường độ huỳnh quang giảm nhanh chóng Do đó, cần kiểm soát nghiêm ngặt thời gian phản ứng Hiện nay, vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách tạo dẫn xuất sau khi tách (postcolumn derivatization) hoặc dùng máy tạo dẫn xuất

tự động trước khi tách

Việc tạo dẫn xuất histamine có thể được thực hiện trước (precolumn), trong column) hoặc sau quá trình phân tách sắc ký (postcolumn) (Onal, 2007; Gosetti, 2007) Quy trình được thực hiện phổ biến nhất là tạo dẫn xuất tự động trực tiếp sau khi phân tách vì phương pháp này có nhiều ưu điểm: thứ nhất, phương pháp này không cần

(on-nhiều bước xử lý sơ bộ như các phương pháp khác, do đó giảm thiểu khả năng làm nhiễm mẫu trong quá trình xử lý; thứ hai, thời gian phân tách ngắn và sự tạo dẫn xuất diễn ra cùng lúc, do đó làm tăng tính lặp lại và độ nhạy phân tích (Tracy et al., 1995) Ngược lại, phương pháp tạo dẫn xuất trước phân tách đòi hỏi nhiều bước xử lý mẫu và

có thể dẫn đến nhiều vấn đề trong quá trình phân tích sau này Dansyl chloride thường được sử dụng để tạo dẫn xuất trước phân tách trong sắc ký pha đảo đi kèm với việc dò tìm bằng UV còn OPA thường được dùng để tạo dẫn xuất trước hoặc sau phân tách trong sắc ký pha đảo cặp ion kết hợp với việc phát hiện bằng huỳnh quang (Capillas và Moral, 2001, Veciana-Nogues, 1997)

2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.2.1 Giới Thiệu

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do: có độ nhạy tương đối cao, có khả năng định lượng tốt, thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác

Hợp chất có thể phân tích bằng sắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu, các hợp chất vô cơ… Dựa vào sự khác nhau về cơ chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà người ta có thể phân chia nó ra làm các loại: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử… trong đó sắc ký phân bố được ứng dụng rộng rãi và phổ biến Tùy theo độ phân cực pha tĩnh và dung môi pha động, người ta phân biệt: sắc ký lỏng pha thường và sắc ký lỏng pha đảo

- Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có độ phân cực cao hơn độ phân cực của dung môi pha động, dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm

- Sắc ký lỏng pha đảo: ngược với sắc ký pha thường, pha tĩnh có độ phân cực thấp, pha động có độ phân cực cao hơn Phương pháp này dùng để phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực vừa Dung môi sử dụng là dung môi phân cực,

trong đó nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo được

sử dụng nhiều nhất

2.2.2 Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơm, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu

Mẫu sau khi được tiêm vào cột sẽ được pha động lôi kéo qua cột Dựa vào khả năng tương tác khác nhau giữa các chất có trong nền mẫu với pha tĩnh và pha động mà chúng được tách ra khỏi nhau và sau khi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi bộ dò cụ thể Sắc ký lỏng có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như đầu dò phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất nhận danh chính xác

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các loại thủy hải sản được mua ở các siêu thị tại thành phố Cần Thơ, có nguồn gốc sản xuất

3.1.2 Hóa chất

Methanol, ethanol, perchloric acid (PCA), tricholoro acetic acid (TCA), NaOH,

H3PO4, dansyl chloride, o-Phthaldehyde (OPA), HCl, histamine dihydrochloride,

3.1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme, viện NC&PT

Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện đề tài: 1/2013 đến 5/2013

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tối ưu hóa dung môi ly trích histamine trong cá

Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành để so sánh các dung môi ly trích histamine

trong cá, bao gồm methanol 99%, perchloric acid (PCA) 0.6M, trichloroacetic acid (TCA) 6%, từ đó tìm ra dung môi ly trích histamine trong cá hiệu quả nhất, kết quả tối

ưu của thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm sau

3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu

Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau

đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ

4oC trong một tuần trước khi phân tích nhằm đảm bảo hàm lượng cao histamine có trong mẫu

3.2.1.2 Phương pháp ly trích histamine

- Phương pháp ly trích sử dụng perchloric acid 0.6M: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Cseinati and Forgacs (1999) 10g mẫu được đồng nhất với 20ml PCA 0.6M trong 10 phút, sau đó hỗ hợp này được đem ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút Phần dịch sau ly tâm được định mức đến 50ml với PCA 0.6M, sau đó đem lọc và trữ ở 0oC

