trong hải sản
Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong cá và sản phẩm từ cá, từ đó tìm ra quy trình hiệu quả nhất, kết quả tối ưu của thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.2.2.1 Chuẩn bị mẫu
Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ. Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (zero, 1, 2, 3, 4, và 7 ngày trong quá trình bảo quản) nhằm phân tích histamine ở những hàm lượng khác nhau.
3.2.2.2 Phương pháp ly trích histamine
Histamine có trong mẫu được ly trích dựa theo dung môi được chọn từ thí nghiệm trước (3.2.1).
3.2.2.3 Phương pháp định lượng histamine
Histamine sau khi ly trích được định lượng theo quy trình benzoyl và quy trình dansyl – như mô tả ở mục 3.2.1.3.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.3 Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản
Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm nghiên cứu sự gia tăng hàm lượng histamine cũng như vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản,
3.2.3.1 Chuẩn bị mẫu
Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ. Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC và 0oC. Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (Bảng 2) và trữ ở nhiệt độ -20oC nhằm hạn chế tối đa hoạt động của vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Các mẫu thuộc cùng mức nhiệt độ được phân tích cùng lúc nhằm tránh sự biến thiên kết quả theo ngày phân tích.
Bảng 2. Thời gian lấy mẫu của các mẫu cá ngừ theo nhiệt độ bảo quản.
Nhiệt độ Thời gian lấy mẫu
4oC Zero Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 7 0oC Zero Ngày 2 Ngày 4 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11
3.2.3.2 Phương pháp định lượng histamine
Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình được chọn từ thí nghiệm 3.2.2.
- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg). 3.2.3.3 Phân tích vi sinh trên các mẫu
- Chuẩn bị mẫu cho phân tích vi sinh: Thực hiện theo phương pháp của Esther et al. (2010). 10g mẫu được đồng nhất với 9ml NaCl 0.09% trong Stomach. 1ml dịch đồng nhất này được chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml NaCl 0.09% để được độ pha loãng 10-1. Theo đó, tiếp tục pha loãng dịch này đến nồng độ 10-9.
- Phương pháp đếm tổng số vi khuẩn (Guinn et al., 1999): Hút 1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri sau đó đổ khoảng 18 ml thạch PCA (50o
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vào và lắc đều theo hình số 8 để vi khuẩn phân tán đều. Sau đó ủ ở 37oC/ 48 giờ. Sau khi quá trình ủ kết thúc, đếm và xác định mật số vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mật số vi khuẩn (log10 cfu/g).
3.2.4 Xác định hàm lƣợng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản
Mục tiêu: Xác định hàm lượng histamine trong các sản phẩm thủy sản và so sánh với hàm lượng tối đa cho phép. Các mẫu được chọn theo tiêu chí là những loại thủy hải sản được sử dụng phổ biến.
Phƣơng pháp:
- Thu thập mẫu: 7 mẫu hải sản (Bảng 3) được mua từ các siêu thị tại thành phố Cần Thơ.
Bảng 3: Chú thích về các mẫu hải sản.
Samples Nhà sản xuất/ cung cấp Ngày hết hạn Nhiệt độ lưu trữ Cá ngừ tươi Siêu thị Co.op Mart
4oC
Cá cam tươi Siêu thị Metro
Cá thu tươi Siêu thị Metro
Cá thu đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 11/2014 Cá ngừ đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 8/2015
Cá nục khô Siêu thị Vinatext 9/2013
Tôm khô Siêu thị Vinatext 11/2013
Định lượng histamine: Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình được chọn từ thí nghiệm 3.2.2.
- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg).
