Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 67 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
67
Dung lượng
1,99 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----
NGUYỄN THỊ THU THẢO
THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO
CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SỬ DỤNG ENZYME NEUTRASE
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Nha Trang, tháng 06 năm 2015
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
----o0o----
NGUYỄN THỊ THU THẢO
THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO
CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SỬ DỤNG ENZYME NEUTRASE
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
GVHD: TS. VŨ NGỌC BỘI
TS. NGUYỄN DUY NHỨT
Nha Trang, tháng 06 năm 2015
i
LỜI CẢM ƠN
Ðể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này,
Em xin gửi tới Ban Giám hiệu Truờng Ðại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm
Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu
tại Truờng trong những năm qua.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Vũ Ngọc Bội –
Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang và TS. Nguyễn
Duy Nhứt – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang: Số 2 Hùng Vương
– Nha Trang – Khánh Hòa, đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh
nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp
đỡ và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại
Trường. Xin chân thành biết ơn các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm: Phòng thí
nghiệm Hoá sinh, phòng thí nghiệm Hóa đại cương, phòng thí nghiệm CNCB, phòng
thí nghiệm Công nghệ sinh học và Môi truờng đã tạo điều kiện cho em trong suốt
quá trình làm đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị, cô chú làm việc tại Viện Nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ em
trong thời gian làm nghiên cứu tại Viện.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn
đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài.
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Thảo
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ................................................................................... 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT .......................................................... 3
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULPHAT ......................................... 4
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat ........................................ 4
1.2.2. Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat .............. 6
1.2.3. Ứng dụng của chondroitin sulphat .......................................................... 7
1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP......................................................................... 9
1.3.1. Giới thiệu về cá mập ............................................................................... 9
1.3.2. Tình hình khai thác cá mập hiện nay .................................................... 10
1.4. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE............................................. 11
1.4.1. Phân loại và đặc điểm của protease ...................................................... 11
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình thủy phân .................................... 14
1.4.3. Ứng dụng của protease.......................................................................... 15
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT . 17
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 19
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 19
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 19
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học ............................................................ 19
iii
2.2.2. Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson .............. 20
2.2.3. Định lượng chondroitin sulphat theo phương pháp xanh methylen ..... 22
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm ............................................................. 23
2.3. CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU VÀ HÓA CHẤT ĐÃ SỬ DỤNG ................ 31
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................... 31
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 33
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SỤN CÁ MẬP ................................ 33
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN
SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE................................................... 34
3.2.1. Xác định hoạt độ của enzyme neutrase ................................................. 34
3.2.2. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân ................................... 34
3.2.3. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân ................... 36
3.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân........................... 38
3.2.5. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân ......................... 40
3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP ĐỂ THU NHẬN
CHONDROITIN SULPHAT ................................................................................ 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................................... 45
KẾT LUẬN ........................................................................................................... 45
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 46
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM HÓA HỌC .
............................................................................................................................... 48
PHỤ LỤC II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ
MẬP BẰNG ENZYME NEUATRASE ............................................................... 55
iv
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS ................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các CS ....................................................................... 5
Hình 1.3. Phân loại cá mập ................................................................................... 10
Hình 2.1. Hình ảnh về sụn cá mập ........................................................................ 19
Hình 2.2. Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập ............ 24
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sụn cá mập ......................................................................... 26
Hình 2.4. Xác định pH tối thích cho quá trình thủy phân ..................................... 27
Hình 2.5. Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân ............. 28
Hình 2.6. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân ........................... 29
Hình 2.6. Xác định thời gian tối thích cho quá trình thủy phân............................ 31
Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân .......... 35
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
............................................................................................................................... 37
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 39
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 41
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thủy phân sụn cá mập để sản xuất CS bằng neutrase.. 43
Hình 3.6. Hình ảnh về dịch thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase........... 44
Hình 3.7. Hình ảnh về chế phẩm chondroitin sulphat thô thủy phân từ sụn cá mập
............................................................................................................................... 44
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn ................................................................ 3
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu cảm quan mẫu sụn cá có chế độ xử lý sụn khác
nhau ....................................................................................................................... 33
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của sụn cá mập .................................................... 33
Bảng 3.3. Xác định hoạt độ enzyme neutrase ....................................................... 34
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân .......... 35
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
............................................................................................................................... 36
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 38
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy
phân ....................................................................................................................... 40
Bảng 3.8. Hiệu suất thu nhận chondrotin sulphat từ sụn cá mập .......................... 44
vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CS
Chondroitin sulphat
GAG
Glycosaminoglycan
GlcA
D-glucuronic acid
GalNAc
N-acetyl-D-galactosamine
PG
Proteoglycan
TCA
Tricloacetic acid
TN
Tự nhiên
1
LỜI MỞ ĐẦU
Chondroitin sulphat là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp. Chondroitin
sulphat còn có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động
linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép. Trong y
học, chondroitin sulphat được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp.
