Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease trong thủy phân sụn cá đuối (daisyatis zugei) tạo chondrotin sunfat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - HOÀNG VĂN TIẾN NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN LOẠI ENZYME PROTEASE TRONG THỦY PHÂN SỤN CÁ ĐUỐI ( Dasyatis zugei ) TẠO CHONDROTIN SUNFAT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Vũ Ngọc Bội Nha Trang, tháng năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đồ án Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc em xin giành cho: TS Vũ Ngọc Bội - Khoa Cơng nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang TS Nguyễn Duy Nhứt Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang tận tình hướng dẫn động viên em suốt q trình thực đồ án Xin cảm ơn q thầy giáo khoa Cơng nghệ Thực phẩm tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt thời gian qua Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ gia đình bạn bè ln ln chia sẻ em q trình nghiên cứu ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SỤN ĐỘNG VẬT 1.2 CHONDROITIN SUNFATE 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc Chondroitin sulfate 1.2.2 Thu nhận định lượng Chondroitin sulfate 10 1.2.2.1 Các phương pháp thu nhận Chondroitin sulfate thơ 10 1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất định lượng Chondroitin sulfate 11 1.2.3 Ứng dụng Chondroitin sulfate 12 1.2.3.1 Ứng dụng y học 12 1.2.3.2 Các ứng dụng khác 14 1.3 PROTEASE 14 1.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme 17 1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ ĐUỐI 21 CHƯƠNG NGUN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 NGUN VẬT LIỆU 25 2.1.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) 25 2.1.2 Enzyme protease 26 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Phương pháp phân tích 27 2.2.1.1 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson 27 2.2.1.2 Định lượng Chondroitin sulfate so màu với Methylene blue 29 2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm ẩm 32 2.2.1.4 Phương pháp xác định tro tồn phần 32 2.2.1.5 Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số 33 iii 2.2.2 Phương pháp sinh học tách chiết Chondroitin sulfate 35 2.2.3 Bố trí thí nghiệm 36 2.2.3.1 Quy trình dự kiến thu nhận CS thơ 36 2.2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm ngun liệu nghiên cứu 39 2.2.3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian tối thích 41 2.2.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp 42 2.2.3.5.Thử nghiệm sơ thủy phân sụn cá thu nhận đánh giá CS thơ 43 2.3 HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 44 2.3.1 Hóa chất 44 2.3.2 Thiết bị 45 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU 45 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 NGHIÊN CỨU XỬ LÍ SỤN CÁ ĐUỐI 46 3.1.1 Phân tích thành phần hóa học sụn cá đuối 46 3.1.2 Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối 42 3.2 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN NGUỒN ENZYME THÍCH HỢP 48 3.2.1 Xác định hoạt độ enzym papain, alcalase, neutrase 49 3.2.2 Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá 50 3.2.3 So sánh khả thủy phân sụn cá Papain, Alcalase Neutrase 51 3.3 THỬ NGHIỆM SƠ SỘ THỦY PHÂN SỤN CÁ THU NHẬN CS THƠ 53 3.3.1 Đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân chọn 53 3.3.2 Đánh giá q trình thủy phân hiệu suất thu hồi CS enzyme Neutrase 54 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56 I KẾT LUẬN 56 II KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 PHỤ LỤC 60 