Thử nghiệm thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin suflate bằng phương pháp sử dụng enzym neutrase

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYM NEUTRASE ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƯƠNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI KHÁNH HÒA - 2015 BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYM NEUTRASE ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã số sinh viên : 53130367 Lớp : 53CNTP2 Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA - 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt tốt nghiệp này Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho: TS.Vũ Ngọc Bội - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, TS. Nguyễn Duy Nhứt – Viện nghiên cứu khoa học và công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp để em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian làm đề tài tại phòng thí nghiêm. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của gia đình và bạn bè luôn luôn chia sẻ cùng em trong quá trình nghiên cứu. ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................................viii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN BỐ VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁ ĐUỐI ........................................................................................................... 3 1.2 GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA SỤN ................................................................................................................... 5 1.2.1 Sụn động vật .................................................................................................. 5 1.2.2 Thành phần hóa học của sụn cá đuối ............................................................. 6 1.3 CHONDROITIN SULFATE .............................................................................. 6 1.3.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate............................................... 6 1.3.2 Ứng dụng của Chondroitin sulfate............................................................... 11 1.3.3 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate............................................... 13 1.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHONDROITIN SULFATE .................................................................................... 14 1.4.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate ................................................................................................ 14 1.4.2 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô .................................... 15 1.4.3 Khả năng chiết rút Chondroitin sulfate từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học ................................................................ 17 1.4.4 Xác định Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối ở Việt Nam ...................... 18 1.4.5 Xác định một số tính chất của Chondroitin sulfate ..................................... 18 1.5 ENZYM NEUTRASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN ............... 20 iii 1.6 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐÃ CÓ, NHỮNG VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU GIẢI QUYẾT ........................................................ 24 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 26 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU ...................................................................................... 26 2.1.1. Cá đuối bồng mõm nhọn ............................................................................. 26 2.1.2. Enzym neutras ............................................................................................. 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 26 2.2.1. Phương pháp phân tíchhóa học.................................................................... 26 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................................... 34 2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI .............................. 48 2.4 PHƯƠNG PHÁP SỬ LÝ SỐ LIỆU.................................................................. 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 49 3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NGUYÊN LIỆU.................... 49 3.1.1 Thành phần hóa học của sụn cá đuối ........................................................... 49 3.1.2 Xác định hoạt độ enzym neutrase ................................................................ 49 3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE................................................................. 49 3.2.1 Xác định tỉ lệ enzym neutrase bổ sung ........................................................ 49 3.2.2 Xác định nhiệt độ thích hợp......................................................................... 51 3.2.3 Xác định tỉ lệ nước thích hợp ...................................................................... 52 3.2.4 Xác định thời gian thủy phân thích hợp ...................................................... 54 3.2.5 Xác định pH thủy phân thích hợp ................................................................ 55 3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG ENZYM MEUTRASE .................................. 57 3.4 THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ĐỂ TẠO CS THEO QUY TRÌNH ĐÃ ĐỀ XUẤT ................................................................................... 59 3.5 NGHIÊN CỨU KẾT TỦA CHONDROITIN SULFATE ................................ 63 3.6 ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE .............................................................................................. 64 iv KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ......................................................................... 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 66 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 69 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tên các loại cá đuối ..................................................................................... 3 Bảng 1.2 Thành phần chính của mô sụn ..................................................................... 6 Bảng 1.3 Phân loại chondroitin sulfate ..................................................................... 11 Bảng 1.4 Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau ............................ 14 Bảng 1.5 So sánh khả năng chiết rút CS từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học .................................................................................. 17 Bảng 1.6 Hàm lượng CS trong các mẫu sụn cá đuối Việt Nam................................ 18 Bảng 1.7 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm CS .................................................... 19 Bảng 2.1 Bảng nồng độ xác định đường chuẩn tyrosin ............................................ 31 Bảng 3.1 Bảng thành phần hóa học của sụn cá đuối ................................................. 49 Bảng 3.2 Hàm lượng CS (mg) trong tủa thu được .................................................... 63 Bảng 3.3 Đánh giá quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzyme neutrase............. 64 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá đuối bồng mõm nhọn .............................................................................. 3 Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS. ....................................... 8 Hình 1.3 Cấu trúc mạch của các CS............................................................................ 8 Hình 1.4 Cấu trúc Chondroitin Sulfate A ................................................................... 9 Hình 1.5 Cấu trúc Chondroitin Sulfate B .................................................................. 10 Hình 1.6 Cấu trúc Chondroitin Sulfate C .................................................................. 10 Hình 2.1 Mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue ....... 32 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu ............................ 35 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ enzym bổ sung ..................................... 39 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp........................................ 41 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ nước thích hợp ..................................... 43 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp ...................................... 45 Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp. ............................................... 47 Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzym neutrase bổ sung đến hàm lượng CS tạo thành từ sụn cá........................................................................................................... 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutras .......................................................................................................... 51 Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước bổ sung đến hàm lượng CS tạo thành từ sụn cá ......................................................................................................................... 53 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutrase ........................................................................................................ 54 Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutrase ........................................................................................................ 56 Hình 3.6 Quy trình sản xuất chondirotin sulfate ....................................................... 58 Hình 3.7 Sụn cá đuối ................................................................................................. 59 Hình 3.8 Sụn cá đuối xay nhuyễn ............................................................................. 59 Hình 3.9 Bổ sung nước tỉ lệ 500%/100g ................................................................... 60 vii Hình 3.10 Xử lý nhiệt 1h........................................................................................... 60 Hình 3.11 Dịch sau thủy phân ................................................................................. 61 Hình 3.12 Dịch sau ly tâm......................................................................................... 61 Hình 3.13 Dịch sau tủa TCA .................................................................................... 61 Hình 3.14 Dịch sau lọc tủa TCA ............................................................................... 61 Hình 3.15 Dịch sau tủa cồn ....................................................................................... 62 Hình 3.16 Thu kết tủa CS .......................................................................................... 62 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A664 OD ở bước sóng 664 nm CĐ Cá đuối CPC Cetylpyridium chloride CS Chondroitin sulfate CS4 Chondroitin-4-sulfate CS6 Chondroitin-6-sulfate CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide MB Methylene blue GAG Glycosaminoglycan GalNAc N-acety-D-lgalactosamine OD Optical Density PG Proteoglycan TCA Tricloacetic 1 LỜI MỞ ĐẦU Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) là loại cá hiện được đánh bắt quanh năm nhưng giá trị kinh tế không cao. Hiện cá đuối bồng mõn chủ yếu để ăn tươi hoặc phơi khô. Cá đuối là loại cá sụn trong sụn có chứa Chondroitin sulfate. Chondroitin sulfate (CS) là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp, CS còn có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp. CS làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh dưỡng và sự vận động linh hoạt của khớp. Vì vậy, CS giúp giảm và ngăn chặn quá trình thoái hoá khớp [8]. CS còn có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng ức chế các enzym phá huỷ sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase [17]. Một trong những tác dụng quan trọng khác của CS là khả năng ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển. CS có khả năng kháng viêm và ức chế các gốc oxy hóa tự do [11]. Hiện nay các thuốc kết hợp CS và glucosamine đang được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp. Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên CS chưa được tổng hợp bằng con đường hóa học mới chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Những năm trước đây CS được tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, do đó giá thành rất cao. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu như từ da của cá Labeo rohita [18], cá mập [19], sụn gà [14], sụn bò [18]. Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau vẫn được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành sản phẩm. Nghiên cứu lựa chọn, ứng dụng enzym thay thế các chất hóa học trong quá trình thu nhận CS từ sụn động vật (đặc biệt các nguồn sụn thuỷ sản) là rất cần thiết để giảm độ độc hại trong khi sản xuất cũng như tăng chất lượng của chế phẩm CS. Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn mới mẻ, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này. Do vậy, em được giao thực hiện đề tài "Đánh giá 2 khả năng sử dụng enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản xuất chondroitin sulfate” có ý nghĩa thực tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà trong giai đoạn tới. Mục đích của đề tài: Đánh giá khả năng sử dụng enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản xuất chondroitin sulfate. Nội dung của đề tài: Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau: 1) Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase (tỉ lệ enzym,pH thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân, tỉ nước thích hợp) 2) Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin sulfate bằng enzym neutrase. 3) Thử nghiệm tạo chondroitin sulfate từ sụn cá đuối. Ý nghĩa khoa học của đề tài. - Các kết quả thu được của đề tài là cơ sở khoa học cho việc sử dụng neutrase trong thủy phân sụn cá để sản xuất CS và là tiền đề cho quá trình sản xuất CS từ sụn cá bằng công nghệ enzym. - Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho các nhà nghiên cứu các sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thuỷ sản. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: - Kết quả sẽ mở ra một hướng tận dụng sụn cá đuối sản xuất CS dùng cho con người. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của sụn cá. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN BỐ VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁ ĐUỐI 1.1.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.1 cá đuối bồng mõm nhọn Bảng 1.1 Tên các loại cá đuối TÊN LOẠI THỦY SẢN TÊN KHÁC (ĐỊA TÊN THƯƠNG MẠI TÊN KHOA HỌC PHƯƠNG) (TIẾNG ANH) (LATINH) Cá đuối quạt Cá đuối Holland kate, stringray fish Raja hollandi Cá đuối bồng đuôi vằn Cá đuối Blue spotted stingray fish Dasratis kuhlii Cá đuối bồng mõm nhọn Cá đuối Pake- edged stringray, stringray fish Dasyatis zugei Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt giống như cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn chủ yếu sinh sống ngoài biển, nghĩa là chúng có bộ xương không cấu tạo từ chất xương mà là từ chất sụn cứng và đàn hồi. Phần lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng, gọi là các khe 4 mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt. Phần lớn các loài cá đuối có 5 khe mang nhưng có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi ở cá nhám và cá mập thì các khe mang ở hai bên đầu. Phần lớn các loài cá đuối có thân phẳng, giống như cái đĩa bẹt, trong khi phần lớn các loài cá nhám có cơ thể thuôn động học. Nhiều loài cá đuối có các vây ngực phát triển thành các phần phụ rộng và bẹt, giống như cánh. Chúng không có vây hậu môn. Các mắt và các lỗ thở nằm trên đỉnh đầu. Cá đuối rất đa dạng, nặng từ vài kilôgam đến trên một tấn, dài từ vài chục centimet đến 6-7m, phần lớn là cá đáy, ăn chủ yếu các loài động vật trôi nổi, động vật đáy, thân mềm, giáp xác, cá con. Ở Việt Nam, đã phát hiện 33 loài, thuộc 16 chi, 10 họ. Loài có giá trị kinh tế đáng kể nhất: CĐ bồng gai (Dasyatis zugei) có thể dài đến 2m, được khai thác chủ yếu bằng lưới kéo đáy. Cá đuối xương của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai được. Bộ xương của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn. Phần lớn các loài cá đuối có các răng phát triển, nặng, thuôn tròn để nghiền nhai vỏ cửa các loài sinh vật tầng đáy như ốc, trai, hàu, động vật giáp xác, và một vài loài cá, phụ thuộc vào từng loài. Cá đuối được chia thành 2 bộ: - Bộ Cá đuối thường (Rajiformes) không có cơ quan phát điện. Bộ cá này trông giống như cá mập, có đuôi để bơi và các vây ức nhỏ hơn so với phần lớn các loài cá đuối khác. Các vây ức của chúng gắn với phần trên của mang như ở mọi loài cá đuối khác, làm cho chúng có bề ngoài với đầu rộng. Chúng có mõm dài, phẳng với một hàng các tấm răng ở cả hai hàm. Mõm chúng dài tới 1,8 mét (6 ft), và rộng 30 cm (1 ft), được dùng để chém và xiên qua các con cá nhỏ cũng như để thăm dò trong bùn nhằm tìm kiếm các sinh vật ẩn nấp trong đó. Một vài loài dài tới 6 mét (20 ft). Bộ CĐ thường gồm nhiều họ: CĐ đĩa (Platyrhinidae), CĐ bướm (Gymnuridae), ngoài ra còn có các họ cá ó, có hình dạng như hình con chim, là loài cá đắt nhất do thịt của chúng rất ngon như cá ó thường (Myliobatidae), cá ó dơi (Mobulidae), cá ó một hàng răng (Aetobatidae), cá ó mõm bò (Rhinopteridae). 5 - Bộ CĐ điện (Torpediniformes) có cơ quan phát điện, có hình dạng như cây đàn ghi ta, nếu đâm chúng bằng xiên sắt tay sẽ bị tê giật như điện giật. Cá đuối điện có các cơ quan phát ra điện trong các tấm vây ức. Bộ CĐ điện có 2 họ: CĐ điện hai vây lưng (Torpedinidae) và CĐ điện một vây lưng (Narkidae). 1.1.2 Đặc điểm phân bố Phần lớn các loài cá đuối sống tại đáy biển, trong các khu vực địa lý khác nhau nhiều loài trong vùng nước ven bờ, một vài loài tại vùng biển sâu tới độ sâu ít nhất là 3.000 m (9.800 ft), phần lớn các loài cá đuối có sự phân bố rộng khắp thế giới, trong các môi trường nhiệt đới và cận nhiệt đới, ôn đới hay vùng nước lạnh. Chỉ vài loài, như cá ó nạng hải (Manta birostris), là sinh sống ngoài biển khơi, và chỉ vài loài sinh sống trong vùng nước ngọt. Một số loài cá đuối có thể sống trong các vùng nước lợ và cửa sông. Các loài cá đuối sinh sống tại tầng đáy thở bằng cách lấy nước vào thông qua các lỗ thở, chứ không phải thông qua miệng như phần lớn các loài cá khác vẫn làm, và đẩy nước qua các mang ra ngoài. Cá đuối thường xuất hiện nhiều từ tháng giêng đến tháng ba âm lịch, xương của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai được. Bộ xương của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn. 1.2 GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA SỤN 1.2.1 Sụn động vật Sụn động vật là loại mô liên kết đặc tồn tại trong cơ thể động vật có xương sống, cũng như ở động vật không xương sống (sam, sên biển và động vật chân đầu (cephalopod)...) [9] Trong cơ thể người và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương sườn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống….Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành. Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết [19] Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của cả hai loại 6 sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes). Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [9] Bảng 1.2 Thành phần chính của mô sụn Mô Nước (%) Collagen (%) Proteoglycan (%) Sụn khớp 68,0 – 85,0 10,0 - 20,0 (loại I) 5,0-10,0 Sụn chêm 60,0 – 70,0 15,0 - 25,0 (loại II) 1,0- 2,0 Thành phần chính của hai loại sụn được thể hiện trong bảng 1.1. Ba thành phần chính này tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay đổi của các thành phần này (do bị bệnh lão hoá...) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào thời gian của sụn. Có tới 30% nước nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen. Kích thước sợi collagen và hàm lượng nước được xác định nhờ áp suất trương sinh ra do mật độ điện tích của các đại phân tử proteoglycan mang điện tích âm phân bố trong khối collagen. Sự gắn kết của proteoglycan ảnh hưởng đến trương lực và sự chuyển động của pha lỏng khi bị nén ép. Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn [9]. 1.2.2 Thành phần hóa học của sụn cá đuối Trong sụn cá đuối với hàm ẩm 65% thì có khoảng 13,8 % protein; 0,19% chất béo; 17,12% là chất khoáng và khoảng 3,61% là các hydrate cacbon khác [7]. 1.3 CHONDROITIN SULFATE 1.3.1 Đặc điểm và cấu trúc của Chondroitin sulfate CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do Davidson và Meyer. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đường (disaccharide) N-acetyl-Dgalactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D- 7 galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hoặc không bị sulfate hoá, một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA). CS là một polime có phân tử lớn gồm 15-150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối lượng phân tử của CS thường trong khoảng 10.000 - 100.000 Dalton [15]. Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các protein bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG) (glucoprotein), là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [16]. Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl (COO-) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có mật độ điện tích âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG. Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở một số protein. GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi. Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl- Gal-GalGlcA; xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [17]. CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao. Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được. Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá, bị sulfate hoá 1 lần hay 2 lần. Quá trình sulfate hoá là nhờ các enzym sulfotransferase đặc hiệu. Việc sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS. Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần cho sụn để chống lại 8 sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [16] Công thức hoá học của chondroitin sulfate (C14H21NO14S)n : Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS. Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H. Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2, R3 = H. Hình 1.3 Cấu trúc mạch của các CS Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide. Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulfate, CS6). Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic. Loại A và B (CS4) 9 thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates)...). Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/ mỗi cặp [19]. Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [15]. Chondroitin Sulfate A (GlcA-GalNAc-4S)-CS4n, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. Hình 1.4 Cấu trúc Chondroitin Sulfate A Chondroitin sulfate B (IdoA-GalNAc-4S) -CS4 Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid 10 . Hình 1.5 Cấu trúc Chondroitin Sulfate B Chondroitin Sulfate - C (GlcA-GalNAc-6S ) - CS6 Hình 1.6 Cấu trúc Chondroitin Sulfate C CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định. Vì vậy tên gọi của CS cũng có sự thay đổi. Ngoài ra còn có chondroitin sulfate D. Phân loại các CS được tóm tắt trong bảng 1.3. 11 Bảng 1.3: Phân loại chondroitin sulfate Tên Vị trí bị sulfate hoá Tên phân loại Chondroitin sulfate A Carbon 4 của đường - N- Chondroitin-4-sulfate (CS4) acety-D-galactosamine ở người có trong: sụn khớp, (GalNAc) giác mạc, da, thành mạch... Chondroitin sulfate B (Dermatant sulfate) Carbon 4 của GalNAc – L-iduronic acid Chondroitin-4-sulfate (CS4) Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc Chondroitin-6-sulfate (CS6) Chondroitin sulfate D Carbon 2 của glucuronic acid and 6 của GalNAc Chondroitin-2,6-sulfate (C2,S6) CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước vì thế rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone... Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn, khoảng 15000 - 20000 Dalton. 1.3.2 Ứng dụng của Chondroitin sulfate CS đã được sử dụng rộng rãi trong các loại chế phẩm bổ sung dinh dưỡng (dietary supplements) khác nhau trong thời gian dài và đang ngày càng được mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Thị trường chế phẩm bổ sung CS và glucosamine rất lớn. Trong một năm (1998-1999) doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD [8]. CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh lý cũng như trong các lĩnh vực khác. 1.3.2.1 Ứng dụng trong y học • Bệnh khớp (osteoarthritis): Nhiều nghiên cứu trên thế giới [5] cho thấy CS đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm khớp theo các cơ chế : - Giảm đau, kháng viêm, giảm sưng khớp do làm giảm tạo ra tân dịch. - CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp. - Tham gia vào cấu trúc tái tạo sụn khớp. 12 - Bảo vệ khớp ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, elastase, proteoglycanase, phospholipaseA2 và N-acetylglucosamindase; kích thích hoạt động các enzym xúc tác phản ứng tổng hợp hyaluronic acid giúp khớp hoạt động tốt [8]. Điều trị CS với liều 800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp [10]. Các nghiên cứu dược lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy CS được sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm trọng xảy ra [23]. • Bệnh mắt: CS là chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp và bồi bổ nội mô giác mạc, nuôi dưỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nước mắt trước giác mạc, tăng cường độ đàn hồi của thấu kính, chống tình trạng khô mắt. Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương thấu kính mắt. CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc [5]. Ngoài ra CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy thường được dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [5]. Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM (Việt Nam) sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi ... • Các bệnh khác CS của sụn cá mập được một số công trình nghiên cứu chứng minh là có khả năng ức chế một số loại ung thư. Vì từ sụn cá mập tinh chế chứa các chất có khả năng ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh mà các mô ung thư rất cần để phát triển, nên có thể hạn chế các khối u. CS cùng với mitomycin C có thể ức chế các tế bào ung thư. Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cường hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm (eczema), luput đỏ [5]. 13 Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cường kháng viêm, ức chế tiết các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid và các gốc oxy hóa tự do [11]. 1.3.2.2 Các ứng dụng khác CS có trong thành phần các mỹ phẩm (tác nhân dưỡng tóc, kem dưỡng và chất giữ ẩm…) [17]. CS còn có trong thành phần các chế phẩm chứa gelatin (thực phẩm, mỹ phẩm, thuốc, nguyên liệu công nghiệp và làm ảnh). CS còn có thể bổ sung để điều trị và ngăn tắc nghẽn động mạch, có tác động chống đông máu. CS có tác động điều khiển tế bào. CS làm tăng sinh một số loại tế bào bạch cầu, tăng tổng hợp RNA trong tế bào sụn nuôi cấy do đó làm tăng tổng hợp proteoglycogens và collagens, thúc đẩy sự tích luỹ hyalin trong gan và hạt lympho [23]. 1.3.3 Thu nhận và định lượng Chondroitin sulfate Cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp nên chưa thu nhận CS được bằng con đường tổng hợp hoá học, cho đến nay mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron thần kinh , còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên. Vì thế, hiện nay nguyên liệu CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập (xương sọ, xương sống, vây...) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh dưỡng. CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan. Cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu mối liên kết giữa CS-protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS. Hàm lượng CS được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau qua các phương pháp đã được mô tả và được tóm tắt trong bảng 1.3. 14 Bảng 1.4. Hàm lượng CS được tách từ các nguồn sụn khác nhau [7] STT Nguyên liệu CS4 (%) CS4 (%) Loại CS 1 Vây cá mập 9,60 ± 1,05 8,76 ± 0,96 CS6,CS4 Sụn lưỡi 14,84 ± 0,38 13,54 ± 0,35 CS6,CS4 Xương sườn 5,56 ± 0,96 5,08 ± 0,87 CS6,CS4 Xương ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 CS6,CS4 Cổ họng 9,51 ± 1,99 8,68 ± 1,81 CS6,CS4 3 Cá đuối 5,27 ± 0,91 4,81 ± 0,84 CS6,CS4 4 Xương lưỡi hái của gà 14,08 ± 2,51 13,38 ± 4,74 CS4,CS6 5 Sụn mũi bò 11,50 Cá sấu: 2 CS4, CS6 Như vậy hàm lượng CS trong các nguyên liệu sụn biến động từ khoảng 10,0 28,3%, phần lớn chứa cả 2 loại CS4 và CS6. 1.4 CƠ SỞ KHOA HỌC CHO VIỆC NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHONDROITIN SULFATE 1.4.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate a) Các nghiên cứu nước ngoài • C.W.Kang và các cộng sự trường đại học Konkuk, Hàn Quốc đã tiến hành nghiên cứu chiết xuất mucopolysacharide-protein chứa Chondroitin sulfate từ sụn gà và nhận thấy khi xử lý sụn với nhiệt (1000C, p < 0,01) trong 90 phút và sử dụng enzym acalase 2% thì thu được mucopolysacharide-protein. Tuy vậy chỉ mới thu được mucopolysacharide-protein cần tiếp tiếp tục thủy phân thu CS. • T. Anakano và L. Ozimek khoa thực phẩm và dinh dưỡng , Đại học Meji, Nhật Bản Nghiên đã tiến hành nghiên cứu phương pháp chiết xuất chondroitin sulphate-peptide từ sụn mũi trâu, bò và nhận thấy sử dụng HCL 6M ở 1100C trong 24h cho ra hiệu suất thu hồi CS cao. Tuy vậy công trình nghiên cứu sử dụng phương pháp 15 hóa học HCl làm ảnh hưởng chất lượng CS thu được mất gốc sulfate 4 của CS. • Xie, J., Ye, H. I. và Lou, X. F. Khoa dược phẩm, trường đại học công nghệ Trung Quốc đẫ tiến hành nghiên cứu cách chế tạo hiệu quả Chondroitin Sulfate và collagen từ sụn cá mập công trình tiến hành thử nghiệm trên nhiều loại enzym papain, acalase, neutrase, bromelain, pancreatic và nhận thấy neutrase cho hiệu quả thu CS cao nhất. Tuy nhiêu phương pháp phân tích rất phức tạp bằng sắt kí. • Vittayanon, M và Jroenviriyapap, T. Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Đại học Prince Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan đã tiến hành nghiên cứu Sản xuất chondroitin sulfate thô từ khí quản vịt và nhận thấy rằng kết hợp NaOH và enzym acalase để sản xuất CS. Tuy vậy tác giả đã sử dụng kiềm làm ảnh hưởng gốc sulfate 6 của CS • Somashekar P.L, Tripathy A. S, Sathish K.P, Chandrashekar Javali and Palakshi Gouda. Thư viện trường đại học dược, Ấn Độ đã nghiên cứu phương pháp định lượng Chondroitin Sulfate trong viên thuốc bằng cách so màu với thuốc thử Methylene Blue. b) Các nghiên cứu trong nước • Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú - Viện Công nghệ Sinh học.Trần Cảnh Đình Phòng sau thu hoạch đã tiến hành nghiên cứu tách chiết Chondroitin Sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis Kuhlii ) và cà nhám (Carcharhinus Sorrah ) bằng công nghệ sinh học và nhận thấy rằng sử dụng chế phẩm enzym từ vi sinh vật để tách chiết CS. Tuy vậy thời gian thủy phân kéo dài đến 48 giờ. • Vũ Thị Thanh Tâm và Võ Hoài Bắc, Đại học Nha Trang đã tiến hành nghiên cứu quy trình thu nhận Chondroitin Sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp sinh học và nhận thấy rằng sử dụng enzym thủy phân sụn cá đuối ở Việt Nam đã thu CS. Tuy vậy hiệu suất còn thấp, thời gian thủy phân dài 24 giờ. 1.4.2 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn. 16 Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…). Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS khi thu nhận CS. Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp có hiệu quả để thu nhận CS không bị biến đổi về cấu trúc, giữ được hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường do các hoá chất (muối, kiềm, acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain, actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết. Sau khi loại bỏ protein thì CS được tách ra và tinh sạch. Phương pháp này đã được dùng để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita , cá mập, cá sấu, cá đuối... Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và methanol, vì vậy có thể sử dụng các dung môi này để thu CS thô. Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa được hàm lượng CS cao nhất và tách CS với một số polysaccharide khác [22]. Chế phẩm CS thô thu được còn chứa một lượng tạp chất nào đó như collagen, cặn protein, hyaluronic acid, muối khoáng... Cho nên cần phải tiến hành các bước tinh sạch tiếp theo để loại các tạp chất trên. Để thu CS có thể sử dụng các muối của ammonium như cetylpyridium chloride (CPC) hoặc cetyltrimethylamnonium bromide (CTAB) để tạo phức tủa với các GAG và các polysacharid khác, các collagen phần lớn sẽ bị loại bỏ trong giai đoạn này . Các GAG gốc sulfate thấp trong phức hợp tủa CPC-GAG và CTAB- GAG đó sẽ bị hòa tan trong một số muối NaCl hoặc KCl nồng độ thấp (0,3-0,4M). Sau khi loại bỏ các GAG gốc sulfate thấp như hyaluronic acid, chỉ còn lại tủa CPC- GAG và CTABGAG chứa các GAG gốc sulfate cao, chủ yếu là CS. CS trong phức tủa CPC-GAG và CTAB-GAG sẽ được hòa tan phần lớn trong các muối nồng độ cao (0,9-2,0M KCl; 2,0M NaCl; 1N MgCl2 và 0,7N-1,5M MgSO4...) và tiếp tục được tinh chế bằng thẩm tích và kết tủa bằng dung môi để thu 17 CS tinh khiết. Scott đã mô tả cụ thể về phương pháp này và đây cũng là phương pháp hiệu quả để tách và tinh sạch các loại polysaccharide và nucleic acid [10]. Vì CS là một polyanion có điện tích âm (-) rất cao, nên CS rất dễ liên kết và bám dính trên các cột sắc ký. Vì vậy, còn có thể tinh sạch CS bằng sàng lọc phân tử nhờ các cột sắc ký trao đổi ion (DEAE-Sephacel, DOWEX 50...) hoặc bằng sắc ký lọc gel (Sepharose CL-6B, Sephacryl S-300...) [22]. 1.4.3 Khả năng chiết rút Chondroitin sulfate từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học So sánh chế phẩm CS tinh sạch sơ bộ theo nghiên cứu ở trên với chế phẩm CS tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp hóa học do phòng Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản cung cấp.[6] Bảng 1.5 So sánh khả năng chiết rút CS từ sụn cá bằng phương pháp hóa học và bằng phương pháp sinh học CS tinh sạch sơ bộ bằng các phương pháp khác nhau Phương pháp sinh học (sử dụng % khối lượng chế % CS/ khối % protein hòa phẩm CS/ khối lượng chế tan/khối lượng lượng sụn khô phẩm chế phẩm CS 28,2 ± 3,06 53,6 ± 4,5 4,8 ± 1,28 36,0 ± 1,12 32,6 ± 3,4 18,6 ± 2,61 36,2 ± 2,45 31,2 ± 2,9 21,4 ± 1,95 ETM tỷ lệ 0,7ml/10g sụn (hoạt độ: 0,96 UI/ml ETM); 55ºC, pH 5,5) Phương pháp hoá học: (sử dụng đệm acetat pH 4,5) Phương pháp kết hợp hóa học và sinh học: (sử dụng đệm acetat pH 4,5 enzym ETM 0,1%) Kết quả bảng 1.4.1 cho thấy chế phẩm CS chiết rút bằng phương pháp hóa học mặc dù cho khối lượng chế phẩm CS thô lớn hơn nhưng chất lượng CS tinh sạch thấp hơn, hàm lượng CS đạt khoảng 11,3-11,7% lượng sụn khô và hàm lượng 18 protein còn khá lớn (18-21%) [7]. 1.4.4 Xác định Chondroitin sulfate trong sụn cá đuối ở Việt Nam Sử dụng phương pháp MBMB để xác định hàm lượng CS trong mẫu sụn. Phương pháp dựa trên sự thay đổi phổ hấp thụ của dimethylmethylene blue khi gắn với các GAGs (glycosaminoglycans) [7]. Sử dụng CS4 và CS6 làm chất chuẩn đã chỉ ra sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ CS và phổ hấp thụ ở bước sóng 525nm. Phương pháp DMMB có độ nhạy cao có thể xác định CS với hàm lượng rất nhỏ (µg) [7]. Bảng 1.6 Hàm lượng CS trong các mẫu sụn cá đuối Việt Nam Mẫu sụn % CS/trọng lượngsụn khô Cá đuối (Dasyatis Kuhlii) 12,0 ± 1,54 Do CS liên kết với protein và là thành phần cấu tạo trong sụn, nên sụn cá cần phải được thủy phân để loại protein mới có thể xác định được hàm lượng CS. Sử dụng emzym để thủy phân mẫu sụn và dùng phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy hàm lượng CS trong sụn cá đuối là 12%. Hàm lượng CS trong cá đuối ở Việt Nam cũng gần tương đương với hàm lượng CS trong cá đuối (Dasyatis zugei) ở Thái Lan được Garnjanagoonchorn và cộng sự khảo sát. Garnjanagoonchorn cũng xác định hàm lượng CS trong sụn vi cá mập là khoảng 18,36% [19]. Như vậy nguyên liệu sụn cá đuối và cá nhám từ các nhà máy chế biến thủy sản Việt Nam có hàm lượng CS khá cao, đây là cơ sở để tiến hành nghiên cứu, khai thác nguồn dược liệu quý chondroitin sulfate. 1.4.5 Xác định một số tính chất của Chondroitin sulfate 1.4.5.1 Độ bền với nhiệt và acid của chế phẩm Chondroitin sulfate tinh Kết quả nghiên cứu trước cho thấy khi xử lý CS ở 50ºC và 70ºC chất lượng CS không thay đổi, khi tăng nhiệt độ tới 90ºC, hàm lượng CS trong chế phẩm chỉ giảm 3%. Kết quả trên cho thấy việc sản xuất tinh chế CS không cần phải ở nhiệt độ thấp, có thể sấy phun chế phẩm ở nhiệt độ 50ºC để tạo chế phẩm CS ở dạng bột nhỏ mịn [7]. 19 Kết quả nghiêm cứu trước cho thấy khi xử lý chế phẩm CS trong HCl 0,01M có pH=2 trong 1giờ, hàm lượng CS trong chế phẩm giảm khoảng 15% so với mẫu CS không xử lý. Như vậy khi CS được tiêu hóa và hấp thụ trong vùng pH acid của dạ dày, hàm lượng CS cũng không bị ảnh hưởng nhiều [7]. 1.4.5.2 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm Chondroitin sulfate Bảng 1.7 Một số chỉ tiêu phân tích chế phẩm CS [8] Tiêu chuẩn Đánh giá Theo tiêu chuẩn USA Thành phần chứa muối Na, 88,8 ± 1,41 90 hàm lượng CS (%) Màu sắc, độ hòa tan Bột trắng ngà, mịn, hòa tan Bột trắng hoặc gần trắng, tốt trong nước, không tan dễ hút ẩm, dễ tan trong trong ethanol và cetone nước, không tan trong ethanol và cetone Độ trong của dung dịch 2,5 0,206 ≤ 0,35 6,5 5,5 - 7,5 1,28 < 12 20,569 ≤ 20 0,39 ± 0,06 ≤ 6,0 < 2 ppm < 2 ppm g CS/50ml H2O không chứa CO2) OD ở 420nm pH (0,1g CS/25ml H2O không chứa CO2) Hàm ẩm (%) Tro sulfate (%) Protein (%) Kim loại nặng (Pb,Cd, Hg, As) 20 1.5 ENZYM NEUTRASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 1.5.1 Enzym Protease Enzym protease là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein, loại enzym này chỉ xúc tác cho quá trình thủy phân mà cơ chất chính là protein.Là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử protein tạo thành các polypeptide, các peptide ngắn mạch và acid amin. Các protease chiếm vị trí then chốt về chức năng sinh lý trong cơ thể sống đồng thời có tiềm năng ứng dụng thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% thị phần enzym công nghiệp toàn cầu [3]. Nguồn nguyên liệu để thu protease rất đa dạng và phong phú bao gồm các cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật. Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); Phycin từ nhựa cây cọ (Ficus carica); Keratinase thuỷ phân tóc và len... đã được nghiên cứu và thu nhận. Papain và Bromelin là những enzym thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (dược phẩm, mỹ phẩm, chế biến thực phẩm...). Việc sản xuất protease thực vật bị hạn chế vì phụ thuộc vào các yếu tố như diện tích và điều kiện khí hậu để trồng nguyên liệu, hơn nữa quy trình thu nhận enzym tốn nhiều thời gian. Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều như trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày..... Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu để thu các enzym này cũng bị hạn chế vì phụ thuộc nhiều vào sự phát triển của ngành chăn nuôi. Khối lượng protease thực vật và động vật thu được không có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thực tiễn cho nên các protease từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut...) đang được quan tâm đặc biệt. Riêng protease vi khuẩn chiếm trên 40% thị phần enzym toàn cầu. Đặc điểm ưu việt là chúng có tất cả các đặc tính cần thiết cho các ứng dụng về công nghệ sinh học, nguồn nguyên liệu lại vô cùng lớn, đa dạng và phong phú, hơn nữa quy trình thu nhận lại ít tốn kém về thời gian và chi phí, hạ được giá thành.... Trong phạm vi đề tài này chỉ đề cập tới nhóm protease của vi khuẩn là những vi sinh vật sản sinh nhiều loại protease ngoại bào đang được 21 ứng dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm, dệt may, tẩy rửa, thực phẩm và xử lý phế thải. Đa số các protease thương mại từ vi khuẩn chủ yếu thuộc loại enzym trung tính và kiềm được sản suất từ chi (giống) Bacillus. Các protease vi khuẩn trung tính hoạt động trong dải pH hẹp (pH 5-8) và nhiệt độ tương đối thấp, chúng làm giảm vị đắng (so với protease động vật) cho các sản phẩm thuỷ phân protein, có ái lực cao với các amino acid kỵ nước nên nó được ưa chuộng cho công nghệ chế biến thực phẩm và sữa. Một số protease trung tính thuộc protease chứa kim loại nên đòi hỏi các ion kim loại hoá trị 2 cho hoạt động của chúng. [4]. 1.5.2 Emzym neutrase • Nguồn: Emzym neutrase là một protease được sản xuất từ vi khuẩn bởi một chủng Bacillus amyloliquefaciens chọn lọc. Nó sẽ phá vỡ các liên kết peptide để thủy phân protein. • Cách dùng: Neutrase thường sử dụng để nâng cao chất lượng sản phẩm protein từ động vật và thực vật. Tuy nhiên, chúng ta dùng để làm biến tính protein để chuẩn bị chiết xuất DNA từ tế bào thực vật và động vật. • Hoạt tính : Giống như tên gọi của nó, Neutrase là một protease trung tính và hoạt động tối ưu của nó khoảng từ pH 5,5-7,5 và nhiệt độ trong khoảng 45-55°C. Neutrase là một metallo- proteinase, cần các ion kẽm cho hoạt động của nó. Do đó, neutrase sẽ đạt được sự ổn định khi có mặt của ion canxi và ức chế bởi EDTA. Sự ổn định của Neutrase ở một nhiệt độ nhất định bị ảnh hưởng bởi các loại và nồng độ của protein. Neutrase có thể bị bất hoạt, ví dụ như xử lý nhiệt, 2 phút ở 85°C. 22 • Bảo quản: Nếu được lưu trữ ở 3-5 °C thì Neutrase sẽ giữ được hoạt tính trong ít nhất một năm. 1.5.3 Sự thủy phân protein bằng enzym Quá trình thủy phân protein: Protein polypeptide peptite acid amine Quá trình thủy phân bắt đầu thực hiện khi ở một đều kiện thích hợp (nhiệt độ, ph,…) nhất định, enzym chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động, tiến hành cắt đứt các liên kết peptite trong cơ chất. Ban đầu sản phẩm tạo thành là polypeptide sau một thời gian thủy phân sẽ hình thành các peptite ngắn hơn và một số acid amine. Thời gian thủy phân càng dài thì quá trình thủy phân càng triệt để hơn đồng nghĩa với hàm lượng acid amine càng nhiều.[5] 1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Trong quá trình thủy phân có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym cụ thể như sau: - Ảnh hưởng của nhiệt độ: bản chất của enzym là protein nên nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân. Nếu nhiệt độ quá cao trên 700C sẽ làm cho enzym bị biến tính không thuận nghịch dẫn đến mất khả năng xúc tác, quá trình thủy phân diễn ra chậm hoặc bị ngừng trệ. Đối với nhiệt độ thấp enzym bị biến tính thuận nghịch nên quá trình thủy phân sẽ diễn ra rất chậm, không đạt hiệu quả cao. Hầu hết các enzym điều hoạt động ở 45-550C và bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 700C (ngoại trừ papain (có trong đu đủ), bromelin (có trong dứa) ). Nhiệt độ tối thích của một enzym không phải là một hằng số mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, PH môitrường các chất kích hoạt,…[4] - Ảnh hưởng của PH môi trường: PH cho biết [OH-] và [H+]; PH ảnh hưởng đến khả năng ion hóa của enzym và cơ chất nếu giá trị PH là tối thích thì tại đó enzym và cơ chất đạt trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng đễ dàng kết hợp với nhau và làm cho vận tốt phản ứng sảy ra cao nhất. Đa số enzym hoạt động trong vùng PH lân cận 7 (môi trường PH yếu, bazo yếu), ngoại trừ một số enzym pepsin trong dạ dày (PH=1,2-2,5); trysin trong ruột non (PH gần bằng 9) [4]. 23 - Ảnh hưởng của nồng độ enym: nồng độ enzym ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân. Khi nồng độ enzym thấp và lượng cơ chất lớn thì tốc độ enzym phụ thuộc tuyến tình vào nồng độ enzym (nồng độ enzym tăng, tốc độ phản ứng tăng). Khi nồng độ enzym cao thì quá trình thủy phân sẽ sảy ra nhanh chóng nhưng khi tốc độ phản ứng tăng đến một giá trị V=Vmax , việc tăng thêm nồng độ enzym thì tốc độ thủy phân rất chậm hoặc không tăng [4]. - Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt giá trị V=Vmax , nếu tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng hầu như không tăng [4]. - Ảnh hưởng của chất kìm hãm hay chất ức chế: là chất làm cho enzym giảm khả năng xúc tác, có khi vô hoạt. Các chất này cấu tạo tương tự như cơ chất nhưng enzym không nhận, enzym kết hợp với chất đó. Kết quả chất lạ chiếm chổ của cơ chất chính nên không tạo ra sản phẩm. Vì mỗi loại enzym xúc tác cho một cơ chất riêng nên chúng có chất kìm hãm khác nhau [4]. - Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: là những chất khi thêm vào sẽ làm tăng khả năng hoạt tính của enzym, các chất này có bản chất là ion kim loại kiềm (Na+, K+, Li+), kiềm thổ (Ca+, Mg+, Ba+), hay một vài anion (Cl- , I-, Br- ) chúng làm cầu nối giữa enzym với cơ chất làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzym và cơ chất, vận tốc phản ứng tăng, nhưng các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ xác định khi dùng quá nồng độ cho phép hoạt độ enzym sẽ giảm [4]. - Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: tùy thuộc vào từng loại enzym xúc tác khác nhau mà có thời gian thủy phân tối thích khác nhau. Thời gian thủy phân là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thời gian càng dài thì quá trình thủy phân diễn ra triệt để hơn do enzym cắt mạch trong cơ chất nhiều hơn.[4]. - Ảnh hưởng của hàm lượng nước: nước là môi trường để hòa tan enzym và cơ chất để phản ứng xảy ra nhanh hơn và đồng thời cũng trực tiếp tham gia vào quá trình phản ứng thủy phân [4]. 24 1.6 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐÃ CÓ, NHỮNG VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU GIẢI QUYẾT 1.6.1 Các kết quả nghiên cứu đã có và những hạn chế của nó Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu tự nhiên bằng các phương pháp hóa học NaOH, HCl…hoặc chế phẩm Ezym protease. Các nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được nhiều phương pháp định lượng chondroitin Sulfate. Phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp quang phổ. Dựa trên nguyên tắc cấu tạo của chondroitin sulfate là liên kết giữa Dgalactosamin and D-glucuronic acid có một vài nghiên cứu nước ngoài đã định lượng CS qua việc định lượng D-glucuronic acid (sử dụng nhiệt, acid để làm đứt liên kết) tính ra số mol D-glucuronic acid và suy ra được khối lượng của CS. Tuy nhiên việc xác định khối lượng CS qua số mol còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như việc thay đổi liên tục của gốc R dẫn đến khó xác định được chính xác khối lượng phân tử của D-galactosamin. Cùng với việc sử dụng nhiều acid đậm đặc hóa chất khó tìm là hạn chế của phương pháp.Nhiều nghiên cứu khác xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) khi nó gắn với CS. Bên cạnh đó cũng có một vài công trình nghiên cứu trong nước thủy phân sụn cá tách chiết CS bằng công nghệ sinh học sử dụng chế phẩm từ enzym protease cũng đã tách chiết được CS trong sụn cá đuối vá cá nhám tuy nhiên quá trình thủy phân kéo dài tốn nhiều thời gian. Như vậy để tách chiết CS thì có thể sử dụng: hóa chất NaOH, HCl, enzym.Vấn đề là nếu dùng hóa chất thì tốc độ phản ứng nhanh hiệu suất thu hồi cao tuy nhiên làm ảnh hưởng đến chất lượng CS nếu dùng NaOH làm mất gốc Sulfate 6, nếu dùng HCl thì làm mất gốc Sulfate 4 còn sử dụng các chế phẩm Enzym như các đề tài nghiên cứu trước tốn rất nhiều thời gian và hiệu suất thủy phân thấp. Cũng như việc định lượng CSphương pháp của các đề tài nghiên cứu trước còn rất phức tạp đòi hỏi công nghệ cao và tốn kém 25 1.6.2 Những vấn đề cần nghiên cứu giải quyết, tính mới của đề tài - Không sử dụng phương pháp hóa học để tách chiết chodroitin sulfate. - Nghiên cứu thủy phân tách chiết CS bằng công nghệ sinh học trên đối tượng sụn cá đuối. Sử dụng nguyên liệu sụn cá đuối dễ tìm, giá thành thấp và là phế liệu của các nhà máy chế biến. - Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase (nhiệt độ thích hợp, pH, tỉ lệ enzym, thời gian thủy phân) - Ứng dụng các thông số đã tối ưu trên đề xuất quy trình sản xuất CS thô. - Chọn phương pháp định lượng CS đơn giản, có độ chính xác cao, có tính khả thi trong việc tiến hành thí nghiệm với hóa chất dễ tìm không độc hại. Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu MB (methylene blue) khi nó gắn với CS, đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 664nm trên máy quang phổ [12]. Vì phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS: tổng hợp được một số CS tetrasaccharid, có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron trong khi đó disaccharid không có tác dụng trên. Vì vậy, các CS chủ yếu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Đều đáng chú y là các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối, cá nhám là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành. Đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm và có chứa thành phần CS. Cho đến nay, tại Việt Nam còn ít công trình nghiên cứu tách chiết CS từ sụn cá đuối và cá nhám. Và hiện nay hầu hết các chế phẩm CS có bán trên thị trường được sản xuất từ sụn cá mập là chủ yếu, một phần từ sụn bò, sụn gà... nên giá thành cao. Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu CS là nhập từ nước ngoài giá thành lại càng cao và cũng chưa có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận CS. Vì thế việc nghiên cứu tách chiết CS từ sụn các loại cá đuối có trong nước ta là điều rất cần thiết để thay thế nguồn nguyên liệu đắt tiền là vi sụn cá mập. 26 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Cá đuối bồng mõm nhọn Tên khoa học (Dasyatis zugei) Tên tiếng anh (Pake- edged stringray) Là loại cá thân dẹp bằng, hình trám như một đĩa lớn, chiều rộng đĩa thân xấp xỉ bằng chiều dài đĩa thân. Mõm nhọn dài bằng 0,3- 0,33 lần chiều dài đĩa thân. Mắt bé hình bầu dục hơi lồi. Đuôi rất nhỏ và dài như roi gần bằng 0,6 chiều dài toàn thân. Gai đuôi có một đôi, trên cạnh có răng cưa nhỏ Phân bố ở Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Trung Quốc, Nhật Bản và ở Việt Nam phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vùng biển Tây Nam Cá đuối được thu mua tại cảng cá Vĩnh Lương- Nha Trang. Sau khi thu mua cá đuối được sử lý lấy sụn. 2.1.2. Enzym neutras Neutrase: được mua tại hãng Nvozyme Đan Mạch. Đây là sản phẩm được sản xuất và được công tyTNHH thương mại dịch vụ Nam giống TP. HCM phân phối. Enzym neutrase là một protease được sản xuất từ vi khuẩn bởi một chủng Bacillus amyloliquefaciens chọn lọc. Nó sẽ phá vỡ các liên kết peptide để thủy phân protein. Enzyme Neutraza có hoạt tính 50.000UI/g,nhiệt độ thích hợp: 45oC – 55oC, khoảng pH thích hợp: 5.5 – 7.5. pH tối thích: 7,2 và nhiệt độ tối thích 500C Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là -10oC. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp phân tíchhóa học 2.2.1.1. Xác định hàm ẩm Áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi ở nhiệt độ 105oCtheo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9297 : 2012 27 Độ ẩm của chế phẩm CS được tính theo công thức: A% = [( mc + mt ) − ( mc + ms )] × 100 ( mc + mt ) − mc Trong đó: mc: khối lượng chén sau khi đã sấy ở nhiệt độ 105 °C , tính bằng (g); mt: khối lượng của mẫu trước khi sấy, tính bằng (g); ms: khối lượng của mẫu sau khi sấy, tính bằng (g). 2.2.1.2. Xác định hàm lượng tro a) Nguyên lý: dùng sức nóng (550-6000C)nung cháy toàn phần chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm. b) Dụng cụ, hóa chất - Chén nung bằng sứ - Đèn cồn hay bếp điện - Lò nung điều chình được nhiệt độ - Cân phân tích - Bình hút ẩm, - H2O2 10 thể tích, hoặc HNO3 đậm đặc. c) Cách tiến hành - B1: nung chén đã rửa sạch ở lò nung đến khối lượng không đổi để nguội ở bình hút ẩm cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4g) G - B2: Cân chính xác khoảng từ 1-5g chất thử cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên G1 - B3: hóa tro đen trên biếp điện. - B4: chuyển vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ đến 550-6000C nung thành tro trắng khoảng 6-7 giờ - B5: nung tới khối lượng không đổi cân G2 d) Kết quả Hàm lượng tro theo phần trăm (X) tính bằng công thức: 28 X = G2 − G (%) G1 − G Trong đó: G1 : khối lượng chén nung và mẫu (g) G2 : khối lượng chén nung và tro trắng G : khối lượng chén nung 2.2.1.3. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp kejdahl a) Tài liệu tham khảo:xác định Nito tổng số theo phương pháp kejdahl b) Nguyên tắc Vô cơ hóa mẫu bằng axit sunfuric đậm đặc với sự có mặt của chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4.5H2O) để chuyển hóa nito trong các chất hữu cơ về dạng (NH4)2SO4 rồi dùng kiềm mạnh (NaOH) để đẩy NH3 ra. Khí NH3 được hấp thụ vào dung dịch axit boric dư. Sau đó chuẩn độ dung dịch tạo ra bằng dung dịch chuẩn H2SO4 với chỉ thị hỗn hợp Tashiro (methyl đỏ + methyl xanh) đến lúc dung dịch chuyển từ màu lục sang tím. c) Thiết bị, dụng cụ và hóa chất - Thiết bị: hệ thống phá mẫu và chưng cất bán tự động Kjeldahl - Dụng cụ Buret 25ml Ống đong 1000ml Bình định mức 25ml, 1000ml Erlen 100ml - Hóa chất Nước cất 1 lít H2SO4 đậm đặc Hỗn hợp xúc tác (K2SO4và CuSO4.5H2O), NaOH, H3BO3 Methyl đỏ và methyl xanh Ethanol 95% Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05 mol (0,1N) 29 - Pha hóa chất Xúc tác hỗn hợp gồm K2SO4và CuSO4.5H2O được cân theo tỉ lệ 5:1 trộn đều. NaOH 40%: hòa tan 400g NaOH trong nước và định mức lên thành 1lit. H3BO3 4%: hòa tan 40g H3BO3 trong nước và định mức thành 1lit. Ethanol 95%: 950ml ethanol trong nước và định mức thành 1000ml. Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05 mol (0,1N): pha ống chuẩn H2SO4 (0,1N) và đinh mức thành 1lit. d) Tiến hành Vô cơ hóa mẫu - Lấy 10ml mẫu cho vào ống kjeldahl có dung tích phù hợp (thường 250ml) - Thêm 0,9 – 1,2 g chất xúc tác K2SO4và CuSO4.5H2O - Thêm 10ml H2SO4 đậm đặc và đặt ống kjeldahl vào bộ phá mẫu - Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy. Tổng thời gian vô cơ hóa từ 3 – 4h - Sau khi phá mẫu hoàn tất chất lỏng trong bình trong và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội, nếu thấy quá trình vô cơ hóa xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước cất vào rồi lắc đều. Chưng cất - Đem mẫu đi chưng cất. Cài đặt thông số cho máy như sau: H2O: 2s H3BO3: 3s NaOH: 5s - Thời gian chưng cất: 5 phút - Nhỏ 3 giọt chỉ thị Tashiro vào bình hấp thu và tiến hành chưng cất mẫu. Chuẩn độ - Chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,05 mol (0,1N), ghi nhận điểm cuối khi dung dịch chuyển từ màu xanh dương sang màu tím. Đọc và ghi thể tích H2SO4 tiêu tốn trên buret e) Tính toán kết quả Nồng độ nitơ tổng số PN (mg/L) được tính theo công thức: 30 ܲே ൌ ܸଵ െ ܸଶ ൈ ‫ ܥ‬ൈ 14.01 ൈ 1000 ܸ଴ Trong đó V0: Thể tích của mẫu thử (ml) V1: Thể tích dung dịch tiêu chuẩn H2SO4 đã dùng để chuẩn độ (ml) V2: Thể tích dung dịch tiêu chuẩn H2SO4 đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) C: Nồng độ chính xác của dung dịch H2SO4 đã dùng để chuẩn độ (N) 14.01: Khối lượng nguyên tử tương đối của nitơ. 2.2.1.4. Xác định hoạt độ enzym neutrase theo phương pháp Anson cải tiến • Nguyên lý cơ bản của phương pháp Cho enzym tác dụng với cơ chất casein, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym trong điều kiện chuẩn, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1µmol tyrosine [45]. • Hoá chất Thuốc thử folin pha loãng 5 lần, Na2CO36%; TCA 5%; Casein 1% trong đệm phosphate 0,01M, pH 7,0 • Tiến hành - Phản ứng enzym: Lấy 0,5ml enzym, giữ 10–15phút ở 30oC, thêm 1ml dung dịch casein 1% (đã đạt 30oC), lắc đều, giữ ở 30oC đúng 10phút. Sau đó cho ngay 2,5ml TCA vào, lắc đều và để lắng 30phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10phút để thu dịch trong suốt có chứa sản phẩm hoà tan của phản ứng enzym. Hàm lượng của sản phẩm trong dung dịch lọc được xác định bằng phản ứng màu. - Phản ứng màu: Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào ống nghiệm, thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều. Sau 30phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm. - Xây dựng đồ thị chuẩn tyrosine: Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ 31 khác nhau 0,1-1 µmol/ml trong HCl 0,2N. Lấy 0,5ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên. Đo mật độ quang học của các ống. Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosine. Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrosine tương ứng. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym ở điều kiện tiêu chuẩn 30oC, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1 micromol tyrosin. Bảng 2.1 Bảng nồng độ xác định đường chuẩn tyrosin Nồng độ tyrosine (µmol/ml) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 OD Hoạt độ phân giải protein của 1 ml dịch enzym được xác định như sau: X = a.4.k t Trong đó: X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzyme 4: Thể tích của hỗn hợp phản ứng và TCA a: Số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của ống thí nghiệm và ống kiểm tra k: Độ pha loãng dung dịch enzyme. t: Thời gian phản ứng (10 phút). 2.2.1.5. Định lượng Chondroitin sulfate bằng phương pháp quang phổ phức xanh methylene a) Nguyên lý cơ bản của phương pháp Dựa trên sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ của methylene blue khi tác dụng với glycosaminoglycan sulfate tại bước sóng 664nm. Phương pháp so màu methylene blue này rất nhạy có thể định tính và định lượng CS với khối lượng rất 32 nhỏ (µg). Methylene xanh là một loại thuốc nhuộm cation mà tương tác với chondroitin sulfate và làm giảm hấp thụ của xanh methylen tại bước sóng 664nm. Việc giảm sự hấp thụ ở 664 nm là tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sulate, cung cấp một cơ sở cho việc xác định việc định lượng của chondroitin sulate bằngxanh methylene [12]. Với việc bổ sung các nồng độ ngày càng tăng của chondroitin sulfate, có giảm hấp thụ của methylene xanh tại 664 nm. Kết quả cho thấy độ hấp thụ có sự thay đổi chỉ ra rằng chondroitin sulfate đã tương tác với phân tử xanh methylen. Bởi vì có hai điện tích âm trong từng đơn vị trùng hợp phân tử disaccharide của chondroitin sulfate tươngtác với cation của thuốc nnhuộm xanh methylene, lực tĩnh điện là động lực tham gia tương tác. Các phân tử thuốc nhuộm đã được liên kết với chondroitin sulfate bởi một lực tĩnh điện. Điều này được thể hiện qua cách xếp mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue [13] được thể hiện ở hình.2.1 Hình 2.1 Mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue Chuẩn độ quang phổ được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ ở 664 nm . Độ hấp thụ được đo tương đối với nước. Các giá trị độ hấp thụ thực tế đã thu được bằng độ hấp thụ của dung dịch methylene trừ đi độ hấp thụ tương ứng của chondroitin sulfate trong dung dịch xanh methylen. b) Vật liệu và hóa chất - Dung dịch CS chuẩn từ chính nguyên liệu đi khảo sát sụn cá đuối. 33 - Dung dịch thuốc thử methylene blue pha sẵn c) Tiến hành - Thuốc màu xanh methylene : cân 15mg xanh methylene cho 75ml nước cất vào hòa tandịch, rồi cho vào bình định mức 100ml định mức lên 100ml lắc đều trong 5 phút, tiếp tục pha loãng hút 25ml cho vào bình định mức 100 ml định mức bằng nước cất lên đến vạch định mức. - Dịch CS chuẩn: cân 100mg CS chuẩn hòa tan cho vào bình định mức 100ml. dùng pipet hút 5ml tiếp tục cho vào bình định mức 100ml định mức bằng nước cất lên đến vạch lắc đều trong 5 phút rồi cho ra cốc. - Dịch thủy phân (mẫu test): pha loãng hút 5ml dịch thủy phân cho vào bình định mức 100ml định mức bằng nước cất lên đến vạch định mức lắc đều trong 5 phút. - Lấy 3 bình định mức 50ml đánh dấu theo thứ tự mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra và mẫu trắng. Cho vào mỗi bình chính xác 10ml dung dịch xanh methylen đã được chuẩn bị ở trên. Dùng pipet lấy 2ml dịch tiêu chuẩn cho vào bình định mức tiêu chuẩn, 2ml dịch thử cho vào bình định mức thử nghiện và 2ml nước cất vào bình định mức mẫu trắng. Sử dụng nước cất định mức cho mỗi bình lên đến vạch định mức 50ml, nghịch đảo bình trong vòng 5 phút. Cho ra ống nghiệm lắc trong vòng 30 phút. Tiến hành đi đo độ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm ở bước sóng 664nm. Các giá trị độ hấp thụ thực tế đã thu được bằng độ hấp thụ của dung dịch methylene trừ đi độ hấp thụ tương ứng của chondroitin sulfate trong dung dịch xanh methylen. - Công thức tính lượng sulfate chondroitin (tính cho giá trị khảo nghiệm của CS mg/ 10g mẫu) Trong đó: ABlank: độ hấp thụ của xanh methylen (mẫu trắng) ATest: độ hấp thụ của sulfate chondroitin trong mẫu thử nghiệm 34 AStd. : độ hấp thụ của sulfate chondroitin trong mẫu chuẩn. WtStd : Trọng lượng của chondroitin sulfate chuẩn (mg ) Wt.Test: Trọng lượng của mẫu (mg) thử nghiệm P = Phần trăm độ tinh khiết của chondroitin sulfatechuẩn(92,42%) WAvekhối lượng trung bình của mẫu thử (mg) 2.2.1.6. Nghiên cứu tỉ lệ ethanol tủa CS Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủa. Tuy nhiên phụ thuộc vào nồng độ ethanol mà có thể thu được hàm lượng CS cao nhất. Từ dịch chứa CS sau thủy phân, sử dụng các nồng độ ethanol khác nhau để khảo sát sự thu hồi CS hiệu quả nhất Tiến hành: lấy 5 cốc cho vào mỗi cốc 10ml dung dịch thủy phân. Tiến hành thử nghiệm với các tỉ lệ cồn: 50%; 100%; 200%; 300%; 400% so với 10ml dịch thủy phân, xác định hàm lượng CS thu được trong dịch sau thủy phân lần lược ở các nồng độ trên. Có thể quan sát bằng mắt và kiểm chứng lại bằng cách sấy cân xác định khối lượng. Tìm ra tỉ lệ cồn cho hiệu quả thu hồi CS cao nhất. 2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu Từ tham khảo các nghiên cứu của các tác giả trước đây, cùng với quá trình khảo sát thực nghiệm. Em dự kiến đưa ra quá trình nghiên cứu tổng quát. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu thể hiện đẩy đủ tất cả nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở hình 2.2. 35 Cá đuối Tách thịt Sụn cá đuối Xử lý Độ ẩm Phân tích Đồng nhất mẫu Hàm lượng tro Nitơ tổng số Xử lý nhiệt (1h) Thủy phân bằng enzym Neutrase Xác định hoạt độ E neutrase pH Nồng độ E Tìm các thông số thích hợp Bất hoạt enzym Nhiệt độ Thời gian Nồng độ nước Ly tâm thu dịch Kết tủa protein Ly tâm Nồng độ cồn Dịch chứa CS Thời gian tủa Ly tâm Chế phẩm CS thô Hình 2.2 . Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu 36 Giải thích sơ đồ a) Cá đuối Cá được thu thập từ vùng biển Nha Trang tại cảng cá Vĩnh Lương, xã Vĩnh Lương Khánh Hòa. b) Tách thịt Đầu tiên cần tách hoàn toàn thịt cá ra khỏi sụn để loại bỏ lượng protein của thịt cá bám trên sun. Tiến hành gia nhiệt tách thịt. c) Sụn cá đuối Sụn sau khi đã tách hoàn toàn thịt cá đem đi xay nhuyễn đồng nhất mẫu. Việc xay nhuyễn không những đồng nhất mẫu cho tiến hành thí nghiệm mà còn làm tăng diện tích túc xúc giữa enzym và cơ chất trong quá trình thủy phân. Tiến hành: vì sụn khó xay nhuyễn em bổ sung nước vào tiến hành xay bằng máy xay cho đến khi mẫu sụn nhuyễn đồng nhất. d) Xử lý nhiệt mẫu. Xử lý nhiệt cho mẫu sụn trước khi thủy phân mục đích là để làm mền sụn bẻ gảy liên kết giải phóng Ca2+, protein không tan. Xử lý ở nhiệt độ cao trước còngiúp cho dịch chứa protein gắn với CS dễ bị thủy phân bởi enzyme, do các liên kết peptit lộ ra nhiều nên dễ bị enzym tấn công. Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân giải phóng CS. Em tiến hành đun mẫu trong 1giờ, ở 1000C lọc tách Ca2+ , protein không tan, và một số tạp chất không tan khác. Để nguội mẫu xuống nhiệt độ phòng. e) Thuỷ phân Sụn cá sau khi được nghiền nhỏ sử dụng enzyme neutraseđể thuỷ phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một proteoglycan. f) Bất hoạt enzym Kết thúc quá trình thủy phân bất hoạt enzym ở 900C trong 10 phút. g) Ly tâm, thu dịch Dịch sau khi được thuỷ phân đem ly tâm 6000v/phút trong 15 phút để thu dịch 37 chứa CS và cả protein tan, protein dư do chưa thủy phân hết. h) Kết tủa protein Quá trình thủy phân đã giải phóng ra CS, protein và một phần nhỏ protein dư do chưa thủy phân hết. Em sử dụng TCA ở nồng độ 7% tạo kết tủa không thuận nghịch để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch. Tiến hành: thu dịch sau ly tâm đem đi tủa TCA ở 40C để qua đêm i) Ly tâm Dịch sau khi tủa protein đem ly tâm 6000v/phút trong 15 phút để thu dịch chứa chondroitin sulfate. j) Kết tủa CS Sử dụng cồn 960 ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được sau khi đã tủa TCA. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Cồn ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của polysacharid và làm CS kết tủa. Sau đó tiếp tục ly tâm để thu tủa chứa CS. k) Sấy thu CS thô Tiến hành sấy để loại nước thu chế phẩm thô. Sử dụng tủ sấy có bộ phận cấp nhiệt và quạt gió. Sấy lạnh ở 400C trong 8 giờ, cân xác định đến khối lượng không đổi. Sấy ở nhiệt độ thấp vì sợ ảnh hưởng đến chất lượng của CS. Tốt nhất nên tiến hành sấy phun ở 400C để thu CS dạng bột. 2.2.2.2 Bố trí xác định các thông số của quy trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym Neutrase Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzym bổ sung Mục đích: Để đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ enzym đến khả năng thủy phân protein giải phóng CS và tìm ra được nồng độ thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều nồng độ enzym khác nhau. Theo các nghiên cứu trước sử dụng nồng độ enzym hiệu quả nhất từ 0,10,3%. Nên em bố trí thí nghiệm theo hình 2.1 38 Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm: Nồng độ enzym ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân. Khi nồng độ enzym cao thì quá trình thủy phân sẽ sảy ra nhanh chóng nhưng khi tốc độ phản ứng tăng đến một giá trị V=Vmax , việc tăng thêm nồng độ enzym thì tốc độ thủy phân rất chậm hoặc không tăng. Nên việc nghiên cứu tìm ra nồng độ enzym thích hợp nhất cho quá trình thủy phân là rất cần thiết. Cách tiến hành: Với cùng một điều kiện giống nhau pH =7, tỉ lệ nước 500%/10g sụn , nhiệt độ 450C trong 2h, chỉ thay đổi tỉ lệ enzym trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 tỉ lệ nồng độ enzym từ 0-0,4%(tính theo 10g sụn) mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, em tiến hành đo OD bằng máy đo quang UV-vis xác định nồng độ enzym tối ưu cho hoạt động của enzym neutrase trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiệnở 450 C trong 2h, pH nguyên liệu, với các nồng độ enzym khác nhau, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn nồng độ enzymcho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất. 39 Sụn cá đuối Thủy phân bằng Neutrase với tỉ lệ enzym khác nhau 0g 0,01g/10g 0,02g/10g 0,03g/10g pH: 7, tỉ lệ nước 500%, Nhiệt độ: 450C, Thời gian 2h 0,04g/10g Vô hoạt enzym Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Đánh giá Chọn tỉ lệ enzym Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ enzym bổ sung 40 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân Mục đích: để đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein giải phóng CS và tìm ra được nhiệt thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.2 Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym. Hoạt tính enzym sẽ mạnh nhất khi hoạt động tại vùng nhiệt độ tối thích và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ này. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông số nhiệt độ thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết. Cách tiến hành: Với cùng một điều kiện giống nhau: nồng độ enzym tối thích, pH tối thích, tỉ lệ nước 500%/g sụn, trong 2h, chỉ thay đổi nhiệt độ trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị nhiệt độ từ 50-600Cmỗi nồng độ lăp lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu trong 2h, nồng độ enzym tối ưu với 5 giá trị nhiệt độ khác nhau, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chon nhiệt độ tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất. 41 Sụn cá đuối Tỉ lệ enzym thích hợp, pH: 7, tỉ lệ nước 500%/10g sụn, thời gian 2h 400C 450C 500C 550C 600C Vô hoạt enzym Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Đánh giá Chọn nhiệt độ thích hợp Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp 42 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nước thủy phân Mục đích: Để đánh giá sự ảnh hưởng của tỉ lệ nước đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được tỉ lệ nước thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều tỉ lệ nước khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.3 Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm: Nước là môi trường để hòa tan enzym và cơ chất để phản ứng xảy ra nhanh hơn và đồng thời cũng trực tiếp tham gia vào quá trình phản ứng thủy phân. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông số tỉ lệ nước thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết. Cách tiến hành: Với cùng một điều kiện giống nhau: nồng độ enzym, nhiệt độ thích hợp, pH: 7, trong 2 giờ, chỉ thay đổi tỉ lệ nước trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 tỉ lệ nước khác nhau 400%, 500%, 600%, 700%, 800% mỗi giá trị lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định tỉ lệ nước tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. Lấy 5 mẫu 10g sụn, bổ sung lần lược 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu, nồng độ enzym tối ưu, nhiệt độ tối ưu, thời gian tối ưu, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn tỉ lệ nước tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất. 43 Sụn cá đuối Thủy phân bằng Neutrase với tỉ lệ nước khác nhau 40ml 50ml 60ml 70ml Tỉ lệ enzym thích hợp , nhiệt độ thích hợp, thời gian 2h, pH: 7 80ml Vô hoạt enzym Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Đánh giá Chọn tỉ lệ nước thích hợp Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ nước thích hợp 44 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân Mục đích: Để đánh giá sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được thời gian tối thích cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều thời gian khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.3 Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm: Thời gian thủy phân là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thời gian càng dài thì quá trình thủy phân diễn ra triệt để hơn do enzym cắt mạch trong cơ chất nhiều hơn. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông s thời gian thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết. Cách tiến hành: Với cùng một điều kiện giống nhau: pH tối thích, nồng độ enzym tối thích, nhiệt độ tối thích, tỉ lệ nước 500%, chỉ thay đổi thời gian trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị thời gian từ 2-6hmỗi giá trị lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định thời gian tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu, nồng độ enzym tối ưu, nhiệt độ tối ưu trong 2h với 5 giá trị nhiệt độ khác nhau, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn thời gian tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất. 45 Sụn cá đuối Tỉ lệ enzym thích hợp, pH: 7, nhiệt độ thích hợp, tỉ lệ nước thích hợp Thủy phân bằng Neutrase với thời gian khác nhau 2h 3h 4h 5h 6h Vô hoạt enzym Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Đánh giá Chọn thời gian thích hợp Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp 46 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân Mục đích: Để đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được pH tối thích cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều tỉ lệ pH khác nhau nằm trong khoảng điều kiện hoạt động tối ưu pH: 5.5-7.5 . Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.1 Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm: PH ảnh hưởng đến khả năng ion hóa của enzym và cơ chất nếu giá trị PH là tối thích thì tại đó enzym và cơ chất đạt trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng đễ dàng kết hợp với nhau và làm cho vận tốt phản ứng sảy ra cao nhất. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông s thời gian thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết. Cách tiến hành: Với cùng một điều kiện giống nhau:nồng độ enzym tối thích,nhiệt độ 450C, tỉ lệ nước 1:5 trong 2h, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0) trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị pH khác nhau 6; 6,5; 7; 7,5; 8mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, em tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiệnở 450 C trong 2h,nồng độ enzym tối ưu với 5 giá trị pH khác nhau,sau 2h đi bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chon pH tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất. 47 Sụn cá đuối Tỉ lệ enzym, nhiệt độ, tỉ lệ nước, thời gian thích hợp. Thủy phân bằng Neutrase với pH khác nhau 6 6,5 7 7,5 8 Vô hoạt enzym Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Đánh giá Chọn pH thích hợp Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp. 48 2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI • Các hóa chất phân tích đều đạt độ tinh khiết, chủ yếu là các hóa chất nhập lấy từ cửa hàng hóa chất Hoàng Trang đường Hoàng Hoa Thám Nha trang: Casein, Folin, TCA (tricloacetic), metylen blue, cồn 960… • Thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu này có độ chính xác cao của trung tâm thí nghiệm Trường đại học Nha Trang: - Máy đo pH (Đức) - Cân phân tích độ chính xác 4 số (Nhật) - Cân kỹ thuật Caltex - Tủ sấy (Anh) - Hệ thống Kjeldahl (Đức) - Bếp điện (Trung Quốc) - Máy ly tâm (Đức) - Bể điều nhiệt (Anh) - Máy đo quang R2000 (Đức) 2.4 PHƯƠNG PHÁP SỬ LÝ SỐ LIỆU - Số liệu được sử lý bằng phần mền Microsoft Excell và SPSS 20 ở. Kết quả được báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. - Vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excell. 49 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NGUYÊN LIỆU 3.1.1 Thành phần hóa học của sụn cá đuối Tiến hành lấy mẫu sụn cá đuối đi phân tích độ ẩm, hàm lượng tro tổng số, hàm lượng nitơ tổng số kết quả thể hiện ở bảng 3.1 Bảng 3.1.Bảng thành phần hóa học của sụn cá đuối Chỉ tiêu Nước Protein thô Tro Hàm lượng (%) 65,86 ± 0,49 13,8± 0,16 15,56 ±0,26 Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 3.1. cho thấy sụn cá đuối có hàm lượng nước khá cao tới 65,86%, hàm lượng protein thô 13,8% và hàm lượng tro cao tới 15,56%. Kết quả phân tích cũng tương ứng với kết quả của các đề tài nghiên cứu trước. 3.1.2 Xác định hoạt độ enzym neutrase Kết qủa xác định hoạt độ enzyme Neutrase theo phương pháp Anson cho thấyhoạt độ enzym neutrase đạt 1.05 pu/g. Nếu so sánh với công bố của nhà sản xuất thì kết quả phân tích của chúng tôi thấp hơn công bố của nhà sản xuất. Kết qảu này có thể lý giải là do nhà sản xuất không công bố phương pháp xác hoạt độ enzyme. Mặt khác có thể là do trong quá trình vận chuyển bảo quản enzyme bị giảm hoạt tính. Như vậy việc xác định hoạt tính enzym trước khi sử dụng là cần thiết. 3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian, nồng độ enzym, tỉ lệ nước... tối thích cho phản ứng. 3.2.1 Xác định tỉ lệ enzym neutrase bổ sung Tiến hành 5 mẫu thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase với các tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau: 0%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% (tính theo 10g sụn). Các mẫu thử nghiệm để xử lý của sụn cá đuối thủy phân trong 2giờ, pH =7, tỉ lệ nước 50 500%/10g sụn, nhiệt độ 450C. Sau khi thủy phân 2 giờ bất hoạt enym, lấy mẫu đánh giá hàm lượng CS tạo ra trong các mẫu thủy phân. Kết quả được trình bày ở hình 3.1 Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại) 120 100 80 60 40 20 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Tỉ lệ enzym bổ sung (%) Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ enzym neutrase bổ sung đến hàm lượng CS tạo thành từ sụn cá Nhận xét: từ kết quả phân tích hình 3.1 cho thấy các mẫu thủy phân sụn cá bằng enzym neutrase luôn có hàm lượng CS tạo thành cao hơn mẫu đối chứng và tỉ lệ enzyme neutrase bổ sung càng cao thì hàm lượng CS tạo thành trong quá trình thủy phân càng lớn. Cụ thể, tỉ lệ enzyme bổ sung vào mẫu thủy phân sụn cá đuối trong khoảng 0-0,4% thì hàm lượng CS tạo thành ở các mẫu thủy phân tăng theo tỉ lệ enzyme bổ sung và đạt cực đại khi tỉ lệ enzym bổ sung vào là 0,2%. Sau 2 giờ hàm lượng CS tạo thành ở mẫu thủy phân sụn cá đuối bổ sung 0.2% neutrase đạt giá trị cực đại và cao gấp tương ứng so với hàm lượng CS tương đối tạo thành ở các mẫu thủy phân bổ sung tỉ lệ0% và 0,1% enzyme neutrase là 1,47 lần và 1,06 lần. Trong khi đó ở các mẫu bổ sung 0,2% neutrase và 0,3% neutrase thì hàm lượng CS tạo thành khác nhau không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê. Kết quả này có thể lý giải là khi tăng tỷ lệ enzym bổ sung thì tốc độ thủy phân tăng. Khi cấu trúc pprotein của sụn bị enzym protease phá hủy đồng thời lượng CS 51 tạo cũng tăng. Tuy vậy khi tăng lượng enzym bổ sung thì quá trình thủy phân tạo thành peptid, acid amin cũng tăng. Về nguyên tắc khi lượng CS tạo thành tối đa thì khi tăng tỷ lệ enzym bổ sung hàm lượng CS tạo thành không tăng. Nhưng thực tế khi tỷ lệ enzym bổ sung tăng hàm lượng CS tạo thành có hiện tượng hơi giảm, kết quả này được lý giải có thể là do CS - là một glucid sẽ phản ứng peptid, acid amin tạo thành phức chất mầu do vậy hàm lượng CS có hơi giảm chút ít. Từ các phân tích ở trên cho thấy tỉ lệ enzyme neutrase bổ sung vào hỗn hợp 0,2% là phù hợp. Do vậy tỷ lệ enzyme neutrase bổ sung vào quá ttrinhg thủy phân sụn cá đuối được lựa chọn là 0,2%/g sụn. 3.2.2 Xác định nhiệt độ thích hợp Tiến hành thủy phân 5 mẫu sụn cá với các mức nhiệt độ khác nhau 40, 45, 50, 55, 60°C trong 2 giờ tỉ lệ enzym 0,2%, pH: 7, tỉ lệ nước 500%/10g sụn. Sau khi thủy phân 2 giờ bất hoạt enym, lấy mẫu đánh giá hàm lượng CS tạo thành trong các mẫu thủy phân. Kết quả được trình bày ở hình 3.2 Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại) 105 100 95 90 85 80 75 40 45 50 55 Nhiệt độ phân 60 (0C) Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutras 52 Nhận xét: từ kết quả phân tích hình 3.2 cho thấy nhiệt độ của quá trình thủy phân sụn cá đuối có ảnh hưởng đến hàm lượng CS. Ở thời điểm sau 2 giờ thủy phân hàm lượng CS tạo thành có xu hướng tăng lên theo chiều tăng của nhiệt độ và có xu hướng giảm xuống nếu tiếp tục tăng nhiệt độ lên cao hơn. Cụ thể nhiệt độ mẫu thủy phân sụn cá đuối trong khoảng 40-600C thì hàm lượng CS tạo thành ở các mẫu thủy phân tăng lên và đat cực đại ở 500C. Sau 2 giờ hàm lượng CS tạo thành ở mẫu thủy phân sụn cá đuối ở 500C đạt giá trị cực đại và cao gấp tương ứng so với hàm lượng CS tương đối tạo thành ở các mẫu thủy phân 400C, 550C và 600C là 1,13 lần, 1,08 lần và 1,19 lần. Trong khi đó ở các nhiệt độ 450C và 500C thì hàm lượng CS tạo thành khác nhau không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê. Từ các phân tích ở trên cho thấy nhiệt độ hỗn hợp 450C là phù hợp. Kết quả này có thể lý giải là hoạt tính enzym sẽ mạnh nhất khi hoạt động tại vùng nhiệt độ tối thích và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ này. Nên khi nhiệt độ đạt ngưỡng tối thích cấu trúc protein của sụn bị enzym protease phá hủy nhiều nhất đồng thời lượng CS tạo ra là cao nhất. Về nguyên tắc phản ứng thủy phân càng mạnh thì hàm lượng lượng CS tạo thành càng nhiều. Kết quả thực tế cho thấy hoàn toàn đúng với lý thuyết hàm lượng CS tạo ra tăng dần và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ tối thích. Do vậy nhiệt độ thích hợp quá trình thủy phân sụn cá đuối được lựa chọn là 450C. 3.2.3 Xác định tỉ lệ nước thích hợp Tiến hành thủy phân 5 mẫu sụn cá với các tỉ lệ nước khác nhau 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80mltrong 2 giờ ở 450C tỉ lệ enzym 0,2%, pH: 7. Sau khi thủy phân 2 giờ bất hoạt enym, lấy mẫu đánh giá hàm lượng CS tạo thành trongcác mẫu thủy phân. Kết quả được trình bày ở hình 3.2. 