Chondroitin sulphat làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp,
đảm bảo chức năng dinh duỡng và sự vận động linh hoạt của khớp. Vì vậy,
chondroitin sulphat giúp hạn chế quá trình thoái hoá khớp. Chondroitin sulphat còn
có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng cách ức chế các enzyme phá huỷ sụn khớp như
collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase. Ngoài ra, chondroitin
sulphat cũng góp phần nuôi duỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc.
Một trong những tác dụng quan trọng khác của chondroitin sulphat là khả năng ức
chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho
khối u hạn chế phát triển. Hiện nay, các thuốc kết hợp chondroitin sulphat và
glucosamine đang được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp.
Do phân tử chondroitin sulphat rất đa dạng và phức tạp cho nên chondroitin
sulphat chưa đuợc tổng hợp bằng con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ
các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Trong đó, sụn cá thường có hàm lượng chondroitin
sulphat cao hơn các loại động vật khác. Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy
chondroitin sulphat có thể được thu nhận từ một số nguồn nguyên liệu như da của cá
Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…
Chondroitin sulphat có thể thu nhận từ sụn động vật bằng phương pháp thủy
phân với tác nhân xúc tác là acid. Nhược điểm của phương pháp sử dụng acid là có
hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn đến làm giảm hoạt tính. Vì vậy, các nhà
nghiêm cứu về chondroitin sulphat đang có xu hướng sử dụng enzyme để thủy phân
sụn cá.
2
Được sự chấp nhận của Nhà trường em tiến hành đề tài: “Thử nghiệm thủy
phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme
neutrase”.
Mục tiêu của đề tài:
Thử nghiệm sử dụng enzyme neutrase thủy phân sụn cá mập để tạo chondroitin
sulphat.
Nội dung thực hiện của đề tài:
1. Xác định điều kiện phù hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập tạo
chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase: tỷ lệ enzyme, pH
thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân.
2. Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng
enzyme neutrase.
3. Thử nghiệm tạo chondroitin sulphat từ sụn cá mập.
Ý nghĩa khoa học của đề tài:
Số liệu nghiên cứu của đề tài là số liệu mốc, khẳng định việc có thể sử dụng
enzyme neutrase nói riêng và enzyme protease nói chung trong việc thủy phân để thu
chondroitin sulphat.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài là các số liệu ban đầu làm nền tảng cho quá trình
tiếp tục sử dụng enzyme neutrase trong thủy phân sụn cá để sản xuất chondroitin
sulphat.
3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.
GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT [14]
Sụn động vật là loại mô liên kết đặc, tồn tại trong cơ thể động vật có xương
sống cũng như ở động vật không xương sống. Trong cơ thể nguời và các loài động
vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương suờn, tai, mũi,
ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn là phần chính trong bộ xương của bào thai,
nhưng nó sẽ biến đổi thành xương khi cơ thể truởng thành. Các loài cá sụn
(Chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng
bộ xương hoàn toàn sụn ngay cả khi ở tuổi truởng thành.
Sụn chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần
kinh – aneurol và không chứa hệ bạch huyết – alymphatic.
Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm. Thành phần hoá học của hai loại sụn
trên gồm hai pha: chủ yếu là pha lỏng bao gồm nuớc và các chất điện phân, pha rắn
do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và
loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes). Tế bào sụn tạo
nên chất cơ bản (matrix) của sụn.
