Trong phân tích thực phẩm, việc trích xuất chất cần phân tích từ hỗn hợp mẫu ban đầu là điều cần thiết. Các mẫu thực phẩm dạng rắn thường được tách chiết bằng các dung môi có tính axit vì các chất này đồng thời cũng là chất loại bỏ protein trong quá trình tách lỏng – rắn. Vì hàm lượng cao lipid trong cá và các sản phẩm cá, các loại dung môi có thể loại bỏ lipid và protein thường được sử dụng để đạt hiệu quả ly trích cao nhất. Trong thí nghiệm này, perchloric acid (0.6M), trichloroacetic acid (6%, m/v), methanol (99%) được sử dụng như dung môi tách chiết histamine trong cá. Kết quả thu được cho thấy hàm lượng histamine ở những mức độ khác nhau khi ly trích với những dung môi khác nhau.
Hình 4: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine thu đƣợc khi ly trích bằng các dung môi khác nhau. Met - methanol; PCA - perchloric acid (0.6M) và TCA -
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đối với các mẫu phân tích bằng quy trình dansyl, hàm lượng histamine cao nhất thu được khi ly trích mẫu với perchloric acid 0.6M. Các mẫu ly trích với trichloroacetic acid 6% và phân tích bằng quy trình benzoyl cho hàm lượng histamine cao hơn so với các mẫu được ly trích bằng hai loại dung môi còn lại. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Ben-Griggrey et al. (2001), khi đề nghị rằng perchloric acid và trichloroacetic acid hiệu quả hơn methanol, acetonitrile và acetone để ly trích histamine từ các sản phẩm cá. Ruiz-Capillas and Moral (2001) cũng đã báo cáo rằng PCA and TCA có hiệu quả cao trong ly trích các biogenic amine (bao gồm histamine) có trong cá và các sản phẩm cá vì ảnh hưởng của các dung môi này đến sự kết tủa protein. Ngoài ra, vì hầu hết các biogenic amine trong cá ở dạng bám, do đó khi ly trích bằng methanol hàm lượng histamine thu được là thấp (Shalaby et al., 1996). Trong nghiên cứu này, hàm lượng histamine trong cá thu được cao khi ly trích với dung môi có tính axit, chứng tỏ histamine có trong cá dễ tan trong môi trường axit. Vì perchloric acid và trichloroacetic acid cho kết quả sắc ký tốt và hiệu quả khi phân tách, hai loại axit này được sử dụng như dung môi ly trích tối ưu cho các thí nghiệm sau. Perchloric acid 0.6M được sử dụng để ly trích histamine và phân tích bằng quy trình dansyl, trong khi trichloroacetic acid 6% được sử dụng để ly trích và phân tích histamine bằng quy trình benzoyl.
4.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản trong hải sản
Trong số các phương pháp phân tích hiện có, HPLC là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất để phân tách và định lượng histamine. Vì histamine có trong thực phẩm không thể hiện một bước sóng đặc trưng nào, do đó quá trình tạo dẫn xuất cần được thực hiện để việc định lượng nồng độ histamine bằng UV, VIS hay huỳnh quang có thể thực hiện (Onal, 2007). Trong thí nghiệm này, histamine được định lượng bởi phương pháp HPLC bằng cách dùng hai quy trình – quy trình dansyl và quy trình benzoyl – dựa trên phương pháp tạo dẫn xuất trước phân tách. Ở cả hai phương pháp, cột rửa giải pha nghịch được sử dụng để phân tách histamine. Sắc ký đồ của histamine chuẩn và dịch ly trích của mẫu cá ngừ phân tích bởi quy trình dansyl và quy trình benzoyl được thể hiện ở Hình 2. Histamine được rửa giải hoàn toàn sau gần ba phút khi phân tích với quy trình benzoyl, trong khi đó thời gian để rửa giải hoàn toàn histamine khi phân tích với quy trình dansyl là năm phút. Các đỉnh histamine được thể
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hiện trên sắc ký đồ với hình dạng đỉnh rõ nét, có tính đối xứng cao và phù hợp với các báo cáo trước đó (Hwang et al., 1997). Tuy nhiên, hàm lượng histamine định lượng ở các mẫu cá ngừ cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình (Hình 3). Nhìn chung, hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình benzoyl cao hơn hàm lượng histamine phân tích bằng quy trình dansyl (5/6 mẫu phân tích). Ở mẫu thứ ba, hàm lượng histamine định lượng bằng quy trình benzoyl có giá trị thấp hơn khi định lượng bằng quy trình dansyl (52.51 mg/kg so với 52.96 mg/kg). Tuy nhiên, khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p<0.05).
