thời gian và nhiệt độ bảo quản
Lượng histamine sinh ra trong cơ thể cá bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thời gian, điều kiện bảo quản và tùy từng loại cá (Lehane and Olley, 1999). Thí nghiệm này được tiến hành nhằm nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng histamine và mật số vi khuẩn ở cá ngừ ở hai nhiệt độ bảo quản (0oC và 4oC).
- Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hàm lượng histamine:
Hàm lượng histamine có trong mẫu cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản được trình bày ở Hình 3 – 4. Ở các mẫu trữ ở 4oC, hàm lượng histamine tăng từ 36.93 mg/kg đến hơn 161.29 mg/kg. Sự tăng hàm lượng histamine này có ý nghĩa thống kê ở mức 5% và hàm lượng histamine ở ngày thứ ba cao hơn so với hàm lượng cho phép của FDA (> 50 mg/kg). Trong các mẫu trữ ở 0oC, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng histamine cũng tăng theo thời gian trữ, mặc dù sự tăng hàm lượng histamine không nhanh như khi trữ ở nhiệt độ 4oC. Tuy nhiên, hàm lượng histamine của các mẫu bảo quản ở 0oC không vượt quá giới hạn cho phép của FDA (< 50 mg/kg). Kết quả
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
cũng cho thấy hàm lượng histamine tăng có ý nghĩa, ngoại trừ hàm lượng histamine ở ngày 11.
Hình 7: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian bảo quản.
Hình 8: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0o
C theo thời gian bảo quản.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Dựa vào kết quả thí nghiệm, nhiệt độ bảo quản là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành histamine. Thời gian và nhiệt độ cũng đã được báo cáo như là những yếu tố chính trong việc kiểm soát sự gia tăng hàm lượng histamine, vì các yếu tố này có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn sinh histamine và enzyme histidine carboxylase (FDA, 2001). Hàm lượng histamine tăng ít ở các mẫu trữ ở 0oC, trong khi các mẫu trữ ở 4oC lại có hàm lượng histamine vượt quá giới hạn cho phép sau ba ngày trữ. Nghiên cứu của Haaland et al. (1990) cho thấy mối quan hệ giữa sự hình thành các axit amin tự do và các amine trong cá thu bảo quản ở 0oC và 4oC. Hàm lượng của một số axit amin giảm khi cá được bảo quản ở 4oC với kết quả là sự hình thành phenylethylamine, tyramine, putrescine, histamine và cadaverine. Tuy nhiên, không có những thay đổi rõ ràng khi cá được bảo quản ở 0oC. Wendakoon et al. (1990) đã báo cáo kết quả tương tự với lượng thấp histamine hình thành trong quá trình bảo quản cá thu ở 0oC, nhưng hàm lượng cao histamine lại được phát hiện khi bảo quản ở 8oC. Hàm lượng histamine tương tự như kết quả của thí nghiệm này cũng đã được báo cáo bởi Guizani et al. (2005) trên cá ngừ vây vàng. Hàm lượng histamine trên cá ngừ vây vàng trữ ở 4oC là 150 mg/kg sau 8 ngày trữ, còn trong nghiên cứu này là 161.29 mg/kg sau 7 ngày trữ. Kết quả thí nghiệm này cũng phù hợp với kết quả của Kim et al. (1999), khi phát hiện hàm lượng thấp histamine (80 mg/kg) trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC trong 18 ngày. Lopez-Sabater et al. (1996) cũng đã phát hiện histamine trong các mẫu cá ngừ đại dương, với hàm lượng histamine đạt 425 mg/kg sau 6 ngày trữ ở 8oC, tuy nhiên khi trữ các mẫu cá này ở 0oC trong 12 ngày thì không có lượng histamine nào được tìm thấy. Frank và Yoshinaga (1987) đã báo cáo hàm lượng histamine lần lượt là 3.8 mg/kg, 5.6mg/kg, và 169 mg/kg ở cá ngừ vằn khi trữ ở các mức nhiệt độ 0oC, 4oC, and 10oC trong vòng 12 – 14 ngày, thấp hơn so với kết quả thu được trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, hàm lượng histamine ban đầu trong các mẫu cá ngừ vằn trong nghiên cứu của Frank và Yoshinaga chỉ là 1.1 mg/kg, trong khi đó lượng histamine ban đầu trong nghiên cứu này là từ 27 – 37 mg/kg.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 9: Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4o
C theo thời gian bảo quản.
Hình 10: Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian bảo quản.