Bảng 1.1. Thành phần chính của mô sụn
Mô
Nước (%)
Collagen (%)
Proteoglycan (%)
Sụn khớp
68.0 – 85.0
10.0 – 20.0 (loại I)
5.0 – 10.0
Sụn chêm
60.0 – 70.0
15.0 – 25.0 (loại II)
1.0 – 2.0
Thành phần chính của hai loại sụn đuợc thể hiện trong bảng 1.1. Ba thành phần
chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn. Sự thay đổi của các
thành phần này (do bị bệnh lão hoá...) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào
4
thời gian của sụn. Có tới 30% nuớc nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen.
Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn.
1.2.
GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULPHAT [5], [7], [8], [9], [10],
[12], [13]
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat
Vào những năm 60, Davidson và Meyer là người đã phát hiện và lần đầu tiên
tách chiết được CS. CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide được gọi là
glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime
mạch thẳng không phân nhánh. CS gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đuờng
(disaccharide) N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen
kẽ nhau (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này
được sulfate hóa hoặc không được sunlfate hóa , một số gốc GlcA bị epime hoá thành
L-iduronic acid (IdoA). CS là một polime có phân tử lớn gồm 15 – 150 đơn vị cấu
trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc. Khối luợng phân tử của CS thuờng biến động
trong khoảng 10.000 – 100.000 Dalton.
Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thuờng gắn với các protein
bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG), là hợp chất hữu cơ thuộc
nhóm mucopolysaccharide.
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình
khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực
của tế bào. GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống. Về cấu
trúc, nó là thành phần chính của mô sụn. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein
trong mô tế bào nhờ có diện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều
hoà các hoạt động của tế bào. Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80
– 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ
thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép
nén với sự biến dạng nhỏ nhất.
5
Công thức hoá học của chondroitin sulphat (C14H21NO14S)n:
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS
Hình 1.2. Cấu trúc mạch của các chondroitin sulphat
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số luợng và vị trí
của nhóm sulphat trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide.
Chondroitin sulphat A: gốc sulphat gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphat, CS4), có
nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit. Chondroitin
sulphat B: acid iduronic thay thế acid glucuronic. Chondroitin sulphat C: gốc sulphat
gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphat, CS6). Loại A và B (CS4) thuờng được tìm
thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), nguợc lại loại C (CS6) đuợc tìm thấy chủ yếu
ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates)...). Tuy nhiên, CS từ các nguồn
nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thuớc, chúng chứa ở mức độ
nhiều hay ít một số luợng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào
6
sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đuờng đôi tạo nên 16 isome/mỗi cặp. Trong
đó, CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG.
CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nuớc vì thế
rất dễ hút ẩm, nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone... Khối luợng
phân tử của CS nguyên liệu thuờng đuợc sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn,
khoảng 15000 - 20000 Dalton.
1.2.2. Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat
Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp cho nên CS chưa đuợc tổng hợp bằng
con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS có thể được thu nhận từ một số nguồn
nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…
CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất
CS từ các loại mô động vật. Sụn cá mập (xương sọ, xương sống, vây...) là nguồn
nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh
duỡng.
CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan.
Cho nên để tách CS ra khỏi protein cần làm yếu mối liên kết giữa CS – protein và
phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS.
Hiện nay, quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn được thực hiện bằng
phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học để thuỷ phân sụn.
Phương pháp hoá học: Mô sụn được xử lý bằng dung dịch muối, kiềm (NaOH)
hoặc acid (HCl, CH3COOH...) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein,
hyaluronic acid…), phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò.
Nhược điểm của phương pháp hóa học là có hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn
đến làm giảm hoạt tính.
