CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân tích
2.2.1.2. Định lượng Chondroitin sulfate bằng so màu với Methylene blue
* Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Một phương pháp so màu được đề xuất đã được áp dụng để xác định số lượng chondroitin sulfate bằng cách cho tương tác với xanh methylene. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc giảm độ hấp thụ của xanh methylene xuống còn 664 nm trong phức với chondroitin sulfate. Định luật Beer-Lambert đã tuân theo ở tỷ lệ 0.5-4 μg/ml với hệ số tương quan là 0.9985. Kết quả được trình bày đã được xác nhận về mặt thống kê theo hướng dẫn của ICH. Các nghiên cứu được khôi phục được thực hiện tại ba cấp độ khác nhau. Độ chính xác cao nhất khi RSD thấp hơn 2.0%.
Các phương pháp được phát triển đã cho thấy được tính dễ dàng, đơn giản, cụ thể, chính xác, có thể, thích hợp và chi phí hiệu quả.
Phức hợp giữa chondroitin sunfat và xanh methylen
Xanh methylen là một loại thuốc nhuộm dương tính, khi tương tác với chondroitin sunfat sẽ bị giảm bước sóng hấp thụ tại 𝜆 max 664𝑛𝑚. Việc giảm hấp thụ tại bước sóng 664nm tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sunfat trong dung
dịch, là cơ sở cho việc định lượng chondroitin sunfat bằng xanh methylen.
Khi tiến hành tăng nồng độ chondroitin sunfat, tỷ lệ hấp thụ xanh methylen tại bước sóng 664nm sẽ giảm xuống. Sự thay đổi độ hấp thụ này cho thấy chondroitin sunfat đã tương tác với các phân tử xanh methylen. Bởi vì có hai điện tích âm trong mỗi đơn vị disaccharide lặp đi lặp lại của chondroitin và thuốc nhuộm dương tính xanh methylen, lực tĩnh điện xuất hiện trong sự tương tác này như một ái lực.
* Vật liệu và hóa chất Hóa chất và thuốc thử
Chondroritin sunfat nguyên chất, xanh methylen và nước khử khoáng sẽ được sử dụng trong phương pháp này.
Thuốc thử
Dung dịch xanh methylen: 15mg xanh methylen được hòa tan trong 75ml nước khử khoáng trong bình đong 100ml, khuấy đảo trong vòng 5 phút. Lắc đều, thể tích được xác định đến 100ml. Pha loãng 25ml của dung dịch trên bằng nước khử khoáng đến dung dịch có thể tích 100ml để đạt được nồng độ 37.5 𝜇𝑔/𝑚𝑙
Chuẩn bị dung dịch gốc chuẩn
Khoảng 100mg Chondroritin sunfat tiêu chuẩn tham khảo đã biết độ tinh khiết (92.42%) được cân chính xác vào bình định mức, hòa tan bằng nước khử khoáng, và thể tích đạt được là 100ml (1mg/ml). Tiếp tục pha loãng 5ml của dung dịch trên bằng nước khử khoáng đến dung dịch có thể tích 100ml để đạt được nồng độ 50 𝜇𝑔/𝑚𝑙.
* Phương pháp:
Cách thức tiến hành:
Lấy 5ml dịch mẫu đã lọc sau khi thủy phân enzyme tiếp tục pha loãng đến 100ml với nước khử khoáng.
Đánh dấu 3 bình định mức 50ml: bình tiêu chuẩn, bình kiểm tra và bình trống.
Cân chính xác vào mỗi bình 10ml dung dịch xanh methylen. Dùng pipet hút 2ml
dung dịch chuẩn cho vào bình tiêu chuẩn, 2ml dung dịch kiểm tra vào bình kiểm tra, và 2ml nước vào bình trống. Thêm nước khử khoáng vào cho đến khi đạt 50ml.
Lắc đều trong vòng 30 phút và sau 5 phút đổi chiều một lần. Độ hấp thụ của các dung dịch trong các bình trống, bình tiêu chuẩn và bình kiểm tra được đo ở bước sóng 664nm sử dụng nước như các khoảng trống. Các giá trị độ hấp thụ của dung dịch tiêu chuẩn và dung dịch kiểm tra đã được thu nhận sau khi loại trừ giá trị của dung dịch trong bình trống. Lượng chondroitin sunfat được xác định bằng công thức sau:
Tính toán: công thức tính giá trị thử nghiệm của chondroitin sunfat (mg/viên)
Chú thích:
ABlank=độ hấp thụ của mẫu trắng (độ hấp thụ của xanh methylen) ATest= độ hấp thụ của chondroitin sunfat có trong mẫu
AStd= độ hấp thụ của chondroitin sunfat có trong dung dịch tiêu chuẩn WtStd= trọng lượng của chondroitin sunfat tiêu chuẩn tham khảo (mg) WtTest= trọng lượng của mẫu (mg)
P= độ tinh khiết của chondroitin sunfat tiêu chuẩn tham khảo (92,42%) WAve= khối lượng trung bình của mẫu thử (mg)