3.2.1. Tối ƣu hóa dung môi ly trích histamine trong cá
Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành để so sánh các dung môi ly trích histamine trong cá, bao gồm methanol 99%, perchloric acid (PCA) 0.6M, trichloroacetic acid (TCA) 6%, từ đó tìm ra dung môi ly trích histamine trong cá hiệu quả nhất, kết quả tối ưu của thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu
Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ. Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4oC trong một tuần trước khi phân tích nhằm đảm bảo hàm lượng cao histamine có trong mẫu.
3.2.1.2 Phương pháp ly trích histamine
- Phương pháp ly trích sử dụng perchloric acid 0.6M: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Cseinati and Forgacs (1999). 10g mẫu được đồng nhất với 20ml PCA 0.6M trong 10 phút, sau đó hỗ hợp này được đem ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút. Phần dịch sau ly tâm được định mức đến 50ml với PCA 0.6M, sau đó đem lọc và trữ ở 0oC.
- Phương pháp ly trích sử dụng trichloroacetic acid 6%: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Yung-Hsiang et al. (2001). 5g mẫu được đồng nhất với 20ml PCA 0.6M trong 10 phút, sau đó hỗ hợp này được đem ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút. Phần dịch sau ly tâm được đem lọc, sau đó định mức đến 20ml với TCA 6% và trữ ở 0oC.
- Phương pháp ly trích sử dụng methanol 99%: Quy trình ly trích histamine được thực hiện theo phương pháp của Lin et al. (1976). 10g mẫu được đồng nhất với 50ml methanol 99% trong 10 phút, sau đó hỗn hợp này được để trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút. Sau khi ngâm, hỗn hợp được để nguội đến nhiệt độ phòng rồi ly tâm 7000 vòng/ 4oC/ 10 phút, sau đó lọc và trữ ở 0oC.
3.2.1.3 Phương pháp định lượng histamine bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
-Định lượng histamine bằng quy trình benzoyl:
Phương pháp tạo dẫn xuất huỳnh quang với benzoyl chloride (Hwang et al., 1997): 1ml NaOH 2M và 10µl benzoyl chloride được cho lần lượt vào 2ml dịch trích mẫu. Sau đó, dung dịch này được lắc đều và để trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong 20 phút. Phản ứng kết thúc bằng cách làm lạnh dung dịch trong 30 phút, sau đó thêm tiếp 3ml diethyl ether rồi đem ly tâm 3000 rpm/10min. Sau khi ly tâm, dung dịch được lọc qua phin lọc 0,45 µm.
Định lượng Histamine bằng HPLC: Histamine có trong mẫu được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp Hitachi HPLC apparatus (Hitachi, Tokyo, Japan), hệ thống bao gồm bơm Model L-6200, bộ phận tiêm mẫu Rheodyne Model
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
7125, bộ phận đọc tín hiệu Model L-4000 UV-Vis (bước sóng 254nm), bộ phận trích xuất dữ liệu Model D-2500 Chromato-integrator. Cột Lichrospher 100RP-18 reversed- phase column (5 lm, 125 x 4.6mm, E. Merck, Damstadt, Germany) được sử dụng cho phân tách. Quá trình rửa giải bắt đầu với 50:50 (v/v) methanol:water với tốc dộ dòng 0.8ml/ phút trong 30 giây, sau đó tăng dần lên 85:15 (v/v) methanol:water (0.8ml/ phút) trong 6.5 phút tiếp theo. Hỗn hợp methanol:water được giữ ổn định ở 85:15 (0.8ml/ phút) trong 5 phút, sau đó giảm xuống 50:50 (0.8ml/ phút) trong vòng 2 phút.
-Định lượng histamine bằng quy trình dansyl:
Phương pháp tạo dẫn xuất huỳnh quang với dansyl chloride (Eerola et al., 1993): 2 ml dịch chiết mẫu được alkaline hóa bằng 400 µl NaOH 2N. Sau đó, dung dịch này được thêm vào 600 µl sodium bicarbonate đã bão hòa và 2 ml dansyl chloride. Ðặt bình chứa dung dịch mẫu trên bể điều nhiệt ở nhiệt độ 40oC trong 45 phút. Dansyl chloride dư được loại bỏ bằng cách thêm vào 100 µl ammonia, sau đó lọc qua phin lọc 0,45 µm.