Tổng số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian bảo quản được thể hiện ở Hình 4. Tại thời điểm ban đầu, tổng số vi khuẩn thấp (4.54 log10 cfu/g). Theo thời gian, mật số vi khuẩn này tăng lên 8.88 log10 cfu/g. Có thể sự tăng nhanh
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
mật số vi khuẩn có ảnh hưởng đến sự tăng nhanh hàm lượng histamine ở mức nhiệt độ này. Nghiên cứu của Kim et al. (1999) cho thấy số lượng vi khuẩn gián tiếp liên quan đến sự hình thành histamine bởi khả năng cung cấp các enzyme histidine dercarboxylase. Các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC cũng cho thấy sự tăng mật số vi khuẩn, tuy nhiên mức độ tăng thấp hơn nhiều so với các mẫu trữ ở 4oC, có thể điều này ảnh hưởng đến hàm lượng thấp histamine trong các mẫu trữ ở 0o
C.
Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng ngay cả ở những mức nhiệt độ thấp như trên, khi thời gian lưu trữ tăng lên, có sự thay đổi tương đối số lượng các vi sinh vật và ảnh hưởng trực tiếp đến sự hình thành histamine trong cá. Khi cá được trữ ở nhiệt độ 4o
C, một số loài vi sinh vật vẫn có khả năng phát triển mạnh mẽ, qua đó làm gia tăng hàm lượng histamine. Trong khi đó, quá trình đông lạnh tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của các vi sinh vật hay bất hoạt chúng, do đó làm sự hình thành histamine ở 0oC thấp hơn rất nhiều so với ở 4oC. Baranowski et al. (1990) cho rằng thời gian đông lạnh là một yếu tố quan trọng đến sự hình thành histamine trong quá trình bảo quản cá mahi – mahi. Khi Staruszkiewicz et al. (2004) nghiên cứu sự thay đổi của một số biogenic amine trong cá mahi – mahi và cá ngừ bảo quản ở nhiệt độ 2- 4oC, họ cho rằng enzyme histidine decarboxylase vẫn hoạt động trong một vài mẫu cá và có thể làm tăng hàm lượng histamine. Ben-Gigirey et al. (1998) báo cáo rằng sự tồn tại thấp của các vi khuẩn sinh biogenic amine ở nhiệt độ 0oC. Gần đây, Dalgaard et al. (2006) đã đánh giá sự hình thành các biogenic amine và sự phát triển của vi khuẩn trong các mẫu cá nhái tươi và đông lạnh. Kết luận của nghiên cứu trên cho rằng hàm lượng histamine sinh ra phụ thuộc mạnh mẽ vào thời gian đông lạnh của cá, có thể làm chết các vi khuẩn nhạy cảm với nhiệt độ đông lạnh như Photobacterium spp. hay
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4.4 Xác định hàm lƣợng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản
Bảng 4. Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine trong các mẫu hải sản.
Mẫu Hàm lượng histamine (mg/kg)
Cá ngừ tươi 36.1 Cá cam tươi 38.9 Cá thu tươi 39.2 Cá thu đóng hộp 1 Cá ngừ đóng hộp 3 Cá nục khô 58.2 Tôm khô 61.7
Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu thủy sản trong thí nghiệm này được trình bày ở Bảng 4. Kết quả thu được cho thấy các mẫu thủy sản này có những hàm lượng histamine khác nhau. Hàm lượng histamine có trong ba mẫu cá tươi gồm cá ngừ, cá thu và cá cam lần lượt là 36.1, 38.9 và 39.2 mg/kg, rất gần với hàm lượng histamine tối đa cho phép theo tiêu chuẩn của FDA (50 mg/kg), điều này thể hiện histamine trong các mẫu cá này đã tăng trong quá trình bảo quản và sơ chế, do đó là mối nguy đối với người tiêu dùng. Ngoài ra, kết quả thí nghiệm cho thấy cần có sự kiểm soát chặt chẽ trong quá trình sơ chế và bảo quản các mẫu cá này. Theo đề nghị của FDA, sau khi làm đông các loại cá tươi không nên để ở nhiệt độ >4.4oC trong hơn 4 giờ. Bên cạnh đó, đã có những bằng chứng cho thấy thậm chí ở nhiệt độ 0-5oC một số loài vi khuẩn có thể tạo ra lượng histamine đủ để gây ngộ độc (Dalgaard et al., 2008). FDA (2001) cho rằng cá tươi có chất lượng tốt nhất khi hàm lượng histamine thấp hơn 10 ppm, trong khi cá có hàm lượng histamine từ 10 đến 30 ppm được xem như có chất lượng tốt và hàm lượng histamine từ 30 – 50 ppm được xem như gần với giới hạn của FDA (50 mg/kg). Theo tiêu chuẩn trên thì các mẫu cá ngừ, cá thu và cá cam tươi có hàm lượng histamine gần với hàm lượng tối đa cho phép, nghĩa là các mẫu cá này có thể gây ngộ độc cho người tiêu dùng nếu thời gian bảo quản dài thêm (Craven et al., 2001).