Phương pháp sinh học: Dùng enzym để thuỷ phân mô sụn và là phương pháp
rất hiệu quả. CS thu nhận theo phương pháp này không bị biến đổi về cấu trúc, giữ
đuợc hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi truờng do các hoá
7
chất (muối, kiềm, acid...) gây nên. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain,
actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết. Sau
khi loại bỏ protein thì CS đuợc tách ra và tinh sạch. Phương pháp này đã đuợc dùng
để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, cá sấu, cá đuối, sụn
khí quản vịt…
Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và
methanol. Vì vậy, có thể sử dụng các dung môi này để thu CS. Một số nghiên cứu
cho thấy ethanol 60-70% tủa đuợc hàm luợng CS cao nhất và tách CS với một số
polysaccharide khác.
1.2.3. Ứng dụng của chondroitin sulphat
CS đuợc xem là chế phẩm bổ sung dinh duỡng và sử dụng rộng rãi. Trong một
năm từ 1998 đến 1999 doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD. CS có nhiều tác
dụng trong lĩnh vực bệnh lý trong thời gian dài và đang ngày càng đuợc mở rộng ứng
dụng trong các lĩnh vực khác nhau.
Ứng dụng trong y học:
- Bệnh khớp:
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các
bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm xương khớp. CS đuợc tìm thấy trong
hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp.
Cơ chế tác dụng của chondroitin sulphat trong việc làm giảm bệnh lý xương khớp
chính là bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym có vai trò phá hủy sụn như
collagenase,
elastase,
proteoglycanase,
phospholipase
A2
và
N
–
acetylglucosamindase và kích thích tăng hoạt các enzym có vai trò xúc tác phản ứng
tổng hợp acid hyaluronic (là chất giúp khớp hoạt động tốt). Ðiều trị CS với liều dùng
800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải
thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp.
8
Các nghiên cứu duợc lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy CS
đuợc sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm
trọng xảy ra.
- Bệnh mắt:
Theo sách “Matindale, The complete drug reference” (34th, ed, 2005), CS là
chất sinh lý của giác mạc duy trì độ trong suốt cho mắt, tạo độ nhớt thích hợp và bồi
bổ nội mô giác mạc, nuôi duỡng các tế bào giác mạc mắt, tái tạo lớp phím nuớc mắt
trước giác mạc, tăng cuờng độ đàn hồi của thấu kính, chống tình trạng khô mắt.
Mac Rae và cộng sự đã chỉ ra CS có tác dụng giảm sự tổn thương thấu kính mắt.
CS đuợc dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt,
mỏi mắt, thoái hoá võng mạc. Hiện nay, tại Việt Nam Công ty TNHH ROHTOMENTHOLATUM đã sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các
bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác,
nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi…
- Các bệnh khác:
CS của sụn cá mập đuợc một số công trình nghiên cứu ghi nhận có chứa chất
“ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh” (angiogenesis) của khối u ung thư,
ngăn các tế bào ung thư không sinh sản và tăng trưởng. CS kết hợp với mitomycin C
có thể ức chế các tế bào ung thu cổ truớng sarcoma 180.
Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cuờng hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các
chứng thấp khớp, đau nhức xương, vẩy nến, chàm…
Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cuờng kháng viêm ức chế sự
tiết các cytokine tiền viêm TNF-a, interleukin-1ß nitric oxid và các gốc oxy hóa tự
do.
Những công dụng của CS đã và đang góp phần lớn cho ngành y học và nhiều
lĩnh vực khác. Do đó, việc nghiên cứu để thu nhận và ứng dụng CS trong thực tế là
một điều hết sức cần thiết hiện nay.
9
1.3.
GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP [6], [14]
1.3.1. Giới thiệu về cá mập
Cá mập thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) cùng Bộ cá đuối, cá kiếm. Thân hình
thủy động học dễ dàng rẽ nước, có từ 5 đến 7 khe mang dọc mỗi bên hoặc ở gần đầu.
Khe đầu tiên sau mắt gọi là lỗ thở, da có nhiều gai nhỏ bao bọc cơ thể chống lại các
ký sinh trùng.
Với một thân hình không nhỏ, lẽ ra chúng phải có một khung xương chắc khỏe,
tuy nhiên loài cá này lại không hề có xương. Bộ khung nâng đỡ cơ thể được kết bằng
chất sụn. Trong suốt cuộc đời mình, cá mập có thể thay răng nhiều lần: có 3000 chiếc
răng xếp bên trong bộ hàm khỏe và ngay khi một chiếc răng bị rụng đi khi cắn phải
vật cứng thì sẽ có chiếc khác thay thế chỉ trong vòng 24 tiếng. Chúng có thói quen
đớp mồi và nuốt chửng thay vì xé, nhai và nhấm nháp con mồi.