- Phương pháp ly trích sử dụng trichloroacetic acid 6%: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Yung-Hsiang et al (2001) 5g mẫu được đồng nhất với 20ml PCA 0.6M trong 10 phút, sau đó hỗ hợp này được đem ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút Phần dịch sau ly tâm được đem lọc, sau đó định mức đến 20ml với TCA 6% và trữ ở 0oC

- Phương pháp ly trích sử dụng methanol 99%: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Lin et al (1976) 10g mẫu được đồng nhất với 50ml methanol 99% trong 10 phút, sau đó hỗn hợp này được để trong bể điều nhiệt ở nhiệt

độ 60oC trong 15 phút Sau khi ngâm, hỗn hợp được để nguội đến nhiệt độ phòng rồi

ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút, sau đó lọc và trữ ở 0oC

3.2.1.3 Phương pháp định lượng histamine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Định lượng histamine bằng quy trình benzoyl:

 Phương pháp tạo dẫn xuất huỳnh quang với benzoyl chloride (Hwang et al.,

1997): 1ml NaOH 2M và 10µl benzoyl chloride được cho lần lượt vào 2ml dịch trích mẫu Sau đó, dung dịch này được lắc đều và để trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 20 phút Phản ứng kết thúc bằng cách làm lạnh dung dịch trong 30 phút, sau đó thêm tiếp 3ml diethyl ether rồi đem ly tâm 3000 rpm/10min Sau khi ly tâm, dung dịch được lọc qua phin lọc 0,45 µm

 Định lượng Histamine bằng HPLC: Histamine có trong mẫu được định

lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp Hitachi HPLC apparatus (Hitachi, Tokyo, Japan), hệ thống bao gồm bơm Model L-6200, bộ phận tiêm mẫu Rheodyne Model

7125, bộ phận đọc tín hiệu Model L-4000 UV-Vis (bước sóng 254nm), bộ phận trích xuất dữ liệu Model D-2500 Chromato-integrator Cột Lichrospher 100RP-18 reversed-phase column (5 lm, 125 x 4.6mm, E Merck, Damstadt, Germany) được sử dụng cho phân tách Quá trình rửa giải bắt đầu với 50:50 (v/v) methanol:water với tốc dộ dòng 0.8ml/ phút trong 30 giây, sau đó tăng dần lên 85:15 (v/v) methanol:water (0.8ml/ phút) trong 6.5 phút tiếp theo Hỗn hợp methanol:water được giữ ổn định ở 85:15 (0.8ml/ phút) trong 5 phút, sau đó giảm xuống 50:50 (0.8ml/ phút) trong vòng 2 phút

- Định lượng histamine bằng quy trình dansyl:

 Phương pháp tạo dẫn xuất huỳnh quang với dansyl chloride (Eerola et al.,

1993): 2 ml dịch chiết mẫu được alkaline hóa bằng 400 µl NaOH 2N Sau đó, dung dịch này được thêm vào 600 µl sodium bicarbonate đã bão hòa và 2 ml dansyl chloride Ðặt bình chứa dung dịch mẫu trên bể điều nhiệt ở nhiệt độ 40oC trong 45 phút Dansyl chloride dư được loại bỏ bằng cách thêm vào 100 µl ammonia, sau đó lọc qua phin lọc 0,45 µm

 Định lượng Histamine bằng HPLC: Histamine có trong mẫu được định

lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp Shimadzu Prominence HPLC apparatus (Shimadzu, Kyoto, Japan), bao gồm bộ phận đọc SPD-M20A (bước sóng 254nm) và hai bơm (Shimadzu LC-10AT), bộ phận tiêm mẫu tự động (SIL 20AC), bộ phận làm khô cột (CTO-20AC), và bộ phận kết nối dòng (CBM-20A) với van FCV-11AL được

sử dụng Cột được dùng là cột pha nghịch, Spherisorb 5 Si C18 pH-St, 250 x 4.6mm (Phenomenex, Macclesfield, Cheshire, UK) Pha động là hỗn hợp 95:5 (v/v) acetonitrile : water, tốc độ dòng 1.0 ml/ phút

- Phương pháp xác định hàm lượng histamine:

