Vì thế CS được chiết rút từ sụn động vật bằng phương pháp sinh học nhờ sự thủy phân protein liên kết bởi các exogenous protease (như papain). Tuy
nhiên sử dụng papain để chiết rút CS giá thành thường rất cao và hiện khó kiếm.
Việc khảo sát và sàng lọc protease từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (vi sinh vật, thực vật và động vật) có khả năng thủy phân protein gắn kết với CS trong sụn nhằm hạ giá thành sản xuất và giảm thiểu tác động môi trường là rất cần thiết. Các enzym protease từ vi sinh vật hiện chiếm tới 60% enzym sử dụng trên thị trường.
3.2.1 Xác định hoạt độ enzym papain, alcalase, neutrase
Tiến hành lấy mẫu 3 enzyme Papain, Alcalase, Neutrase để xác định hoạt độ enzyme. Kết quả xác định thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Anson
STT Loại enzyme Hoạt độ Ghi chú
1 Papain 0.7 PU/g Tỉ trong giữa (ml)
và (g) gần như là tương đương
nhau
2 Alcalase 7,875 PU/ml
3 Neutrase 1,05 PU/ g
Nhận xét:
Kết quả phân tích ở bảng 3.4 cho thấy hoạt độ enzyme được xác định theo phương pháp Anson có sự khác biệt so với các thông số nhà cung cấp. Cụ thể: hoạt độ enzyme Papain của nhà cung cấp là 1.5 – 10 UI/mg, Alcalase là 2.4 AU/mg, Neutrase là 50000 UI/g. Nếu so sánh giữa các enzyme với nhau cho thấy hoạt tính của enzmye Alcalase cao gấp 7 lần. Vì vậy trong quá trình sử dụng cần lưu ý đến hoạt độ enzyme để điều chỉnh việc sử dụng enzyme trong quá trình thủy phân để khi đi so sánh quá trình thủy phân của các enzyme với nhau được chính xác.
3.2.2. Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá.
Từ các nghiên cứu của một số tác giả khác về việc nghiên cứu sử dụng protease trong thủy phân sụn cá. Chúng em tiến hành lấy enzyme Neutrase làm chuẩn để nghiên cứu xác định thời gian dùng cho quá trình thủy phân. Tiến hành thí nghiệm thủy phân sụn cá đuối bằng Neutrase với các điều kiện thủy phân tối ưu đã được xác định ở trên pH tối ưu = 7.5, nhiệt độ tối ưu 450C, cùng 1 nồng độ enzym (0,01g enzym Neutrase thủy phân 10g xương sụn cá) với tỷ lệ nước bổ sung là 1/4 và tiến hành thủy phân ở thời gian khác nhau (1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h ) . Dịch sau thủy phân được đem đi đo OD xác định hàm lượng CS bằng phương pháp Methylene Blue.
Bảng 3.5: Xác định thời gian enzyme Neutrase thủy phân tối ưu sụn cá
THỜI GIAN 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Hàm lượng CS (mg/ 10g sụn)
281.5883 288.0846 302.515 303.5949 295.7829 294.7436
Từ kết quả thủy phân ở bảng 3.2 và hình 3.2.2 cho thấy theo thời gian thủy phân hàm lượng CS tạo thành trong quá trình thủy phân tăng theo thời gian và đạt cực đại khi thời gian thủy phân là 4 giờ. Sau đó khi thời gian thủy phân tăng trên 4 giờ thì hàm lượng CS tạo thành lại bắt đầu giảm dần. Theo lí thuyết và các nghiên cứu thì sau khi kết quả đạt cực đại thì các kết quả về sau sẽ không có sự thay đổi đáng kể. Nhưng nhìn trên kết quả thực nghiệm thì sau khi đặt cực đại ở thời gian 4 giờ thì các thời gian 5 giờ, 6 giờ tiếp theo hàm lượng CS lại giảm thì chúng ta có thể lí giải do khi thủy phân giá trị CS đạt cực đại sẽ vẫn giữ nguyên hàm lượng, bên cạnh đó ta vẫn tiếp tục thủy phân thì các protein vẫn bị thủy phân tạo ra các peptit, acid amin mà bản chất của CS là có 2 gốc đường nên khi kết hợp với peptid, acid amin sẽ tạo phức màu, làm giảm hàm hàm lượng CS.
Hình 3.2 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo thời gian thủy phân 3.2.3. So sánh khả năng thủy phân sụn cá của papain, alcalase và neutrase.
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm sử dụng các enzyme khác nhau để thủy phân sụn cá đuối tạo CS. Mẫu 1 thủy phân bằng enzyme papain, mẫu 2 thủy phân bằng enzyme Neutrase, mẫu 3 thủy phân bằng enzyme Alcalase.
Các mẫu thủy phân được sử dụng cùng tỷ lệ enzyme theo hoạt độ enzyme đo được ở trên và thủy phân ở các nhiệt độ và pH thích hợp của các enzyme với thời gian thủy phân 4 giờ. Kết thúc quá trình thủy phân, vô hoạt enzyme bằng cách nâng nhiệt độ hỗn hợp lên 900C trong 15 phút. Lấy mẫu dịch đem đi xác định hàm lượng CS. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5:
92.75
94.89
99.64 100
97.42
97.08
88 90 92 94 96 98 100 102
1h 2h 3h 4h 5h 6h
Hàm lượng CS tương đối ( % sụn cá cực đại )
Thời gian
Bảng 3.5. Hiệu quả thuỷ phân sụn cá trong 4 giờ của các protease
STT Loại protease Hàm lượng CS (mg/ 10 g
sụn ) 1 Papain (6,7 mg/10g sụn); 65 ºC;
pH 7,0 265.745
2 Neutrase (10mg/10g sụn); 45ºC;
pH 7,0 285.6404
3 Alcalase tỷ lệ 0,075ml
(7,875 PU/ml)/10g sụn; 55ºC; pH 7,0 273.5651
Hình 3.3 Sự thay đổi hàm lượng CS tương đối theo loại enzyme
Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy các enzyme khác nhau thì khả năng thủy 100
95.77
93.03
88 90 92 94 96 98 100 102
Neutrase Alcalase Papain
Hàm lượng CS tương đối ( % sụn cá cực đại )
Loại enzyme
phân sụn cá cũng khác nhau. Cụ thể chế phẩm enzyme Neutrase có khả năng thủy phân sụn cá tốt hơn so với enzyme papain và alcalase .
Cùng thời gian 4h thủy phân hàm lượng CS tạo thành ở mẫu Alcalase, Papain chỉ bằng lần lượt là 95.77% và 93.0% so với hàm lượng CS tạo thành ở mẫu Neutrase 100%.
Như vậy enzyme Neutrase có khả năng thủy phân sụn cá tốt hơn so với Alcalase và Papain. Kết quả này phù hợp với các để tài nghiên cứu có liên quan.