Cá mập thuộc loài ít di chuyển và được xem là kình ngư cừ nhất đại dương, có
thể bơi với vận tốc 46km/h, trong khi con người chỉ có thể đạt vận tốc 4km. Nhìn xa,
cá mập không có vảy, nhưng thực chất bộ da của chúng được phủ rất nhiều vảy nhỏ
rất nhám.
Cá mập có khứu giác hoàn hảo và thị giác khá tốt cộng thêm khả năng cảm nhận
điện trường của động vật đã ấn định cho cá mập ngôi vị vua biển cả. Với giác quan
này, một con cá mập có thể xác định mùi máu, hay nước tiểu của con mồi ở xa hàng
km.
Có hơn 440 loài cá mập dựa theo hình thái sinh học được liệt kê dưới đây theo
mối quan hệ tiến hóa của chúng từ thời cổ xưa đến hiện đại. Được chia thành 8 nhóm.
Quần thể cá mập rất không đồng nhất và được đại diện bởi một loạt các loài,
chúng có sự khác biệt rõ rệt trong những thói quen và sinh học, đặc biệt trong sự phát
triển và sinh sản. Chúng sinh sống ở các môi trường khác nhau, rộng từ đáy đại dương
biển nước ngọt sông, hồ, vùng cửa sông ven biển và đầm phá, từ vùng biển Bắc Cực
để làm ấm các vùng nhiệt đới. Cá mập khác nhau rất nhiều về kích thước bao gồm
các loài có kích cỡ chỉ bằng bàn tay, như Euprotomicrus bispinatus là một loài cá
10
sống dưới đáy biển chỉ dài 22 xentimet, đến cá mập voi khổng lồ (Rhincodon typus),
loài cá lớn nhất với chiều dài 12 mét. Hình thức sinh sản cá mập cũng rất khác nhau
giữa các loài, có loài đẻ trứng, mang thai và một số tạo phôi. Cá mập đẻ trứng nhưng
hầu hết các trứng được nuôi dưỡng trong cơ thể mẹ cho tới khi nở.
Hình 1.3. Phân loại cá mập
1.3.2. Tình hình khai thác cá mập hiện nay
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Long và Võ Sĩ Tuấn – Viện Hải
Dương học Nha Trang vào năm 2012 đã báo cáo rằng:
Có khoảng 530 phương tiện đang tham gia khai thác cá nhám/mập tại 6 tỉnh ven
biển từ Quảng Ngãi đến Bình Tuận, nhiều nhất là là Bình Thuận 181 chiếc, Bình
Định 140 chiếc, Khánh Hòa 98 chiếc, Phú yên 74 chiếc, Quãng Ngãi 32 chiếc và
Ninh Thuận 5 chiếc.
Nhìn chung, nghề khai thác cá nhám/mập tương đối đa dạng gồm câu cá mập,
câu cá ngừ đại dương, lưới cản (lưới rê tầng mặt), lưới ba màng, lưới vây và lặn.
Trong đó, nghề câu cá mập có số lượng phương tiện khai thác nhiều nhất 187 chiếc
11
và khu vực khai thác khá rộng từ bờ ra khơi, cao nhất là Bình Định có 80 chiếc (chủ
yếu tại Nhơn Lý, Tân Phụng và Tam Quan Bắc), Bình Thuận 70 chiếc (ở La Gi, Phú
Quý và Liên Hương), Quãng Ngãi 27 chiếc, Phổ An và Phú Yến 12 chiếc.
Hoạt động khai thác cá nhám/mập của 6 tỉnh ven biển từ Quảng Ngãi đếm Bình
Thuận diễn ra tại nhiều khu vực khác nhau tùy từng loại nghề, trong đó tập trung tại
3 khu vực chính là vùng ven bờ (từ bờ ra đến 24 hải lý) số lượng phương tiện khai
thác rất ít 12 chiếc, ở tuyến lộng từ 6 – 24 hải lý và tuyến khơi. Có khoảng 13 loài cá
nhám/mập được ngư dân khai thác, hầu hết các loài đều bắt gặp vùng tuyến khơi.