Định lượng Histamine bằng HPLC: Histamine có trong mẫu được định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng cao áp Shimadzu Prominence HPLC apparatus (Shimadzu, Kyoto, Japan), bao gồm bộ phận đọc SPD-M20A (bước sóng 254nm) và hai bơm (Shimadzu LC-10AT), bộ phận tiêm mẫu tự động (SIL 20AC), bộ phận làm khô cột (CTO-20AC), và bộ phận kết nối dòng (CBM-20A) với van FCV-11AL được sử dụng. Cột được dùng là cột pha nghịch, Spherisorb 5 Si C18 pH-St, 250 x 4.6mm (Phenomenex, Macclesfield, Cheshire, UK). Pha động là hỗn hợp 95:5 (v/v) acetonitrile : water, tốc độ dòng 1.0 ml/ phút.
-Phương pháp xác định hàm lượng histamine:
Căn cứ vào diện tích peak, nồng độ histamine có trong dịch trích mẫu được tính từ đường chuẩn. Để dựng đường chuẩn, những nồng độ khác nhau của histamine chuẩn được tạo dẫn xuất huỳnh quang và phân tích với HPLC. Nồng độ chuẩn được dùng trong nghiên cứu này là: 0.1, 0.5 và 1.0 µg/ml. Mỗi mẫu được thực hiện ba lần lặp lại và mỗi lần phân tích với HPLC được thực hiện hai lần. Đối với các mẫu có hàm lượng histamine cao, dịch trích mẫu được pha loãng sau đó mới được phân tích. Hàm lượng histamine có trong mẫu ban đầu được tính theo công thức:
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Trong đó C1 là nồng độ histamine tính được từ đường chuẩn (mg/l); C2 là hàm lượng histamine trong mẫu ban đầu (mg/kg); V là thể tích dịch trích (l); m là khối lượng mẫu ban đầu (kg) và d là hệ số pha loãng.
- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg).
3.2.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản trong hải sản
Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm so sánh hiệu quả của quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong cá và sản phẩm từ cá, từ đó tìm ra quy trình hiệu quả nhất, kết quả tối ưu của thí nghiệm này được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.2.2.1 Chuẩn bị mẫu
Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ. Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC. Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (zero, 1, 2, 3, 4, và 7 ngày trong quá trình bảo quản) nhằm phân tích histamine ở những hàm lượng khác nhau.
3.2.2.2 Phương pháp ly trích histamine
Histamine có trong mẫu được ly trích dựa theo dung môi được chọn từ thí nghiệm trước (3.2.1).
3.2.2.3 Phương pháp định lượng histamine
Histamine sau khi ly trích được định lượng theo quy trình benzoyl và quy trình dansyl – như mô tả ở mục 3.2.1.3.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3.2.3 Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản
Mục tiêu: Thí nghiệm được tiến hành nhằm nghiên cứu sự gia tăng hàm lượng histamine cũng như vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản,
3.2.3.1 Chuẩn bị mẫu
Cá ngừ tươi (Thunnus albacares) được mua ở siêu thị tại thành phố Cần Thơ, sau đó được bảo quản lạnh và được đưa đến Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Cần Thơ. Sau đó mẫu cá ngừ này được bảo quản ở nhiệt độ 4oC và 0oC. Mẫu cá ngừ được lấy sau những mốc thời gian nhất định (Bảng 2) và trữ ở nhiệt độ -20oC nhằm hạn chế tối đa hoạt động của vi khuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Các mẫu thuộc cùng mức nhiệt độ được phân tích cùng lúc nhằm tránh sự biến thiên kết quả theo ngày phân tích.
Bảng 2. Thời gian lấy mẫu của các mẫu cá ngừ theo nhiệt độ bảo quản.
Nhiệt độ Thời gian lấy mẫu
4oC Zero Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 7 0oC Zero Ngày 2 Ngày 4 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11
3.2.3.2 Phương pháp định lượng histamine
Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình được chọn từ thí nghiệm 3.2.2.
- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg). 3.2.3.3 Phân tích vi sinh trên các mẫu
- Chuẩn bị mẫu cho phân tích vi sinh: Thực hiện theo phương pháp của Esther et al. (2010). 10g mẫu được đồng nhất với 9ml NaCl 0.09% trong Stomach. 1ml dịch đồng nhất này được chuyển sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml NaCl 0.09% để được độ pha loãng 10-1. Theo đó, tiếp tục pha loãng dịch này đến nồng độ 10-9.