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần mơ sụn Bảng 1.2 Phân loại chondroitin sulfate Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn tyrosine 28 Bảng 3.1 Tỷ lệ thành phần khối lượng sụn cá đuối 46 Bảng 3.2 Thành phần hóa học sụn cá đuối 46 Bảng 3.3 Bảng đánh giá mẫu sụn sau xử lý 47 Bảng 3.4 Kết xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson 49 Bảng 3.5: Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá 50 Bảng 3.5 Hiệu thuỷ phân sụn cá protease 52 Bảng 3.6 Hàm lượng CS thủy phân enzyme Neutrase với tỉ lệ khác 53 Bảng 3.7 Bảng tiêu đánh giá q trình thủy phân 54 Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi CS thơ enzyme chọn 55 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hố học đơn vị chuỗi CS Hình 1.2 Cấu trúc mạch CS Hình 1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng enzyme 19 Hình 1.4 Ảnh hưởng pH đến phản ứng enzyme 20 Hình 1.5 Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) 22 Hình 2.1 Sụn cá đuối bồng mõm nhọn ( Dasyatis zugei ) 25 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận CS thơ từ sụn cá đuối 36 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xử lý sụn cá đuối làm ngun liệu nghiên cứu 39 Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm chọn thời gian tối thích 41 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn enzyme thích hợp 42 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân chọn 43 Hình 3.1 Hình ảnh sụn cá đuối sau xử lý 48 Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo thời gian thủy phân 51 Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme 52 vi KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT A664 Đo OD bước sóng 664 nm CĐ Cá đuối CPC Cetylpyridium chloride CS Chondroitin sunfate CS4 Chondroitin-4-sulfate CS6 Chondroitin-6-sulfate CTAB Cetyltrimethylamnonium bromide GAG Glycosaminoglycan GalNAc N-acety-D-lgalactosamine OD Optical Density PG Proteoglycan TCA Tricloacetic MỞ ĐẦU Hiện nay, nước ta có khoảng 300 sở chế biến thủy sản 200 nhà máy chun sản xuất sản phẩm đơng lạnh phục vụ xuất Theo báo cáo “Đánh giá tác động mơi trường lĩnh vực thủy sản năm 2002” tổng lượng chất thải rắn như: đầu, xương, da, vây, vẩy… từ nhà máy chế biến thủy sản ước tính khoảng hàng trăm tấn/năm [25] Nhiều dược liệu q chiết xuất từ ngun liệu lại nhà máy chế biến thuỷ sản glucosamine chiết xuất từ vỏ tơm, chondroitin từ sụn cá mập [14] Chondrotinsunfat thành phần có sụn loại động vật: cá, gà, heo( lợn )… Do từ loại sụn người ta sản xuất chondroitin sunfat để sử dụng điều trị bệnh khớp, mắt bệnh khác Vì vậy, việc điều tra nghiên cứu nguồn dược liệu từ ngun liệu lại sau chế biến cần thiết, khơng tận dụng nguồn phế liệu lại mà nâng cao hiệu chế biến Chondroitin sulfate (CS) thành phần cấu tạo nên sụn khớp, CS có mặt tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo vận động linh hoạt tính đàn hồi hoạt động khớp, tạo độ bền bị nén ép CS có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý xương khớp CS làm tăng sản xuất chất nhầy khả bơi trơn dịch khớp, đảm bảo chức dinh dưỡng vận động linh hoạt khớp Vì vậy, CS giúp giảm ngăn chặn q trình thối hố khớp [6] CS có vai trò bảo vệ sụn khớp ức chế enzym phá huỷ sụn khớp collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase [4] Ngồi CS góp phần ni dưỡng tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc Một tác dụng quan trọng khác CS khả ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển CS có khả kháng viêm, ức chế tiết cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, nitric oxid