Cá ngừ và cá thu đóng hộp thường được gắn với các trường hợp ngộ độc histamine, đặc biệt với những sản phẩm lưu trữ trong thời gian dài (Taylor, 1986).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Histamine rất bền với nhiệt, do đó sự hiện diện của hàm lượng histamine trong các sản phẩm đóng hộp cho thấy cá đã bị vi khuẩn làm hỏng trước khi được chế biến. Mẫu cá ngừ và cá thu đóng hộp phân tích trong nghiên cứu này có hàm lượng histamine thấp (1 và 3 mg/kg), chứng tỏ rằng các mẫu cá này đã được bảo quản và chế biến đúng quy cách. Kết quả trên cũng phù hợp với nghiên cứu của Fernández-Salguero và Mackie (2002), với hàm lượng thấp histamine (< 2 mg/kg) trong các mẫu cá ngừ, cá thu và cá trích đóng hộp.
Hàm lượng histamine trong các mẫu cá nục khô và tôm khô là cao nhất trong thí nghiệm này, lần lượt là 58.2 và 61.7 mg/kg. Kết quả này cao hơn giá trị histamine cao nhất cho phép theo FDA (> 50 mg/kg), cho biết chất lượng của các mẫu này là mối nguy đối với người tiêu dùng. Ở những nước nhiệt đới như Việt Nam, phương pháp làm khô để bảo quản thực phẩm đã có từ lâu (Beddows, 1985). Quá trình làm khô có thể ngắn (1-2 ngày) hay dài (3-4 tuần), tùy thuộc vào loại thực phẩm và các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme decarboxylase có khả năng hiện diện (Beddows, 1985). Trong quá trình này, hoạt động của các vi khuẩn diễn ra phức tạp và do đó hàm lượng cao histamine có thể được tìm thấy ở các mẫu này. Ngoài ra, sự hiện diện của glucono-δ-lactone (GDL) trong thủy sản khô cũng có ảnh hưởng đến sự gia tăng hàm lượng histamine. GDl làm giảm pH trong các sản phẩm này, qua đó làm tăng hoạt tính của enzyme dercarboxylase. Hoạt tính của các enzyme dercarboxylase mạnh hơn trong điều kiện môi trường có tính axit, với pH tối ưu trong khoảng 4.0 đến 5.5. Trong điều kiện này, vi khuẩn sinh nhiều enzyme decarboxylase như là một phần cơ chế bảo vệ của chúng, kết quả là làm gia tăng hàm lượng histamine. Bên cạnh đó, nghiên cứu của Veciana-Nogues et al. (1989, 1997) và Ganowiak et al., (1991) cho thấy quá trình làm khô làm tăng sự phá hủy protein, và qua đó cũng làm gia tăng hàm lượng histamine.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Dung môi tối ưu cho ly trích histamine trong thủy sản là perchloric acid 0.6M và trichloroacetic acid 6%.
Quy trình benzoyl cho hiệu quả tốt hơn quy trình dansyl trong phân tích histamine trong thủy sản.
Cá được bảo quản ở nhiệt độ 0oC làm giảm sự hình thành histamine hơn khi cá được bảo quản ở nhiệt độ 4o
C. Ngoài ra, vi sinh vật cũng phát triển nhanh hơn khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC so với khi bảo quản ở nhiệt độ 0oC.
Kết quả phân tích hàm lượng histamine trong bảy mẫu thủy sản phổ biến trên thị trường cho thấy có hai mẫu cá nục khô và tôm khô có hàm lượng histamine vượt quá so với tiêu chuẩn của FDA.
5.2. Kiến nghị
Sử dụng quy trình tìm được để kiểm tra hàm lượng histamine trong các mẫu hải sản tươi và sản phẩm hải sản.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
Bộ Thủy Sản. 2003. Đảm bảo chất lượng thủy sản. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
Bộ Thủy Sản. 2004. Cá tươi chất lượng và các biến đổi về chất lượng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
TCVN: 28TCN 198 – 2004. Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 198:2004 về histamin trong sản phẩm thủy sản - Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao do Bộ Thuỷ sản ban hành.