- Phương pháp đếm tổng số vi khuẩn (Guinn et al., 1999): Hút 1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri sau đó đổ khoảng 18 ml thạch PCA (50o
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vào và lắc đều theo hình số 8 để vi khuẩn phân tán đều. Sau đó ủ ở 37oC/ 48 giờ. Sau khi quá trình ủ kết thúc, đếm và xác định mật số vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm.
- Chỉ tiêu đánh giá: Mật số vi khuẩn (log10 cfu/g).
3.2.4 Xác định hàm lƣợng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản
Mục tiêu: Xác định hàm lượng histamine trong các sản phẩm thủy sản và so sánh với hàm lượng tối đa cho phép. Các mẫu được chọn theo tiêu chí là những loại thủy hải sản được sử dụng phổ biến.
Phƣơng pháp:
- Thu thập mẫu: 7 mẫu hải sản (Bảng 3) được mua từ các siêu thị tại thành phố Cần Thơ.
Bảng 3: Chú thích về các mẫu hải sản.
Samples Nhà sản xuất/ cung cấp Ngày hết hạn Nhiệt độ lưu trữ Cá ngừ tươi Siêu thị Co.op Mart
4oC
Cá cam tươi Siêu thị Metro
Cá thu tươi Siêu thị Metro
Cá thu đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 11/2014 Cá ngừ đóng hộp Siêu thị Co.op Mart 8/2015
Cá nục khô Siêu thị Vinatext 9/2013
Tôm khô Siêu thị Vinatext 11/2013
Định lượng histamine: Histamine có trong mẫu được định lượng theo quy trình
được chọn từ thí nghiệm 3.2.2.
- Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng histamine (mg/kg).
3.2.5. Phƣơng pháp xử lý thống kê
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các số liệu được thể hiện bời giá trị trung bình ± sai số chuẩn. Thử nghiệm ANOVA được dùng để phân tích số liệu. Khác biệt giữa các giá trị được xem là có ý nghĩa khi p < 0.05. Tất cả các số liệu được phân tích
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
bằng phần mềm Statgraphic Centurion XV (Statgraphics Centurion XV, Manugistics, Inc., Rockville, USA, 2009).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tối ƣu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản
Trong phân tích thực phẩm, việc trích xuất chất cần phân tích từ hỗn hợp mẫu ban đầu là điều cần thiết. Các mẫu thực phẩm dạng rắn thường được tách chiết bằng các dung môi có tính axit vì các chất này đồng thời cũng là chất loại bỏ protein trong quá trình tách lỏng – rắn. Vì hàm lượng cao lipid trong cá và các sản phẩm cá, các loại dung môi có thể loại bỏ lipid và protein thường được sử dụng để đạt hiệu quả ly trích cao nhất. Trong thí nghiệm này, perchloric acid (0.6M), trichloroacetic acid (6%, m/v), methanol (99%) được sử dụng như dung môi tách chiết histamine trong cá. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng histamine ở những mức độ khác nhau khi ly trích với những dung môi khác nhau.
Hình 4: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine thu đƣợc khi ly trích bằng các dung môi khác nhau. Met - methanol; PCA - perchloric acid (0.6M) và TCA -
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đối với các mẫu phân tích bằng quy trình dansyl, hàm lượng histamine cao nhất thu được khi ly trích mẫu với perchloric acid 0.6M. Các mẫu ly trích với trichloroacetic acid 6% và phân tích bằng quy trình benzoyl cho hàm lượng histamine cao hơn so với các mẫu được ly trích bằng hai loại dung môi còn lại. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Ben-Griggrey et al. (2001), khi đề nghị rằng perchloric acid và trichloroacetic acid hiệu quả hơn methanol, acetonitrile và acetone để ly trích histamine từ các sản phẩm cá. Ruiz-Capillas and Moral (2001) cũng đã báo cáo rằng PCA and TCA có hiệu quả cao trong ly trích các biogenic amine (bao gồm histamine) có trong cá và các sản phẩm cá vì ảnh hưởng của các dung môi này đến sự kết tủa protein. Ngoài ra, vì hầu hết các biogenic amine trong cá ở dạng bám, do đó khi ly trích bằng methanol hàm lượng histamine thu được là thấp (Shalaby et al., 1996). Trong nghiên cứu này, hàm lượng histamine trong cá thu được cao khi ly trích với dung môi có tính axit, chứng tỏ histamine có trong cá dễ tan trong môi trường axit. Vì perchloric acid và trichloroacetic acid cho kết quả sắc ký tốt và hiệu quả khi phân tách, hai loại axit này được sử dụng như dung môi ly trích tối ưu cho các thí nghiệm sau. Perchloric acid 0.6M được sử dụng để ly trích histamine và phân tích bằng quy trình dansyl, trong khi trichloroacetic acid 6% được sử dụng để ly trích và phân tích histamine bằng quy trình benzoyl.