gốc oxy hóa tự [9] Hiện thuốc kết hợp CS glucosamine sử dụng hiệu để điều trị bệnh viêm khớp Do phân tử CS đa dạng phức tạp, CS chưa tổng hợp đường hóa học tách chiết từ nguồn ngun liệu tự nhiên Những năm trước CS tinh chế chủ yếu từ sụn cá mập, giá thành cao Một số nghiên cứu giới tách chiết CS từ số nguồn ngun liệu từ da cá Labeo rohita [21], cá mập [22], sụn gà [23], sụn bò [24] Việc nghiên cứu để tách chiết CS từ nguồn ngun liệu khác nhà nghiên cứu giới quan tâm đặc biệt nhằm hạ giá thành sản phẩm Để sản xuất CS từ sụn động vật có nhiều phương pháp khác sử dụng acid, sử dụng nhiệt, sử dụng enzyme protease Trong số phương pháp sử dụng thủy phân sụn động vật phương pháp sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm khơng độc hại, sản phẩm sau thủy phân khơng bị biến đổi gốc sunfat…do nhà nghiên cứu quan tâm đến việc sử dụng enzyme protease để thủy phân sụn động vật Trong loại động vật có sụn, cá loại động vật nghiên cứu nhiều sụn cá thường tách chế biến Mặt khác, số loại cá sụn cá đuối, cá mập lại có giá thành thấp Vì việc nghiên cứu tận dụng loại cá sụn sản xuất CS nghiên cứu đáng quan tâm Mà loại cá sụn cá đuối (Dasyatis zuge) loại động vật dễ kiếm giá thành thấp Việt Nam Do vậy, đề tài: " Nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease thủy phân sụn cá đuối ( Dasyatis zugei ) tạo Chondrotin sunfat” có ý nghĩa thực tiễn cao nhiều triển vọng để ứng dụng vào thực tế sản xuất dược phẩm nước nhà giai đoạn tới Mục tiêu đề tài: Thử nghiệm sử dụng enzyme protease thay hóa chất thủy phân sụn cá đuối để sản xuất CS Đề tài cần thực nhiệm vụ sau:  Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối tiền thủy phân;  Nghiên cứu lựa chọn loại protease thích hợp thể thủy phân sụn cá đuối tạo chondroitin sulphate số loại protease ( Neutrase, alcalase, papain)  Sơ thử nghiệm thủy phân sụn cá đuối protease chọn Ý nghĩa khoa học đề tài Lần nghiên cứu cách có hệ thống việc tìm chọn enzym thơng số cho quy trình tách chiết chondroitin sulfate từ sụn cá đuối, nguồn bổ sung tư liệu có tính khoa học tính chất dược lý CS Các kết thu đề tài bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho nhà nghiên cứu sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế thải thuỷ sản Ý nghĩa thực tiễn đề tài: Kết nghiên cứu đề tài sở cho nhà thực nghiệm thử nghiệm sử dụng chất có tính dược học vào đời sống người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng sụn cá 52 Bảng 3.5 Hiệu thuỷ phân sụn cá protease Hàm lượng CS (mg/ 10 g sụn ) Loại protease STT Papain (6,7 mg/10g sụn); 65 ºC; pH 7,0 Neutrase (10mg/10g sụn); 45ºC; pH 7,0 Alcalase tỷ lệ 0,075ml (7,875 PU/ml)/10g sụn; 55ºC; pH 7,0 265.745 285.6404 273.5651 Hàm lượng CS tương đối ( % sụn cá cực đại ) 102 100 100 98 95.77 96 94 93.03 92 90 88 Neutrase Alcalase Papain Loại enzyme Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme Nhận xét: Từ kết phân tích cho thấy enzyme khác khả thủy 53 phân sụn cá khác Cụ thể chế phẩm enzyme Neutrase có khả thủy phân sụn cá tốt so với enzyme papain alcalase Cùng thời gian 4h thủy phân hàm lượng CS tạo thành mẫu Alcalase, Papain 95.77% 93.0% so với hàm lượng CS tạo thành mẫu Neutrase 100% Như enzyme Neutrase có khả thủy phân sụn cá tốt so với Alcalase Papain Kết phù hợp với để tài nghiên cứu có liên quan 3.3 THỬ NGHIỆM SƠ SỘ THỦY PHÂN SỤN CÁ THU NHẬN CS THƠ 3.3.1 Đánh giá hàm lượng CS theo tỉ lệ enzyme thủy phân chọn Sau xây dựng quy trình thu nhận CS thơ chọn lọc enzyme Neutrase làm enzyme thủy phân Tiến hành mẫu thử nghiệm thủy phân sụn cá enzyme Neutrase với tỉ lệ enzyme