Căn cứ vào diện tích peak, nồng độ histamine có trong dịch trích mẫu được tính

từ đường chuẩn Để dựng đường chuẩn, những nồng độ khác nhau của histamine chuẩn được tạo dẫn xuất huỳnh quang và phân tích với HPLC Nồng độ chuẩn được dùng trong nghiên cứu này là: 0.1, 0.5 và 1.0 µg/ml Mỗi mẫu được thực hiện ba lần lặp lại và mỗi lần phân tích với HPLC được thực hiện hai lần Đối với các mẫu có hàm lượng histamine cao, dịch trích mẫu được pha loãng sau đó mới được phân tích Hàm lượng histamine có trong mẫu ban đầu được tính theo công thức:

Trong đó C1 là nồng độ histamine tính được từ đường chuẩn (mg/l); C2 là hàm lượng histamine trong mẫu ban đầu (mg/kg); V là thể tích dịch trích (l); m là khối lượng mẫu ban đầu (kg) và d là hệ số pha loãng

- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg)

3.2.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản

Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của quy trình

benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong cá và sản phẩm từ cá, từ

đó tìm ra quy trình hiệu quả nhất, kết quả tối ưu của thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm sau

3.2.2.1 Chuẩn bị mẫu

Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau

đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ

4oC Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (zero, 1, 2, 3, 4, và 7 ngày trong quá trình bảo quản) nhằm phân tích histamine ở những hàm lượng khác nhau

3.2.2.2 Phương pháp ly trích histamine

Histamine có trong mẫu được ly trích dựa theo dung môi được chọn từ thí nghiệm trước (3.2.1)

3.2.2.3 Phương pháp định lượng histamine

Histamine sau khi ly trích được định lượng theo quy trình benzoyl và quy trình dansyl – như mô tả ở mục 3.2.1.3

- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg)

3.2.3 Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản

Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm nghiên cứu sự gia tăng hàm lượng histamine cũng như vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản,

3.2.3.1 Chuẩn bị mẫu

Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau

đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ

4oC và 0oC Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (Bảng 2) và trữ ở nhiệt độ -20oC nhằm hạn chế tối đa hoạt động của vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích Các mẫu thuộc cùng mức nhiệt độ được phân tích cùng lúc nhằm tránh

sự biến thiên kết quả theo ngày phân tích

Bảng 2 Thời gian lấy mẫu của các mẫu cá ngừ theo nhiệt độ bảo quản

4oC Zero Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 7

0oC Zero Ngày 2 Ngày 4 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11

3.2.3.2 Phương pháp định lượng histamine

Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình được chọn từ thí nghiệm 3.2.2

- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg)

3.2.3.3 Phân tích vi sinh trên các mẫu

- Chuẩn bị mẫu cho phân tích vi sinh: Thực hiện theo phương pháp của Esther et

al (2010) 10g mẫu được đồng nhất với 9ml NaCl 0.09% trong Stomach 1ml dịch đồng nhất này được chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml NaCl 0.09% để được độ pha loãng 10-1 Theo đó, tiếp tục pha loãng dịch này đến nồng độ 10-9

- Phương pháp đếm tổng số vi khuẩn (Guinn et al., 1999): Hút 1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri sau đó đổ khoảng 18 ml thạch PCA (50o

C)

vào và lắc đều theo hình số 8 để vi khuẩn phân tán đều Sau đó ủ ở 37oC/ 48 giờ Sau khi quá trình ủ kết thúc, đếm và xác định mật số vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm

- Chỉ tiêu đánh giá: Mật số vi khuẩn (log10 cfu/g)

3.2.4 Xác định hàm lượng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản

Mục tiêu: Xác định hàm lượng histamine trong các sản phẩm thủy sản và so sánh

với hàm lượng tối đa cho phép Các mẫu được chọn theo tiêu chí là những loại thủy hải sản được sử dụng phổ biến

Phương pháp:

- Thu thập mẫu: 7 mẫu hải sản (Bảng 3) được mua từ các siêu thị tại thành phố Cần Thơ

Bảng 3: Chú thích về các mẫu hải sản

Samples Nhà sản xuất/ cung cấp Ngày hết hạn Nhiệt độ lưu trữ

Cá ngừ tươi Siêu thị Co.op Mart

4oC

Cá thu đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 11/2014

Cá ngừ đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 8/2015

Định lượng histamine: Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình được chọn từ thí nghiệm 3.2.2

- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg)

3.2.5 Phương pháp xử lý thống kê

Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Các số liệu được thể hiện bời giá trị trung bình ± sai số chuẩn Thử nghiệm ANOVA được dùng để phân tích số liệu Khác biệt giữa các giá trị được xem là có ý nghĩa khi p < 0.05 Tất cả các số liệu được phân tích