3.2.5. Phƣơng pháp xử lý thống kê
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu được thể hiện bời giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Thử nghiệm ANOVA được dùng để phân tích số liệu. Khác biệt giữa các giá trị được xem là có ý nghĩa khi p < 0.05. Tất cả các số liệu được phân tích
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
bằng phần mềm Statgraphic Centurion XV (Statgraphics Centurion XV, Manugistics, Inc., Rockville, USA, 2009).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tối ƣu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản
Trong phân tích thực phẩm, việc trích xuất chất cần phân tích từ hỗn hợp mẫu ban đầu là điều cần thiết. Các mẫu thực phẩm dạng rắn thường được tách chiết bằng các dung môi có tính axit vì các chất này đồng thời cũng là chất loại bỏ protein trong quá trình tách lỏng – rắn. Vì hàm lượng cao lipid trong cá và các sản phẩm cá, các loại dung môi có thể loại bỏ lipid và protein thường được sử dụng để đạt hiệu quả ly trích cao nhất. Trong thí nghiệm này, perchloric acid (0.6M), trichloroacetic acid (6%, m/v), methanol (99%) được sử dụng như dung môi tách chiết histamine trong cá. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng histamine ở những mức độ khác nhau khi ly trích với những dung môi khác nhau.
Hình 4: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine thu đƣợc khi ly trích bằng các dung môi khác nhau. Met - methanol; PCA - perchloric acid (0.6M) và TCA -
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đối với các mẫu phân tích bằng quy trình dansyl, hàm lượng histamine cao nhất thu được khi ly trích mẫu với perchloric acid 0.6M. Các mẫu ly trích với trichloroacetic acid 6% và phân tích bằng quy trình benzoyl cho hàm lượng histamine cao hơn so với các mẫu được ly trích bằng hai loại dung môi còn lại. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Ben-Griggrey et al. (2001), khi đề nghị rằng perchloric acid và trichloroacetic acid hiệu quả hơn methanol, acetonitrile và acetone để ly trích histamine từ các sản phẩm cá. Ruiz-Capillas and Moral (2001) cũng đã báo cáo rằng PCA and TCA có hiệu quả cao trong ly trích các biogenic amine (bao gồm histamine) có trong cá và các sản phẩm cá vì ảnh hưởng của các dung môi này đến sự kết tủa protein. Ngoài ra, vì hầu hết các biogenic amine trong cá ở dạng bám, do đó khi ly trích bằng methanol hàm lượng histamine thu được là thấp (Shalaby et al., 1996). Trong nghiên cứu này, hàm lượng histamine trong cá thu được cao khi ly trích với dung môi có tính axit, chứng tỏ histamine có trong cá dễ tan trong môi trường axit. Vì perchloric acid và trichloroacetic acid cho kết quả sắc ký tốt và hiệu quả khi phân tách, hai loại axit này được sử dụng như dung môi ly trích tối ưu cho các thí nghiệm sau. Perchloric acid 0.6M được sử dụng để ly trích histamine và phân tích bằng quy trình dansyl, trong khi trichloroacetic acid 6% được sử dụng để ly trích và phân tích histamine bằng quy trình benzoyl.
4.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản trong hải sản
Trong số các phương pháp phân tích hiện có, HPLC là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tách và định lượng histamine. Vì histamine có trong thực phẩm không thể hiện một bước sóng đặc trưng nào, do đó quá trình tạo dẫn xuất cần được thực hiện để việc định lượng nồng độ histamine bằng UV, VIS hay huỳnh quang có thể thực hiện (Onal, 2007). Trong thí nghiệm này, histamine được định lượng bởi phương pháp HPLC bằng cách dùng hai quy trình – quy trình dansyl và quy trình benzoyl – dựa trên phương pháp tạo dẫn xuất trước phân tách. Ở cả hai phương pháp, cột rửa giải pha nghịch được sử dụng để phân tách histamine. Sắc ký đồ của histamine chuẩn và dịch ly trích của mẫu cá ngừ phân tích bởi quy trình dansyl và quy trình benzoyl được thể hiện ở Hình 2. Histamine được rửa giải hoàn toàn sau gần ba phút khi phân tích với quy trình benzoyl, trong khi đó thời gian để rửa giải hoàn toàn histamine khi phân tích với quy trình dansyl là năm phút. Các đỉnh histamine được thể
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hiện trên sắc ký đồ với hình dạng đỉnh rõ nét, có tính đối xứng cao và phù hợp với các báo cáo trước đó (Hwang et al., 1997). Tuy nhiên, hàm lượng histamine định lượng ở các mẫu cá ngừ cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình (Hình 3). Nhìn chung, hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình benzoyl cao hơn hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình dansyl (5/6 mẫu phân tích). Ở mẫu thứ ba, hàm lượng histamine định lượng bằng quy trình benzoyl có giá trị thấp hơn khi định lượng bằng quy trình dansyl (52.51 mg/kg so với 52.96 mg/kg). Tuy nhiên, khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Hình 5: Sắc ký đồ của dung dịch histamine chuẩn và dung dịch mẫu ly trích. (A), (C): Histamine chuẩn (1 µg/ml); (B), (D) mẫu cá ngừ trữ ở 7 ngày. (A) and (B): sắc ký đồ của quy trình benzoyl; (C) and (D): sắc ký đồ của quy trình dansyl; (*):
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 6: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine định lƣợng bằng quy trình dansyl và quy trình benzoyl.