sử dụng khác Mẫu đối chứng Mẫu tỉ lệ Neutrase sử dụng 0.01g /20g mẫu; Mẫu tỉ lệ neutrase sử dụng 0,02g enzyme/ 20g mẫu; Mẫu tỉ lệ neutrase sử dụng 0,03g enzyme/ 20g mẫu) Sau dừng q trình thủy phân lấy mẫu dịch xác định hàm lượng CS Kết trình bày bảng 3.3: Bảng 3.6 Hàm lượng CS thủy phân enzyme Neutrase với tỉ lệ khác Tỉ lệ enzyme ( g /20g sụn) Đối chứng 0.01 209.418 312.678 0.02 0.03 Hàm lượng CS thơ (mg / 20 g 317.916 320.279 sụn ) Từ bảng 3.6 ta thấy quy trình thủy phân sụn cá thu nhận CS thơ dùng enzyme Neutrase với tỉ lệ nồng độ khác thủy phân cho hàm lượng khác cao so với mẫu đối chứng Như vậy, chứng tỏ quy trình thủy phân sụn cá đuối enzyme Neutrase cho kết có CS 54 hàm lượng cao so với mẫu khơng sử dụng enzyme để thủy phân cần nghiên cứu điều kiện khác hàm lượng CS tốt 3.3.2 Đánh giá q trình thủy phân hiệu suất thu hồi CS enzyme Neutrase Đánh giá q trình thủy phân Tiến hành thủy phân sụn cá Neutrase theo thơng số chọn Kết thủy phân trình bày bảng 3.3.2: Bảng 3.6 Bảng tiêu đánh giá q trình thủy phân STT Chỉ tiêu Đơn vị Kết Hàm lượng protein ( g protein/lít ) 91 Hàm lượng CS thơ g/50g sụn 2.47 Từ bảng ta thấy với thơng số thủy phân enzyme Neutrase chọn hàm lượng protein sau thủy phân cao, hàm lượng CS thơ thu thấp Nên cần nghiên cứu thơng số enzyme khác để thủy phân sụn cá cho hiệu suất cao nhât Đánh giá hiệu suất thu hồi CS thơ enzyme chọn Sau thủy phân sụn cá 50 g ( hàm ẩm 64,74 % ) 4h, 450C, với 0,1g Neutrase/ 50g sụn, dịch sau thủy phân ly tâm 6000v/phút 15 phút Ethanol dung mơi hữu thường sử dụng tủa protein polysacharid Ethanol nồng độ cao háo nước làm lớp vỏ hydrat protein làm protein kết tủa Tuy nhiên phụ thuộc vào nồng độ ethanol mà thu hàm lượng CS cao Từ dịch chứa CS sau thủy phân, sử dụng nồng độ ethanol với tỷ lệ thể tích mẫu thể tích ethanol để khảo sát thu hồi CS hiệu Sau 24 4ºC, polysacharid kết tủa thu hồi cách ly tâm tốc độ 6.000 v/phút 15 phút Kết bảng 3.3.3 cho thấy với tỷ lệ thể tích mẫu thể tích ethanol (nồng độ ethanol khoảng 70%) cho hiệu thu nhận CS cao Cần nghiên cứu thêm nồng độ ethanol khác để biết 55 nồng độ ethanol cho thu nhận CS cao Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi CS thơ enzyme chọn Enzyme Neutrase ( 0,1g / 50 g sụn); 450C , pH= 7,5; 4h Khối lượng CS thơ ( g ) 2.47 % CS thơ/ khối lượng sụn khơ 14.01 56 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN I KẾT LUẬN Từ nghiên cứu cho phép rút số kết luận Đã tiến hành nghiên cứu xử lý sụn cá đuối thu số thơng số thích hợp: nhiệt độ nước xử lý 900C, tốc độ vòng quay máy xay 25000 vòng/ phút Sau xử lý thu sụn cá có tỷ lệ so với ngun liệu 13.33% hàm lượng protein có sụn cá chiếm 12.03%, hàm ẩm sụn cá 64.74%, hàm lượng tro 15.84% Enzyme Neutrase enzyme thích hợp cho q trình thủy phân sụn cá Đã nghiên cứu tiến hành thử nghiệm sơ thủy phân sụn cá đuối enzyme Neutrase với tỷ lệ enzyme khác nhau, pH = 7,5, nhiệt độ 450C thời gian 4h Và kết cho thấy quy trình thủy phân sụn cá đuối cho kết thu CS tỉ lệ enzyme khác cho hàm lượng CS khác nên cần nghiên cứu sâu rộng để có thơng số ý nghĩa II ĐỀ XUẤT Ý KIẾN - Từ nghiên cứu cho phép đề xuất ý kiến : Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa q trình thủy phân sụn cá enzyme Neutrase nghiên cứu tinh CS từ sụn cá đuối 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, (1998), Cơng nghệ enzyme, Nhà xuất Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Phạm Thị Khánh Vân, Vũ Thị Thái, (2004) Phím nước mắt tác dụng Chondrroitin sulfate, Tạp chí Thuốc Sức khoẻ, số 273 tháng 12/2004 Võ Hồi Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh, (2010), Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii) cá nhám (Carcharhinus sorrah) cơng nghệ sinh học Tạp chí Viện nghiên cứu Hải sản số 16: 26-30 Nước ngồi Antonilli L, Paroli E, (1993), Role of the oligosaccharide inner core in the inhibition of human leukocyte elastase by chondroitin sulfates, 13: 7-11 Bernfield M, Gotte M, Park P.W, Reizes O, Fitzgerald M.L, Lincecum J, and Zako M (1999), Functions of cell surface heparin sulfate proteoglycans Annu Rev, Biochem 68: 729-777 Bruyere O, Reginster JY, (2007), Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee and hip osteoarthritis Drugs Aging 24(7): 573-580 Garnjanagoonchorn W, Wongekalak L, Engkagul A, (2007), Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage, Chemical Engineering and Processing 46 465-471 Hascall V.C (1988), Proteoglycans: The chondroitin sulfate/keratin sulfate proteoglycan of cartilage, Institute for Scientific Information Atlas of Science, Biochemistry, Institute for Scientific Information, Philadelphia, PA (1): 189198 Iovu M, Dumais G and du Souich P (2008) Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate, Osteoarthritis Cartilage 16 (3): 8-14 10 Kamata K, Takahashi M, Terajima K, Nishijima M (1995) Spectrophotometric determination of sodium chondroitin sulfate in eye drops after derivatization with 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazole Analyst 120:2755-2758 11 Kamura T.Na, Matsunaga E, and Shinkai H, (1983) Isolation and some structural analyses of a proteodermatan sulfat from calf skin Biochem J 213 (2): 289-296 12 Kazufusa S, Yozo K, Toshihiko T, Toshio I, Yoichiro I, (2001), Separation of chondroitin sulfate and hyaluronic acid fragments by centrifugal precipitation chromatography, Journal of Chromatography A, 922 365-369 13 Leeb F et al, (2000).Chondroitin sulfate: Clinical review in osteoarthritis, J 58 Rheumatol, 27(1): 205-211 14 Ogamo A, Yamada T, Nagasawa K, (1987), A study on heterogeneity in molecular species of shark cartilage chondroitin sulfate C, Fractionation of the polysaccharide on Sepharose CL-4B in the presence of high concentrations of ammonium sulfate Carbohydr Res 165 (2): 275-280 15 Sarah ET, Ross M, Cristal IG, Sherry MT, Xuewei L, and Linda C HsiehWilson (2004), A Chondroitin Sulfate Small Molecule that Stimulates Neuronal Growth J Am Chem Soc 126 (25), pp 7736–7737 16 Sikder K,Das A (1979), Isolation and characterization of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita, Carbohydr, Res 71: 273-285 17 Shil SC, You SJ, Anb K, Kang CW, (2006), Study on extraction of mucopolysaccharide-protein containing chondroitin sulfate from chicken keel cartilage Asian-australasian journal of animal sciences, 19 (4): 601-604 18 Silbert JE, Sugumaran G (2002), Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate, IUBMB Life 54 (4): 177-186 19 Colorimetric estimation of Chondroitin Sulfate in bulk drug and pharmaceutical formulationusing cationic dye Methylene Blue 20 Folasade M Olajuyigbe and Joshua O Ajele (2005), Production dynamics of extracellular protease from Bacillus species, African Journal of Biotechnology Vol.4(8), pp 776-779 21 Sikder K,Das A (1979), Isolation and characterization of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita, Carbohydr, Res 71: 273-285 22 Ogamo A, Yamada T, Nagasawa K, (1987), A study on heterogeneity in molecular species of shark cartilage chondroitin sulfate C, Fractionation of the polysaccharide on Sepharose CL-4B in the presence of high concentrations of ammonium