Tiếng Anh:
Ababouch, L. 1991. Histamine food poisoning: an update. Fish Technology News, 11: 3-5, 9.
AOAC. 1995. Fish and other marine products. Official methods of analysis (Vol.2). Virginia: Association of Official Analytical Chemists.
Auerswald, L., C. Morren and AL. Lopata. 2006. Histamine levels in seventeen species of fresh and processed South African seafood. Food Chem., 98, 231. Baranowski, B.L. et al. 1990. Efects of storage time and temperature on the microfora
and amine development in Spanish mackerel (Scomberomorus maculatus), J. Food Sci., 53, 1024.
Bardocz, S. et al. 1995. The importance of dietary polyamines in cell regeneration and growth. British Journal Nutrition: 73, 819.
Batange, S.B., M.K. Mukundan and K.A Kumar. 2005. A simple and rapid method for colorimetric determination of histamine in fish flesh. Food Control, 16(5): 465- 472.
Beddows, M.H. 1985. Biogenic amines: Their importance in foods. Int. J. Food Microbiol., 29, 213.
Befus, A.D., C. Mowat, M. Gilchrist, J. Hu, S. Solomon and A. Bateman. 1999. Neutrophil defensing induce histamine secretion from mast cells: mechanisms of action. The Journal of Immunology, 163: 947-953.
Ben-Gigirey, B., J.M.V.B. de Sousa and T.G Villa. 2000. Characterization of biogenic amine-producing Stenotrophomonas maltophilia strains isolated from white
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
muscle of fresh and frozen albacore tuna. International Journal of Food Microbiology, 57: 19-31.
Bodmer, S., C. Imark and M. Kneubuhl. 1999. Biogenic amines in foods: histamine and food processing. Inflammation Research, 48(6): 296-300.
Chen, J., R. Hesterberg, W. Lorenz, U. Schmidt, M. Crombach and C.D. Stahlknecht. 2003. Inhibition of human and canine diamine oxidase by drugs used in an intensive care unit: relevance for clinical side effects?. Inflammation Research, 16(3-4): 91-94.
Chu, C.H., and L.F Bjeldanes. 1981. Effects of diamines, polyamines and tuna fish extracts on the binding of histamine to mucin in vitro. Journal of Food Science, 47: 79-80, 88.
Commission Regulation (EC). 2005. No. 2073/2005 of 15 November 2005 on microbiological criteria for foodstufs.
Connell, J.J. 1990. Control of Fish Quality 3rd ed. Fishing New Books, Oxford.
Craven, C., K. Hilderbrand, E. Kolbe, G. Sylvia, M. Daeschel, B. Gloria and H.J. An. 2001. Understanding and controlling histamine formation in troll-caught albacore tuna: a review and update of preliminary findings from the 1994 season. Oregon State University Sea Grant, Oregon. Publication No. ORESU-T-01-001.
Cseinati and Forgacs, 1999. Histamine food poisoning: an update. Fish Technology News, 11: 3-5, 9.
Dalgaard, M., T.K, Smith, and A. Harris. 2006. High performance liquid chromatographic method for detection of biogenic amines in feedstufs, complete feeds and animal tissues. J. Agric. Food Chem., 48, 1708.
De Mey, J.E., W.R. Hutkins and S.L. Taylor. 2011. Biogenic amines in cheese and other fermented foods: a review. Journal of Food Protection, 54: 460-470.
Du, W.X. 1976. Development of biogenic amines in yellowfn tuna (Tunnus albacore): Efect of storage and correlation with decarboxylase-positive bacterial flora. J. Food Sci., 67, 292.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Durand, G., B. Lebel, M. Mordelet-Dambrine and J.L. Parrot. 1973. Histamine inactivation by binding. In: Histamine (Maslinski, C., ed.), Dowden, Hutchinson & Ross, Pennsylvania pp. 149-160.
Earola, M., F. Szlam, J.T. Holden, K. Yamaguchi, D. Denson and J.H. Levy. 1993. Mechanisms of non-immunological histamine and tryptase release from human cutaneous mast cells. Anesthesiology, 92(4): 1074-1081.
Eitenmiller, R.R., J.H. Orr and W.W. Wallis. 1982. Histamine formation in fish: microbiological and biochemical conditions. In: Chemistry and Biochemistry of Marine Food Products (Martin, R.E., Flick, G.J., Hebard, C.E., and Ward, D.R., eds.), Avi Publishing Company, Connecticut pp. 39-50.
Emborg, J. et al. Microbial spoilage and formation of biogenic amines in fresh and