Hình 5: Sắc ký đồ của dung dịch histamine chuẩn và dung dịch mẫu ly trích. (A), (C): Histamine chuẩn (1 µg/ml); (B), (D) mẫu cá ngừ trữ ở 7 ngày. (A) and (B): sắc ký đồ của quy trình benzoyl; (C) and (D): sắc ký đồ của quy trình dansyl; (*):
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 6: Giá trị trung bình hàm lƣợng histamine định lƣợng bằng quy trình dansyl và quy trình benzoyl.
Kết quả của thí nghiệm cho thấy rằng quy trình benzoyl cho kết quả chính xác hơn so với quy trình dansyl trong định lượng histamine trong cá. Điều này có thể giải thích là do benzoyl chloride tạo thành hợp chất bền sau phản ứng với cả nhóm amine thứ nhất và thứ hai của phân tử histamine và sản phẩm của phản ứng bền hơn so với khi tạo dẫn xuất với dansyl chloride. Thời gian tạo dẫn xuất dài cũng là nhược điểm của quy trình dansyl, vì nó làm làm giảm độ bền của hợp chất huỳnh quang. Ngoài ra, ammonia cũng cần được sử dụng để loại bỏ lượng dư dansyl chloride sau khi tạo dẫn xuất. Nếu không có bước này, những sản phẩm phụ như dansylamide (Dns-NH2), dansyl sulphonic acid (Dns-OH) và dansyl hydrazine (Dns-N2H3) thường xuất hiện trên sắc ký đồ (De Mey et al., 2011). Bên cạnh đó, lượng dư dansyl chloride cũng có thể bị tách cùng với histamine. Do đó, việc thêm vào 100 µl ammonia – như mô tả của Eerola et al. (1993) – là không đủ để loại bỏ hoàn toàn lượng dansyl chloride dư. Kết quả là một lượng thấp những sản phẩm phụ có thể xuất hiện trên sắc ký đồ và ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Khác với quy trình dansyl, quy trình benzoyl ít được sử dụng hơn trong phân tích histamine trong cá và sản phẩm cá. Tuy nhiên, việc tạo dẫn xuất benzoyl nhanh làm cho thời gian phân tích được rút ngắn. Việc tạo dẫn xuất benzoyl thường được tiến
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hành ở nhiệt độ biến thiên từ nhiệt độ phòng đến 70oC. Tại mức nhiệt độ phòng, quá trình tạo dẫn xuất cần thời gian ủ dài, trong khi khi tăng nhiệt độ thời gian ủ chỉ từ 15 (Krause et al., 1995) đến 30 phút (Chen, 2003). Trong đa số các trường hợp, thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ 70oC được đề nghị (Romero et al., 2000). Việc tạo dẫn xuất theo cách này sẽ thu được nồng độ cao nhất của histamine và vì lượng dư benzoyl chloride được tách khỏi histamine trên sắc ký đồ, việc định lượng histamine sau đó trở nên dễ dàng hơn. Khác với quy trình dansyl (ở nhiệt độ cao hơn 65oC, các dẫn xuất amine dễ dàng bị phá hủy), Dadáková et al. (2009) đã báo cáo rằng ở nhiệt độ cao lượng dư benzoyl chloride được giảm đi nhiều mà không ảnh hưởng đến lượng histamine cần phân tích. Một thuân lợi khác của việc tạo dẫn xuất với benzoyl chloride là việc dừng phản ứng rất dễ dàng. Trong khi việc thêm ammonia là cần thiết để dừng phản ứng tạo dẫn xuất với dansyl chloride thì quy trình tạo dẫn xuất với benzoyl chloride chỉ cần làm lạnh là phản ứng đã kết thúc.
Vì quy trình benzoyl cho kết quả tốt hơn, cũng như nhanh và dễ thực hiện hơn quy trình dansyl, quy trình này được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.