sulfate Carbohydr Res 165 (2): 275-280 23 Luo XM, Fosmire GJ, Leach RMJr, (2002).Chicken keel cartilage as a source of chondroitin sulfate Poult Sci, 81(7): 1086-1089 24 Nakano T, Nakano K, Sim JS, (1998), Extraction of glycosaminoglycan peptide from bovine nasal cartilage with 0.1M sodium acetate, J Agric Food Chem 46: 772–778 25 Trang Web: http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn http://ccbolgroup.com/hierbas2E.html http://vi.wiktionary.org/wiki/hplc 59 http://wikipedia.Cartilage http://wikipedia.BME/ME 456 http://wikipedia.Chondrroitin Sulfate http://std.com.vn/upload/file/thong-tu-huong-dan-quan-ly-phu-gia-thuc-pham.pdf 60 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết nghiên cứu Bảng 1.1: Đường chuẩn tyrosin 0.1 Nồng độ 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 tyrosine (µmol/ml) 0.026 0.057 0.084 0.094 0.113 0.143 0.151 0.174 0.185 0.201 OD Bảng 1.2: Kết đo OD ( A 664nm ) xác định hàm lượng CS enzyme Neutrase thủy phân sụn cá đuối theo thời gian Xác định thời gian thủy phân CS H20 CHUẨN 1h 2h 3h 4h 5h 6h OD 1.5103 1.1351 0.3617 0.3325 0.2734 0.2719 0.3005 0.3068 OD 1.5189 1.1361 0.3605 0.3368 0.2756 0.2715 0.3047 0.3069 OD 1.5233 1.1432 0.3627 0.3356 0.2782 0.2705 0.3049 0.3092 giá trị trung bình 1.5175 1.1381333 0.361633 0.334967 0.275733 0.2713 0.303367 0.307633 OD hàm lượng CS (mg) 281.5883 288.0846 302.515 303.5949 295.7829 294.7436 61 Bảng 1.3 : Kết đo OD ( A 664nm ) xác định hàm lượng CS enzyme thủy phân sụn cá đuối LỰA CHỌN ENZYME THÍCH HỢP Enzyme NEUTRASE ALCALASE PAPAIN OD 0.3433 0.3928 0.4296 OD 0.3418 0.3959 0.4256 OD 0.3499 0.395 0.4248 0.345 0.3945667 0.426667 285.6404 273.5651 265.745 Giá trị trung bình OD Hàm lượng CS ( mg ) Bảng 1.4: Kết đo OD ( A 664 nm) xác định hàm lượng CS enzyme Neutrase thủy phân sụn cá đuối theo tỉ lệ enzyme Tỉ lệ enzyme Neutrase ( g ) 0.01 0.02 0.03 Đối chứng OD 0.2358 0.2040 0.2026 0.6518 OD 0.2362 0.2159 0.2019 0.6605 OD 0.2297 0.2173 0.2036 0.6613 0.2339 0.2124 0.2027 0.6578 312.7062 317.9439 320.307 209.4371 Giá trị trung bình OD Hàm lượng CS ( mg ) 62 Bảng 1.5: Kết đo xác định hàm lượng nitơ phương pháp Kjeldahl Mẫu sụn cá Mẫu dịch sau thủy phân V H2SO4 0.1N dùng cốc hứng ( ml ) 20 V NaOH 0.1N dùng chuẩn độ ( ml ) 6,25 Khối lượng thể tích mẫu thử Ntp hàm lượng Nito tồn phần Hàm lượng protein 1g 1.925 % 12.03 % 20 18,7 2.5 ml 14.56 gN/ lit 91 g protein/ lit Phụ lục 2: Hình ảnh q trình nghiên cứu 0.25 y = 1.8921x + 0.0187 R² = 0.9865 A 660nm 0.2 0.15 OD 0.1 Linear (OD) 0.05 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 Nồng độ tyrosine (µmol/ml) Hình 1: Đồ thị đường chuẩn tyrosin 0.12 63 Hình 2: Phế liệu cá đuối sau đun 64 Hình 3: Sụn cá đuối Việt Nam Hình 4: Mẫu sụn cá đuối thủy phân enzyme Neutrase sau 4h 65 Hình 5: Chế phẩm CS thơ sơ Hình Chế phẩm CS thơ sau sấy lạnh 400C 66 Hàm lượng CS ( mg /10g sụn) 290 285 280 275 270 265 260 255 Neutrase Alcalase Papain Loại enzyme Hình Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme 310 Hàm lượng CS ( mg/ 10 g sụn ) 305 300 295 290 285 280 275 270 1h 2h 3h 4h 5h 6h Thời gian thủy phân ( ) Hình Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối enzyme Neutrase theo thời gian thủy phân [...]