Kết quả của thí nghiệm cho thấy rằng quy trình benzoyl cho kết quả chính xác hơn so với quy trình dansyl trong định lượng histamine trong cá. Điều này có thể giải thích là do benzoyl chloride tạo thành hợp chất bền sau phản ứng với cả nhóm amine thứ nhất và thứ hai của phân tử histamine và sản phẩm của phản ứng bền hơn so với khi tạo dẫn xuất với dansyl chloride. Thời gian tạo dẫn xuất dài cũng là nhược điểm của quy trình dansyl, vì nó làm làm giảm độ bền của hợp chất huỳnh quang. Ngoài ra, ammonia cũng cần được sử dụng để loại bỏ lượng dư dansyl chloride sau khi tạo dẫn xuất. Nếu không có bước này, những sản phẩm phụ như dansylamide (Dns-NH2), dansyl sulphonic acid (Dns-OH) và dansyl hydrazine (Dns-N2H3) thường xuất hiện trên sắc ký đồ (De Mey et al., 2011). Bên cạnh đó, lượng dư dansyl chloride cũng có thể bị tách cùng với histamine. Do đó, việc thêm vào 100 µl ammonia – như mô tả của Eerola et al. (1993) – là không đủ để loại bỏ hoàn toàn lượng dansyl chloride dư. Kết quả là một lượng thấp những sản phẩm phụ có thể xuất hiện trên sắc ký đồ và ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Khác với quy trình dansyl, quy trình benzoyl ít được sử dụng hơn trong phân tích histamine trong cá và sản phẩm cá. Tuy nhiên, việc tạo dẫn xuất benzoyl nhanh làm cho thời gian phân tích được rút ngắn. Việc tạo dẫn xuất benzoyl thường được tiến
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hành ở nhiệt độ biến thiên từ nhiệt độ phòng đến 70oC. Tại mức nhiệt độ phòng, quá trình tạo dẫn xuất cần thời gian ủ dài, trong khi khi tăng nhiệt độ thời gian ủ chỉ từ 15 (Krause et al., 1995) đến 30 phút (Chen, 2003). Trong đa số các trường hợp, thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ 70oC được đề nghị (Romero et al., 2000). Việc tạo dẫn xuất theo cách này sẽ thu được nồng độ cao nhất của histamine và vì lượng dư benzoyl chloride được tách khỏi histamine trên sắc ký đồ, việc định lượng histamine sau đó trở nên dễ dàng hơn. Khác với quy trình dansyl (ở nhiệt độ cao hơn 65oC, các dẫn xuất amine dễ dàng bị phá hủy), Dadáková et al. (2009) đã báo cáo rằng ở nhiệt độ cao lượng dư benzoyl chloride được giảm đi nhiều mà không ảnh hưởng đến lượng histamine cần phân tích. Một thuân lợi khác của việc tạo dẫn xuất với benzoyl chloride là việc dừng phản ứng rất dễ dàng. Trong khi việc thêm ammonia là cần thiết để dừng phản ứng tạo dẫn xuất với dansyl chloride thì quy trình tạo dẫn xuất với benzoyl chloride chỉ cần làm lạnh là phản ứng đã kết thúc.