Một số loài khai thác phổ biến gồm cá nhám đuôi dài (Alopias pelagicus), cá nhám
đá (Carcharhinus albimarginatus), cá mập da trơn (Carcharhinus falciformis), cá
mập
thâm
(Carcharhinus
limbatus),
cá
mập
sọc
trắng
(Carcharhinus
amblyrhynchoides)…
Năng suất khai thác nghề câu cá mập là cao nhất (trung bình: 0.53
tấn/ghe/tháng), trong đó tuyến khơi có năng suất khai thác cao gấp 2 lần (0.80
tấn/ghe/tháng) so với tuyến bờ (0.45 tấn/ghe/tháng). Mùa vụ khai thác hầu hết của
các loại nghề không khác nhiều và chủ yếu tập trung từ tháng 2 – 10. Ở tuyến bờ
mùa vụ khai thác tập trung vào tháng 2 – 8, trong khi đó hoạt động ở tuyến khơi kéo
dài từ 2 – 10 tháng. Tháng 5 – 7 là tháng khai thác tập trung và năng suất cao nhất.
Hiện nay, ở Việt Nam nguồn nguyên liệu CS được nhập từ nước ngoài nên giá
thành còn rất cao và các công trình nghiên cứu thu nhận CS vẫn chưa được phổ biến.
Vì thế việc nghiên cứu tách chiết từ các loài sụn động vật là điều hết sức cần thiết và
ý nghĩa trong việc giảm giá thành của CS.
1.4.
TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE [2], [3]
1.4.1. Phân loại và đặc điểm của protease
Nhóm enzyme proteaza xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptit (-CO
– NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận
chuyển acid amin.
12
Phân loại protease có thể căn cứ vào các tiêu chí:
+ Căn cứ vào cơ chất phản ứng của enzyme tham gia.
+ Căn cứ vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease
kiềm và protease trung tính.
+ Nguồn thu nhận enzyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản:
Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột của nội tạng của
một số động vật thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin,
cathepsin.
Từ thực vật có thể thu được papain (từ đu đủ), bromelain (từ thân, lá, vỏ
dứa).
Vi sinh vật là một nguồn rất phong phú để thu enzyme, thường từ các loài
Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm men.
+ Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme gồm: endopeptidase (endopeptit hydrolase,
hay proteinase) và exopeptidase (peptidase), amino peptidase, cacboxyl peptidase,
dipeptidase.
Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm
phụ:
+ Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nito của
mạch polypepetit.
+ Cacboxypeptidase: Xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptit ở đầu cacbon
của mạch polypeptit.
+ Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit.
+ Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch.
Theo Barret và Donald (1956), Protease được phân chia thành 2 nhóm lớn
là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
+ Nhóm 1: Endopeptidase là enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch
polypeptide. Dựa vào động học của cơ chất xúc tác, endopeptidase được chia thành
4 phân nhóm:
13
- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những proteinase chứa nhóm –OH của
gốc serin trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt
động xúc tác của các enzyme. Nhóm này gồm các enzyme như: trypsin,
chymotrypsin.
- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt động
của nó chứa nhóm thiol (-SH) của acidamin xistein. Nhóm này gồm các enzyme
cathepxin.
- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease trong trung tâm hoạt
động của nó có các nhóm cacboxyl (-COOH) của aspactic như enzyme pepsin.
- Phân nhóm 4: Protease – kim loại. Đây là những protease trong trung tâm
hoạt động của nó có ion kim loại và hoạt động trong môi trường trung tính.
+ Nhóm 2: Exopeptidase hay peptidase. Các enzyme thuộc nhóm này gồm:
Cacboxylpeptidase, amino peptidase, dipeptidase. Các exopeptidase không có khả
năng thủy phân liên kết peptit ngoài cùng của chuỗi polypeptit hoặc đầu amin, hoặc
đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acidamin ra khỏi chuỗi polypeptit.