53 Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại) 102 100 98 96 94 92 90 88 40 50 60 70 80 Tỉ lệ nước bổ sung (ml/10 g sụn) Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước bổ sung đến hàm lượng CS tạo thành từ sụn cá Nhận xét: từ kết quả phân tích hình 3.3 cho thấy tỉ lệ nước bổ sung vào quá trình thủy phân sụn cá đuối có ảnh hưởng đến hàm lượng CS. Ở thời điểm sau 2 giờ thủy phân hàm lượng CS tạo thành có xu hướng tăng lên theo chiều tăng của tỉ lệ nước bổ sung và có xu hướng giảm xuống nếu tiếp tục tăng tỉ lệ nước cao hơn. Cụ thể tỉ lệ nước bổ sung mẫu thủy phân sụn cá đuối trong khoảng 400-800%/g sụn thì hàm lượng CS tạo thành ở các mẫu thủy phân tăng lên và đat cực đại ở 600%. Sau 2 giờ hàm lượng CS tạo thành mẫu thủy phân sụn cá đuối ở tỉ lệ nước 600% đạt giá trị cực đại và cao gấp tương ứng so với hàm lượng CS tương đối tạo thành ở các mẫu thủy phân tỉ lệ nước 400%, 700% và 800% là 1,06 lần, 1,05 lần và 1,09 lần. Trong khi đó ở các tỉ lệ nước 500% và 600% thì hàm lượng CS tạo thành khác nhau không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê. Từ các phân tích ở trên cho thấy tỉ lệ nước bổ sung vào quá trình thủy phân 500%/g sụn là phù hợp. 54 Do vậy tỉ lệ nước bổ sung thích hợp vào quá trình thủy phân sụn cá đuối được lựa chọn là 500%/g sụn. 3.2.4 Xác định thời gian thủy phân thích hợp Tiến hành thủy phân 5 mẫu sụn cá với các mức thời gian khác nhau 2h, 3h, 4h, 5h, 6h ở 450C tỉ lệ enzym 0,2%, pH: 7, tỉ lệ nước 1:5. Sau khi thủy phân 2h, 3h, 4h, 5h, 6h lần lược bất hoạt enym các mẫu tương ứng, lấy mẫu đánh giá hàm lượng CS tạo thành trong các mẫu thủy phân. Kết quả được trình bày ở hình 3.4 Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại) 105 100 95 90 85 80 75 2 3 4 5 6 Thời gian (giờ) Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutrase Nhận xét: từ kết quả phân tích hình 3.4 cho thấy thời gian thủy phân sụn cá đuối có ảnh hưởng đến hàm lượng CS. Ở thời điểm sau thủy phân hàm lượng CS tạo thành có xu hướng tăng lên theo chiều tăng thời gian và có xu hướng giảm xuống nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân hơn nửa. Cụ thể thời gian mẫu thủy phân sụn cá đuối trong khoảng 2 giờ- 6 giờ thì hàm lượng CS tạo thành ở các mẫu 55 thủy phân tăng lên và đat cực đại ở 4 giờ. Sau quá trình thủy phân hàm lượng CS tạo thành ở mẫu thủy phân sụn cá đuối ở 4 giờ đạt giá trị cực đại và cao gấp tương ứng so với hàm lượng CS tương đối tạo thành ở các mẫu thủy phân 2 giờ, 3 giờ và 6 giờ là 1,18 lần, 1,08 lần và 1,1 lần. Trong khi đó ở thời gian 4 giờ và 5 giờ thì hàm lượng CS tạo thành khác nhau không đáng kể và không có ý nghĩa thống kê. Từ các phân tích ở trên cho thấy thời gian thủy phân 4 giờ là phù hợp. Kết quả này có thể lý giải là khi kéo dài thời gian thủy phân thì tốc độ thủy phân tăng. Khi cấu trúc pprotein của sụn bị enzym protease phá hủy đồng thời lượng CS tạo cũng tăng. Tuy vậy khi tăng thời gian thì quá trình thủy phân tạo thành peptid, acid amin cũng tăng. Về nguyên tắc khi lượng CS tạo thành tối đa thì khi tăng thời gian thủy phân bổ sung hàm lượng CS tạo thành không tăng. Nhưng thực tế khi tăng thời gian thủy phân hàm lượng CS tạo thành có hiện tượng hơi giảm, kết quả này được lý giải có thể là do CS - là một glucid sẽ phản ứng peptid, acid amin tạo thành phức chất mầu do vậy hàm lượng CS có hơi giảm chút ít. Do vậy thời gian thích hợp quá trình thủy phân sụn cá đuối được lựa chọn là 4 giờ. 3.2.5 Xác định pH thủy phân thích hợp Tiến hành thủy phân 5 mẫu sụn cá với các giá trị pH khác nhau 5,5, 6, 6,5, 7,5, 8 khảo sát ở trên trong đệm Na2HPO4 – KH2PO4 trong 4 giờ tỉ lệ enzym 0,2%, pH: 7, tỉ lệ nước 1:5. Sau khi thủy phân 4 giờ, bất hoạt enym, lấy mẫu đánh giá hàm lượng CS tạo thành trong các mẫu thủy phân. Kết quả được trình bày ở hình 3.5 56 Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại) 102 100 98 96 94 92 90 88 6 6.5 7 7.5 8 pH Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân sụn cá tạo CS bằng enzyme neutrase Nhận xét: từ kết quả phân tích hình 3.5 cho thấy giá trị pH trong quá trình thủy phân sụn cá đuối có ảnh hưởng đến hàm lượng CS. Ở thời điểm sau thủy phân hàm lượng CS tạo thành ở các mẫu thủy phân có xu hướng tăng vào đạt giá trị cao nhất ở pH: 7,5. Như vậy sau 4 giờ thủy phân hàm lượng CS tạo thành ở mẫu pH: 7,5 đạt giá trị cực đại và cao gấp 1,09 lần so với mẫu sử dụng pH: 6. Theo kết quả phân tích sâu ANOVA không có sự khác biệt giữa các giá trị pH 6.5; 7; 7.5; 8 là các giá trị nằm trong khoảng pH của nguyên liệu. Kết quả này có thể lý giải là pH ảnh hưởng đến khả năng ion hóa của enzym và cơ chất nếu giá trị PH là tối thích thì tại đó enzym và cơ chất đạt trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng đễ dàng kết hợp với nhau và làm cho vận tốt phản ứng sảy ra cao nhất. Nên khi pH đạt ngưỡng tối thích cấu trúc protein của sụn bị enzym protease phá hủy nhiều nhất đồng thời lượng CS tạo ra là cao nhất. Về nguyên tắc 57 phản ứng thủy phân càng mạnh thì hàm lượng lượng CS tạo thành càng nhiều. Kết quả thực tế cho thấy hoàn toàn đúng với lý thuyết hàm lượng CS tạo ra tăng dần và giảm dần khi quá ngưỡng pH tối thích. Do vậy để tiết kiệm chi phí cho quá trình sản xuất lựa chọn pH nguyên liệu là pH thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối. 3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG ENZYM MEUTRASE Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn. Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…). Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà [35], sụn bò [23]... tuy nhiên đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS khi thu nhận CS. Phương pháp sinh học (dùng enzym) có nhiều ưu việt hơn, cho nên sau khi tìm được các điều kiện thích hợp để thuỷ phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase nhiệt độ 45oC; pH 7,5(pH nguyên liệu); nồng độ enzym 0,2%/10g sụn, 4giờ, tỉ lệ nước 1:5), tiến hành thực hiện quy trình sản xuất CS thô từ sụn cá đuối. Từ các phân tích trên cho phép đề xuất quy trình thủy phân sụn cá đuối tạo CS như hình 3.6 58 Quy trình sản xuất Chondroitin sulfate từ sụn cá đuối bằng phương pháp sinh học sử dung enzym neutrase Sụn cá đuối Nghiền nhỏ Xử lý nhiệt đun trong 1h Bổ sung enzym neutrase Thủy phân Bất hoạt enzym Ly tâm 6000v/phút trong 15 phút Dịch thủy phân Kết tủa protein Ly tâm Dịch CS Kết tủa CS bằng cồn (tỉ lệ 1V dịch/ 2V cồn, để lạnh 40C trong 24 giờ) Chế phẩm CS thô Hình 3.6 Quy trình sản xuất chondirotin sulfate 59 3.4 THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ĐỂ TẠO CS THEO QUY TRÌNH ĐÃ ĐỀ XUẤT Từ quy trình đề xuất trên, tiến hành thủy phân sụn cá đuối bằng enzyme Neutrase. Tiến hành thử nghiệm sản xuất CS theo quy trình ở hình 3.6.Kết quả được thể hiện ở hình 3.7 – 3.15 Hình 3.7. Sụn cá đuối Hình 3.8. Sụn cá đuối xay nhuyễn 60 Hình 3.9. Bổ sung nước tỉ lệ 500%/100g Hình 3.10. Xử lý nhiệt 1h 61 Hình 3.11. Dịch sau thủy phân Hình 3.12. Dịch sau ly tâm Hình 3.13. Dịch sau tủa TCA Hình 3.14.Dịch sau lọc tủa TCA 62 Hình 3.15. Dịch sau tủa cồn Hình 3.16.Thu kết tủa CS Kết quả: Tiến hành sản xuất CS theo quy trình đã khảo sát trên cho 100g sụn • Khối lượng CS khô: 2.81415(g) • Lượng sụn khô có trong 100g sụn đi sản xuất CS (với hàm ẩm nguyên 63 liệu: 65.86%, hàm ẩm khi bổ sung nước xay sụn 35.3%)là: 22.088(g) sụn khô Vậy hiệu xuất thu hồi CS thô là: 12.74% so với trọng lượng sụn khô Nhận xét: từ kết quả được trình bày ở hình 3.7 – 3.15 cho thấy áp dụng theo quy trình hình 3.6 đã thu được chondirotin sulfate là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nước vì thế rất dễ hút ẩm. Có hiệu xuất thu hồi CS thô là: 12.74% so với trọng lượng sụn khô. 3.5 NGHIÊN CỨU KẾT TỦA CHONDROITIN SULFATE Chọn tỉ lệ dung môi Lấy dịch CS sau thủy phân sử dung cồn 96 tạo kết tủa. Sau 24 giờ tại 4ºC, các polysacharid kết tủa được thu hồi bằng cách ly tâm ở tốc độ 6.000 v/phút tại 4ºC trong 15 phút. Chọn tỉ lệ cồn cho hiệu quả thu hồi CS cao nhất. Em tiến hành chọn tủa với 3 tỉ lệ 1:2, 1:3, 1:4 /10g sụn, thuỷ phân tạo kết tủa, thu CS, cân xác định khối lượng CS thu được trong bảng 3.3. Bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi cân bằng cân phân tích chính xác đến đến 4 chữ số. Bảng 3.2 Hàm lượng CS (mg) trong tủa thu được Tỷ lệ (V mẫu/V ethanol) Hàm lượng CS (mg) trong tủa thu được/50ml dịch CS sau thủy phân 1:2 344,50 1:3 347,80 1:4 349,0 Kết quả bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ 1:3 thu được hàm lượng CS cao nhất, với 1 thể tích mẫu và 2 thể tích ethanol cho hiệu quả kinh tế tốt nhất khi thu nhận CS. Chọn tỉ lệ 1:2 64 3.6 ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE Bảng 3.3 Đánh giá quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzyme neutrase STT CHỈ TIÊU ĐƠN VỊ KẾT QUẢ 1 Hàm lượng protein trước thủy phân mg/l 1619.8 2 Hàm lượng protein sau thủy phân mg/l 636.18 3 Hàm lượng CS thô thu được sau thủy phân mg/l 281 Nhận xét: từ kết quả phân tích ở bảng 3.4 tính được hiệu suất phản ứng thủy phân là 60,7 % và hàm lượng CS thô thu được chiếm 14,7% so với khối lượng protein bang đầu. 65 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Từ các nghiên cứu trên cho phép rút ra một số kết luận sau: 1) Đã tiến hành thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase và thu được một số thông số thích hợp cho quá trình thủy phân: pH nguyên liệu, nhiệt độ 45ºC, thời gian thủy phân 4 giờ, tỷ lệ enzym bổ sung: 0,2%/ khối lượng sụn (hoạt độ:1.05 pu/g), tỉ lệ nước thủy phân 500% so khối lượng sụn. 2) Đã đề xuất quy trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase để sản xuất CS thô từ sụn cá đuối và sản xuất thử CS với hiệu suất 12.74% so với trọng lượng sụn khô. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Từ nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất ý kiến: 1) Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất CS từ sụn cá đuối bằng enzym neutrase. 2) Nghiên cứu tinh chế CS thu được từ sụn cá đuối và đánh giá chất lượng CS thu được. 3) Trong thành phần sụn có rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học như collagen, hyaluronic acid, và các glycosaminoglycan khác không phải CS. Nghiên cứu sử dụng chế phẩm CS thô làm thực phẩm chức năng sẽ giảm giá thành so với CS tinh sạch và đồng thời cũng tận thu được các hoạt chất quý hiếm khác có trong sụn. 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Đặng Thị Thu Hương (2013), Bài giảng thiết kế và phân tích thí nghiệm, Trường đại học Nha Trang. 2. Đặng Văn Hợp, Đỗ Minh Phụng, Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thuần Anh (2010), Phân tích kiểm nghiệm thực phẩm thủy sản, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, Trang 115-122. 3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Ánh (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất bản giáo dục Hà Nội, Trang: 117-126 5. Phạm Thị Khánh Vân, Vũ Thị Thái (2004), “Tác dụng của Chondrroiti sulfateTạp chí Thuốc và Sức khoẻ”, số 273, Hà Nội. 6. Võ Hoài Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh, (2010), “Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học”. Tạp chí Khoa học, Viện nghiên cứu Hải sản, số 16, Hải Phòng, Trang 26-30. 7. Vũ Thị Thanh Tâm (2012), Nguyên cứu quy trình thu nhận chondroitin sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp sinh học, Trường đại học Nha Trang. Nước ngoài 8. Bernfield M, Gotte M, Park P.W, Reizes O, Fitzgerald M.L, Lincecum J, and Zako M. (1999), Functions of cell surface heparin sulfate proteoglycans. Annu. Rev, Biochem, 729-777. 9. Bruyere O, Reginster JY (2007), Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee and hip osteoarthritis. Drugs Aging, 573-580. 10. Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A, (2007), Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage, Chemical Engineering and Processing, 465-471. 67 11. IovuM,DumaisG andduSouichP.(2008)Anti-inflammatory activityof chondroitin sulfate, Osteoarthritis Cartilage, 8-14. 12. Somashekar P.L, Tripathy A. S, Sathish K.P, Chandrashekar Javali and Palakshi Gouda, scholars research library (2011), Colorimetric estimation of Chondroitin Sulfate in bulk drug and pharmaceutical formulation using cationic dye Methylene Blue, Ấn Độ 13. Kazufusa S, Yozo K, Toshihiko T, Toshio I, Yoichiro I, (2001), Separation of chondroitin sulfate and hyaluronic acid fragments by centrifugal precipitation chromatography, Journal of Chromatography A, 365-369. 14. Luo XM, Fosmire GJ, Leach RMJr, (2002).Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate. Poult Sci, 1086-1089. 