Vì quy trình benzoyl cho kết quả tốt hơn, cũng như nhanh và dễ thực hiện hơn quy trình dansyl, quy trình này được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
4.3 Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản thời gian và nhiệt độ bảo quản
Lượng histamine sinh ra trong cơ thể cá bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thời gian, điều kiện bảo quản và tùy từng loại cá (Lehane and Olley, 1999). Thí nghiệm này được tiến hành nhằm nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng histamine và mật số vi khuẩn ở cá ngừ ở hai nhiệt độ bảo quản (0oC và 4oC).
- Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hàm lượng histamine:
Hàm lượng histamine có trong mẫu cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản được trình bày ở Hình 3 – 4. Ở các mẫu trữ ở 4oC, hàm lượng histamine tăng từ 36.93 mg/kg đến hơn 161.29 mg/kg. Sự tăng hàm lượng histamine này có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và hàm lượng histamine ở ngày thứ ba cao hơn so với hàm lượng cho phép của FDA (> 50 mg/kg). Trong các mẫu trữ ở 0oC, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng histamine cũng tăng theo thời gian trữ, mặc dù sự tăng hàm lượng histamine không nhanh như khi trữ ở nhiệt độ 4oC. Tuy nhiên, hàm lượng histamine của các mẫu bảo quản ở 0oC không vượt quá giới hạn cho phép của FDA (< 50 mg/kg). Kết quả
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
cũng cho thấy hàm lượng histamine tăng có ý nghĩa, ngoại trừ hàm lượng histamine ở ngày 11.
Hình 7: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian bảo quản.
Hình 8: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0o
C theo thời gian bảo quản.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Dựa vào kết quả thí nghiệm, nhiệt độ bảo quản là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành histamine. Thời gian và nhiệt độ cũng đã được báo cáo như là những yếu tố chính trong việc kiểm soát sự gia tăng hàm lượng histamine, vì các yếu tố này có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn sinh histamine và enzyme histidine carboxylase (FDA, 2001). Hàm lượng histamine tăng ít ở các mẫu trữ ở 0oC, trong khi các mẫu trữ ở 4oC lại có hàm lượng histamine vượt quá giới hạn cho phép sau ba ngày trữ. Nghiên cứu của Haaland et al. (1990) cho thấy mối quan hệ giữa sự hình thành các axit amin tự do và các amine trong cá thu bảo quản ở 0oC và 4oC. Hàm lượng của một số axit amin giảm khi cá được bảo quản ở 4oC với kết quả là sự hình thành phenylethylamine, tyramine, putrescine, histamine và cadaverine. Tuy nhiên, không có những thay đổi rõ ràng khi cá được bảo quản ở 0oC. Wendakoon et al. (1990) đã báo cáo kết quả tương tự với lượng thấp histamine hình thành trong quá trình bảo quản cá thu ở 0oC, nhưng hàm lượng cao histamine lại được phát hiện khi bảo quản ở 8oC. Hàm lượng histamine tương tự như kết quả của thí nghiệm này cũng đã được báo cáo bởi Guizani et al. (2005) trên cá ngừ vây vàng. Hàm lượng histamine trên cá ngừ vây vàng trữ ở 4oC là 150 mg/kg sau 8 ngày trữ, còn trong nghiên cứu này là 161.29 mg/kg sau 7 ngày trữ. Kết quả thí nghiệm này cũng phù hợp với kết quả của Kim et al. (1999), khi phát hiện hàm lượng thấp histamine (80 mg/kg) trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC trong 18 ngày. Lopez-Sabater et al. (1996) cũng đã phát hiện histamine trong các mẫu cá ngừ đại dương, với hàm lượng histamine đạt 425 mg/kg