... Phần lớn các loài cá đuối có thân phẳng, giống như cái đĩa bẹt, với ngoại lệ là cá giống và cá đao, trong khi phần lớn các loài cá nhám có cơ thể thuôn động học Nhiều loài cá đuối có các vây ngực phát triển thành các phần phụ rộng và bẹt, giống như cánh Chúng không có vây hậu môn Các mắt và các lỗ thở nằm trên đỉnh đầu 22 Hình 1.5 Cá đuối bồng mõm nhọn (Dasyatis zugei) Phần lớn các loài cá đuối sống... của enzyme Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydrogen hoạt những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme 1.4 GIỚI THIỆU VỀ CÁ ĐUỐI Cá đuối (CĐ) thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) là cá có cơ thể bẹt, và, giống như cá nhám và cá mập, là các loài cá sụn. .. và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes) Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [25] Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn Mô Nước (%) Sụn khớp 68,0 – 85,0 Sụn chêm 60,0 – 70,0 Collagen (%) Proteoglycan 10,0 - 20,0 ( loại I) (%) 5,0-10,0 15,0 - 25,0 ( loại. .. xương không cấu tạo từ chất xương mà là từ chất sụn cứng và đàn hồi Phần lớn các loài cá đuối có 5 lỗ huyệt cơ thể giống như khe hẹp ở bụng, gọi là các khe mang dẫn tới các mang, nhưng họ Hexatrygonidae có 6 lỗ huyệt Phần lớn các loài cá đuối có 5 khe mang nhưng có loài có tới 6 khe mang, các khe mang của các loài cá đuối nằm dưới các vây ngực trên mặt bụng, trong khi ở cá nhám và cá mập thì các khe mang... số polysaccharide khác [17] 1.2.2.2 Các nghiên cứu chiết xuất và định lượng Chondroitin sulfate Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu như từ da của cá Labeo rohita , sụn của cá mực , cá mập, sụn gà, sụn bò Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành Đây là... trong vùng nước ngọt Một số loài cá đuối có thể sống trong các vùng nước lợ và cửa sông Các loài cá đuối sinh sống tại tầng đáy thở bằng cách lấy nước vào thông qua các lỗ thở, chứ không phải thông qua miệng như phần lớn các loài cá khác vẫn làm, và đẩy nước qua các mang ra ngoài Phần lớn các loài cá đuối có các răng phát triển, nặng, thuôn tròn để nghiền mai hay vỏ cuat các loài sinh vật tầng đáy như... trưởng thành Các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành Sụn khác biệt ở chỗ chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh (aneurol) và không chứa hệ bạch huyết (alymphatic) [25] Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên... vật giáp xác, và một vài loài cá, phụ thuộc vào từng loài Cá ó nạng hải ăn các thức ăn là động vật phù du Cá đuối được chia thành 2 bộ: - Bộ Cá đuối thường (Rajiformes) không có cơ quan phát điện Bộ cá 23 này trông giống như cá mập, có đuôi để bơi và các vây ức nhỏ hơn so với phần lớn các loài cá đuối khác Các vây ức của chúng gắn với phần trên của mang như ở mọi loài cá đuối khác, làm cho chúng có bề... không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Trong trường hợp các chất... kéo đáy Cá đuối thường xuất hiện nhiều từ tháng giêng đến tháng ba âm lịch, xương của chúng không giống như xương cá bình thường mà là những đốt sụn có thể nhai được Bộ xương của các loài cá sụn có thành phần chủ yếu là sụn Trong sụn cá đuối với hàm ẩm 65% thì có khoảng 13,8 % protein; 0,19% chất 24 béo; 17,12% là các chất khoáng và khoảng 3,61% là các hydrate cacbon khác [7] Hiện nay hầu hết các chế ... sụn cá thường tách chế biến Mặt khác, số loại cá sụn cá đuối, cá mập lại có giá thành thấp Vì việc nghiên cứu tận dụng loại cá sụn sản xuất CS nghiên cứu đáng quan tâm Mà loại cá sụn cá đuối. .. sau thủy phân không bị biến đổi gốc sunfat do nhà nghiên cứu quan tâm đến việc sử dụng enzyme protease để thủy phân sụn động vật Trong loại động vật có sụn, cá loại động vật nghiên cứu nhiều sụn. .. sử dụng enzyme protease thay hóa chất thủy phân sụn cá đuối để sản xuất CS 3 Đề tài cần thực nhiệm vụ sau:  Xác định chế độ xử lí sụn cá đuối tiền thủy phân;  Nghiên cứu lựa chọn loại protease