15. Sikder K,Das A. (1979), Isolation and characterization of glycosaminoglycan (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita, Carbohydr, Res, 273-285. 16. Selleck SB, (2000), Proteoglycans and pattern formation: sugar biochemistry meets developmental genetics, Trends Genet, 206-212. 17. Silbert JE, Sugumaran G. (2002), Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate, IUBMB Life 54, 177-186. 18. T. Anakano và L. Ozimek.(2002)university Alberta, Edmonton, AB, Canada,An economical method to extract chondroitin sulphate-peptide from bovine nasal cartilage. 19. Xie, J., Ye, H. I. và Lou, X. F, University of Technolog, Chinese, An efficient preparation of chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage. 20. Xie, J., Ye, H. I. và Lou, X. F, University of Technolog, Chinese, An efficient preparation of chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage. Trang wed đã tham khảo 21. http://www.hiendaihoa.com/environment_detail.php?id=224 22. http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn 23. http://ccbolgroup.com/hierbas2E.html 68 24. http://vi.wiktionary.org/wiki/hplc 25. http://wikipedia.Cartilage http://wikipedia.BME/ME 456 Biomechanics 26. http://wikipedia.Chondrroitin Sulfate 27. http://kkhtn.duytan.edu.vn/Home/ArticleDetail/vn/110/1282/cach-pha-motso-dung-dich-dem-thuong-dung. 69 PHỤ LỤC PHỤ LỤC I: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC SỤN CÁ ĐUỐI VÀ HOẠT ĐỘ ENZYM NEUTRASE 1.1 Hoạt độ enzym Bảng 1.1 : Nồng độ tyrosine Nồng độ tyrosine 0,01 (µmol/ml) OD 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 0,026 0,057 0,084 0,094 0,113 0.143 0,151 0,174 0,185 0,201 Từ kết quả ở Bảng 1.1, đựng đồ thị đường chuẩn tryrosine kết quả được thể hiện ở hình 1.1 0.25 y = 1.795x + 0.0259 R² = 0.99 OD 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Nồng độ tryrosine Hình 1.1. Đồ thị đường chuẩn trysosine Đo hoạt độ enzyme Neutrase: 1g pha 150ml nước cất. (Tiến hành các bước theo phương pháp Ason) Đo OD: 0,026. 70 1.2. Thành phần hóa học sụn cá đuối 1.2.1 Xác định độ ẩm mẫu sụn cá đuối Khối lượng cốc sấy đến khối lượng không đổi: 21.2158 (g) Khối lượng cốc và mẫu trước sấy: 26.3154 (g) Khối lượng cốc và mẫu sau sấy: 23.2407 (g) 1.2.2. Xác định hàm lượng tro mẫu sụn cá đuối. Khối lượng chén nung sấy đến khối lượng không đổi: 21.0519 (g) Khối lượng chén và mẫu trước khi nung: 24.4607 (g) Khối lượng chén và mẫu sau khi nung: 21.5822 (g) Vậy hàm lượng tro tông số của sụn là: 15.56 % 1.2.3 Xác định nito tổng số mẫu sụn cá đuối Với độ ẩm sụn 65.86%. Phần trăm nito tổng số trong sụn cá đuối là : 13.8% - Nồng độ nitơ tổng số PN (mg/l) trước thủy phân được tính theo công thức là 259.18(mg/l). Vậy hàm lượng protein trong mẫu sụn trước thủy phân là1619.8 (mg/l) - Nồng độ nitơ tổng số PN (mg/L) sauthủy phân được tính theo công thức là 154.11(mg/l). Vậy hàm lượng protein trong mẫu sụn sau thủy phân là636.18(mg/l) - Vậy hiệu suất của phản ứng thủy phân là: 60,7% 71 PHỤ LỤC II: KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ CỦA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI BẰNG ENZYM NEUTRASE 2.1 Kết quả xác định thông số nồng độ enzym bổ sung Bảng 2.1. Kết quả xác định hàm lượng CS theo tỷ lệ enzym thủy phân Nồng độ enzym (%/10g sụn) Lần 1 Hàm lượng Lần 2 CS Lần 3 (mg/10g sụn) TB 0 0,1 0,2 0,3 0,4 68,3303 70,0113 67,8884 68,7433± 0,912 82,4452 82,3326 81,67403 82,1506± 0,416 86,5003 87,9473 87,5921 87,3466± 0,754 86,0584 86,509 85,9458 86,1710± 0,298 85,0619 85,2179 86,00641 85,4288± 0,506 Bảng 2.2 Kết quả phân tích phương sai và phân tích sâu anova về sự khác biệt giữa các nồng độ enzym với hàm lương CS giải phóng trong dịch thủy phân Test of Homogeneity of Variances y Levene Statistic df1 df2 2.626 4 Sig. 10 .098 ANOVA y Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df 700.491 4.684 705.174 Mean Square 4 10 14 F 175.123 .468 Sig. 373.888 .000 y Duncan x N Subset for alpha = 0.05 1 .00 .10 .40 .30 .20 Sig. 3 3 3 3 3 2 3 4 68.7433 82.1506 85.4288 86.1710 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. .214 86.1710 87.3466 .062 72 2.2 Kết quả xác định thông số nhiệt độ thích hợp Bảng 2.3. Kết quả xác định hàm lượng CS theo nhiệt độ thủy phân Nhiệt độ Lần 1 Hàm Lần 2 lượng CS Lần 3 (mg/10g TB sụn) 40 82,0342 83,0579 82,4794 82,5238 ± 0,513 45 90,3305 89,4701 91,2782 90,3596 ± 0,90 50 91,0591 91,3291 92,1198 91,5027 ± 0,551 55 84,4081 85,7647 86,0153 85,3961± 0,864 60 77,1543 76,5828 77,9701 77,2358 ± 0,697 Bảng 2.4 : Kết quả phân tích phương sai và phân tích sâu anova về sự khác biệt giữa các nhiệt độ với hàm lương CS giải phóng trong dịch thủy phân Test of Homogeneity of Variances Y Levene Statistic df1 df2 .431 4 Sig. 10 .784 ANOVA Y Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df 408.103 5.207 413.309 Mean Square 4 10 14 F 102.026 .521 Sig. 195.952 .000 Y Duncan X N Subset for alpha = 0.05 1 60.00 40.00 55.00 45.00 50.00 Sig. 3 3 3 3 3 2 3 4 77.2667 82.5000 85.3667 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 1.000 90.3667 91.4667 .091 73 2.3 Kết quả xác định thông số tỉ lệ nước thích hợp Bảng 2.5 Kết quả xác định hàm lượng CS theo tỉ lệ nước Tỉ lệ nước (ml/10g sụn) Lần 1 Hàm Lần 2 lượng CS Lần 3 (mg/10g sụn) TB 40 50 60 70 80 89,7536 90,6299 92,0796 90,821 ± 1,175 94,1684 93,3316 92,8637 93,4546 ± 0,661 93,8521 94,8603 93,5095 94,074 ± 0,702 91,3152 90,7288 91,8622 91,3021± 0,567 88,0469 89,4636 88,3303 88,6136 ± 0,749 Bảng 2.6 : Kết quả phân tích phương sai và phân tích sâu anova về sự khác biệt giữa các tỉ lệ nước với hàm lương CS giải phóng trong dịch thủy phân Test of Homogeneity of Variances t Levene Statistic df1 .687 df2 4 Sig. 10 .617 ANOVA t Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df 57.090 6.080 63.170 Mean Square 4 10 14 14.272 .608 F Sig. 23.473 .000 t Duncan z N Subset for alpha = 0.05 1 80.00 40.00 70.00 50.00 60.00 Sig. 3 3 3 3 3 2 3 88.6167 90.7667 91.2867 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. .433 93.4000 94.0700 .317 74 2.4 Kết quả xác định thông số thời gian thích hợp Bảng 2.7 Kết quả xác định hàm lượng CS theo thời gian thủy phân Thời gian 2h 85,4391 86,9456 85,6324 86,0057 ± 0,81 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Hàm lượng CS (mg/10g sụn) TB 3h 89,4787 88,9921 87,8589 88,7766 ± 0,831 4h 94,6916 96,5048 94,9449 95,3804 ± 0,982 5h 94,5449 95,6648 95,8781 95,362± 0,716 6h 94,6783 94,9316 96,5781 95,396 ± 1,031 Bảng 2.8. Kết quả phân tích phương sai và phân tích sâu anova về sự khác biệt giữa các thời gian thủy phân với hàm lương CS giải phóng trong dịch thủy phân Test of Homogeneity of Variances Y Levene Statistic df1 .264 df2 4 Sig. 10 .895 ANOVA Y Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df 241.902 7.875 249.777 Mean Square 4 10 14 F 60.476 .787 Sig. 76.794 .000 Y Duncan X N Subset for alpha = 0.05 1 2.00 3.00 5.00 4.00 6.00 Sig. 3 3 3 3 3 2 3 85.9800 88.7833 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 1.000 95.3567 95.3800 95.3933 .962 75 2.5 Kết quả xác định thông số pH thích hợp Bảng 2.9. Kết quả xác định hàm lượng CS theo pH thủy phân pH Hàm lượng CS (mg/10g sụn) 6 91,2647 89,645 91,1568 90,6888± 0,905 Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 6.5 96,2386 94,7336 96,0227 95,665 ± 0,814 7 96,1712 94,8956 96,3264 95,7977 ± 0,785 7.5 97,278 95,7932 97,5209 96,864 ± 0,935 8 97,2442 95,6582 97,1362 96,6796 ± 0,886 Bảng 2.10 Kết quả phân tích phương sai và phân tích sâu anova về sự khác biệt giữa các giá trị pH thủy phân với hàm lương CS giải phóng trong dịch thủy phân Y Duncan X N Subset for alpha = 0.05 1 6.00 6.50 7.00 8.00 7.50 Sig. 3 3 3 3 3 2 90.6833 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. 95.6700 95.7933 96.6733 96.8533 .151 76 PHỤ LỤC III: NGHIÊN CỨU KẾT TỦA CHONDROITIN SULFATE Chọn tỉ lệ dung môi Lấy dịch CS sau thủy phân sử dung cồn 96 tạo kết tủa.Sau 24 giờ tại 4ºC, các polysacharid kết tủa được thu hồi bằng cách ly tâm ở tốc độ 6.000 v/phút tại 4ºC trong 15 phút. Chọn tỉ lệ cồn cho hiệu quả thu hồi CS cao nhất. Bằng phương pháp quang sát bằng mắt kết quả được thể hiện ở bảng 3.1 Bảng 3.1Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi CS Tỷ lệ (V mẫu/ V Hàm lượng CS trong tủa/10ml dịch CS sau thủy phân ethanol) (quan sát bằng mắt) 1:0.5 Kết tủa ít, chưa nhìn thấy rõ 1:1 Lượng kết tủa bắt đầu tăng lên 1:2 Hàm lượng kết tủa nhiều, thấy rõ rệt trong toàn bộ dịch 1:3 Lượng kết tủa cũng giống ở tỉ lệ 1:2 không thấy sự khác biệt 1:4 Lượng kết tủa cũng giống ở tỉ lệ 1:2 không thấy sự khác biệt [...]... trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase (tỉ lệ enzym, pH thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân, tỉ nước thích hợp) 2) Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin sulfate bằng enzym neutrase 3) Thử nghiệm tạo chondroitin sulfate từ sụn cá đuối Ý nghĩa khoa học của đề tài - Các kết quả thu được của đề tài là cơ sở khoa học cho việc sử dụng neutrase trong thủy phân sụn. .. Chondroitin Sulfate từ nguyên liệu thủy sản bằng phương pháp sinh học và nhận thấy rằng sử dụng enzym thủy phân sụn cá đuối ở Việt Nam đã thu CS Tuy vậy hiệu suất còn thấp, thời gian thủy phân dài 24 giờ 1.4.2 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thô Quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn có thể được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học (dùng enzym) để thuỷ phân sụn. .. chiết CS bằng công nghệ sinh học trên đối tượng sụn cá đuối Sử dụng nguyên liệu sụn cá đuối dễ tìm, giá thành thấp và là phế liệu của các nhà máy chế biến - Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym neutrase (nhiệt độ thích hợp, pH, tỉ lệ enzym, thời gian thủy phân) - Ứng dụng các thông số đã tối ưu trên đề xuất quy trình sản xuất CS thô - Chọn phương pháp định... trong các mẫu sụn cá đuối Việt Nam Mẫu sụn % CS/trọng lượngsụn khô Cá đuối (Dasyatis Kuhlii) 12,0 ± 1,54 Do CS liên kết với protein và là thành phần cấu tạo trong sụn, nên sụn cá cần phải được thủy phân để loại protein mới có thể xác định được hàm lượng CS Sử dụng emzym để thủy phân mẫu sụn và dùng phương pháp DMMB để xác định hàm lượng CS Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 cho thấy hàm lượng CS trong sụn. .. thực nghiệm thử nghiệm sử dụng các chất có tính dược học vào đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của sụn cá 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN BỐ VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁ ĐUỐI 1.1.1 Đặc điểm hình thái Hình 1.1 cá đuối bồng mõm nhọn Bảng 1.1 Tên các loại cá đuối TÊN LOẠI THỦY SẢN TÊN KHÁC (ĐỊA TÊN THƯƠNG MẠI TÊN KHOA HỌC PHƯƠNG) (TIẾNG ANH) (LATINH) Cá đuối. .. đuối quạt Cá đuối Holland kate, stringray fish Raja hollandi Cá đuối bồng đuôi vằn Cá đuối Blue spotted stingray fish Dasratis kuhlii Cá đuối bồng mõm nhọn Cá đuối Pake- edged stringray, stringray fish Dasyatis zugei Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt giống như cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn chủ yếu sinh sống ngoài biển, nghĩa là chúng có bộ xương không cấu tạo từ... chất sụn cứng và đàn hồi Phần lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng, gọi là các khe 4 mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt Phần lớn các loài cá đuối có 5 khe mang nhưng có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi ở cá nhám và cá mập thì các khe mang ở hai bên đầu Phần lớn các loài cá đuối. .. phân sụn 16 Trong phương pháp hoá học mô sụn được xử lý bằng nước nóng, dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…) Phương pháp này đã áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò tuy nhiên, đã xuất hiện việc phá vỡ các liên kết glycoside của CS khi thu nhận CS Phương pháp sinh học dùng enzym để thuỷ phân mô sụn là phương pháp có hiệu quả... enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản xuất chondroitin sulfate” có ý nghĩa thực tiễn cao và nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà trong giai đoạn tới Mục đích của đề tài: Đánh giá khả năng sử dụng enzym neutrase trong thủy phân sụn cá đuối để sản xuất chondroitin sulfate Nội dung của đề tài: Đề tài cần thực hiện nhiệm vụ chính sau: 1) Xác định các điều kiện thích... Hg, As) 20 1.5 ENZYM NEUTRASE VÀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 1.5.1 Enzym Protease Enzym protease là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein, loại enzym này chỉ xúc tác cho quá trình thủy phân mà cơ chất chính là protein.Là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử protein tạo thành các polypeptide, các peptide ngắn mạch và acid amin Các protease chiếm ...BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ KIM HƯƠNG THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYM NEUTRASE ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP... gian thủy phân thích hợp 54 3.2.5 Xác định pH thủy phân thích hợp 55 3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI TẠO CHONDROITIN SULFATE BẰNG ENZYM MEUTRASE 57 3.4 THỬ NGHIỆM THỦY... CS tạo thành từ sụn cá 53 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian đến khả thủy phân sụn cá tạo CS enzyme neutrase 54 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH đến khả thủy phân sụn cá tạo CS enzyme