4.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản trong hải sản
Trong số các phương pháp phân tích hiện có, HPLC là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tách và định lượng histamine. Vì histamine có trong thực phẩm không thể hiện một bước sóng đặc trưng nào, do đó quá trình tạo dẫn xuất cần được thực hiện để việc định lượng nồng độ histamine bằng UV, VIS hay huỳnh quang có thể thực hiện (Onal, 2007). Trong thí nghiệm này, histamine được định lượng bởi phương pháp HPLC bằng cách dùng hai quy trình – quy trình dansyl và quy trình benzoyl – dựa trên phương pháp tạo dẫn xuất trước phân tách. Ở cả hai phương pháp, cột rửa giải pha nghịch được sử dụng để phân tách histamine. Sắc ký đồ của histamine chuẩn và dịch ly trích của mẫu cá ngừ phân tích bởi quy trình dansyl và quy trình benzoyl được thể hiện ở Hình 2. Histamine được rửa giải hoàn toàn sau gần ba phút khi phân tích với quy trình benzoyl, trong khi đó thời gian để rửa giải hoàn toàn histamine khi phân tích với quy trình dansyl là năm phút. Các đỉnh histamine được thể
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hiện trên sắc ký đồ với hình dạng đỉnh rõ nét, có tính đối xứng cao và phù hợp với các báo cáo trước đó (Hwang et al., 1997). Tuy nhiên, hàm lượng histamine định lượng ở các mẫu cá ngừ cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình (Hình 3). Nhìn chung, hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình benzoyl cao hơn hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình dansyl (5/6 mẫu phân tích). Ở mẫu thứ ba, hàm lượng histamine định lượng bằng quy trình benzoyl có giá trị thấp hơn khi định lượng bằng quy trình dansyl (52.51 mg/kg so với 52.96 mg/kg). Tuy nhiên, khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Hình 5: Sắc ký đồ của dung dịch histamine chuẩn và dung dịch mẫu ly trích. (A), (C): Histamine chuẩn (1 µg/ml); (B), (D) mẫu cá ngừ trữ ở 7 ngày. (A) and (B): sắc ký đồ của quy trình benzoyl; (C) and (D): sắc ký đồ của quy trình dansyl; (*):
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 6: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine định lƣợng bằng quy trình dansyl và quy trình benzoyl.
Kết quả của thí nghiệm cho thấy rằng quy trình benzoyl cho kết quả chính xác hơn so với quy trình dansyl trong định lượng histamine trong cá. Điều này có thể giải thích là do benzoyl chloride tạo thành hợp chất bền sau phản ứng với cả nhóm amine thứ nhất và thứ hai của phân tử histamine và sản phẩm của phản ứng bền hơn so với khi tạo dẫn xuất với dansyl chloride. Thời gian tạo dẫn xuất dài cũng là nhược điểm của quy trình dansyl, vì nó làm làm giảm độ bền của hợp chất huỳnh quang. Ngoài ra, ammonia cũng cần được sử dụng để loại bỏ lượng dư dansyl chloride sau khi tạo dẫn xuất. Nếu không có bước này, những sản phẩm phụ như dansylamide (Dns-NH2), dansyl sulphonic acid (Dns-OH) và dansyl hydrazine (Dns-N2H3) thường xuất hiện trên sắc ký đồ (De Mey et al., 2011). Bên cạnh đó, lượng dư dansyl chloride cũng có thể bị tách cùng với histamine. Do đó, việc thêm vào 100 µl ammonia – như mô tả của