Trong các nguồn thu nhận enzyme thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc
sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì có những ưu điểm sau:
- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất.
- Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi
sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 – 60h.
- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất
chọn lọc enzyme với số lượng lớn.
- Giá thành chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các nguồn khác vì
môi trường nuôi cấy nuôi cấy tương đối đơn giản, rẻ tiền.
Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong
đời sống này mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn hơn.
14
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, cụ thể là:
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất
lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme. Khi nồng độ
enzyme tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu
nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể và
thậm chí không tăng.
Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc
độ phản ứng thủy phân, khi tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng
tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt tới giới hạn v=vmax, nếu tiếp tục tăng
nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng thủy phân hầu như không tăng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền
với nhiệt, chúng chỉ có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng
biến tính. Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân
tăng. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng thủy phân do enzyme xúc tác
được đặc trưng bằng hệ số:
Q10 =
Với
Kt
𝑘𝑡+10
𝑘
hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t
Kt+10 Hằng số tốc độ phản ứng tại nhiệt độ t+10oC.
Vùng nhiệt độ tạo cho enzyme có hoạt độ cao nhất gọi là vùng nhiệt độ thích
hợp của enzyme, trong đó có một giá trị nhiệt độ mà ở đó, tốc độ enzyme đạt cực đại
gọi là nhiệt độ tối thích. Đa số enzyme, vùng nhiệt độ thích hợp trong khoảng 40 –
50oC. Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, và nhiệt độ tới
hạn của enzyme khoảng 700C, vói các enzyme bền nhiệt (bromelin, papain…), nhiệt
dộ tới hạn cao hơn.
15
Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme vì
pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein
enzyme. Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9, mỗi enzyme chỉ hoạt động
thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme.
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân cần thích hợp để
enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá
trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt.
Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình
thủy phân và chất lượng sản phẩm thủy phân. Thời gian thủy phân dài ngắn khác
nhau tùy thuộc vào loại enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, sự có mặt của các
chất hoạt hóa, ức chế… Trong thực tế, thời gian thỷ phân phải xác định bằng thực
nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thỷ phân cụ thể.
Ảnh hưởng của lượng nước: Nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và
cơ chất lại, vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc
độ, chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất khi có mặt trong
phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa học
khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất
hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ cho phé, hoạt độ enzyme sẽ giảm.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những
chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoạt
mất hoạt tính. Với mỗi enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy
khi sử dụng enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm để điều chỉnh phản ứng.
1.4.3. Ứng dụng của protease
Từ xưa, con nguời đã biết sử dụng enzyme vào thực tiễn và các ứng dụng này
chỉ mang tính tự phát chưa có cơ sở khoa học. Ở nuớc ta, việc nghiên cứu và sử dụng
protease đã đuợc bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu đuợc một số thành tựu đáng
16
kể, tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất
nuớc mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh duỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt
may, thức ăn cho chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi truờng.
Trong công nghiệp: Nguời ta dùng protease bổ sung vào xà phòng, chất tẩy
rửa để nâng cao tính năng tẩy rửa các loại dầu mỡ và chất bẩn hay có thể dùng
protease để khử lông trâu bò trong công nghệ thuộc da.
Trong công nghệ dược phẩm và y học: Protease được sử dụng để sản xuất các
loại thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein, dùng để phân giải các cục protein trong
cơ thể, chữa bệnh nghẽn tim mạch, tiêu mũ các vết thương, các ổ viêm, làm thông
đường hô hấp.
Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:
- Các enzyme amylase thường được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực
phẩm và đã mang lại chất lượng hiệu quả cao.
- Sử dụng enzyme amylase trong sản xuất maltose sử dụng trong công nghệ
sản xuất bia, nước giải khất, sản xuất bánh kẹo.
- Nếu đưa vào bột nhào 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase thì chất lượng bánh
mì tăng cao, bánh xốp hơn, ngọt hơn và màu sắc đẹp hơn.
- Sử dụng enzyme amylase để sản xuất glucose từ tinh bột thay cho phương
pháp dùng acid clohidric kém hiệu quả.
- Sử dụng protease thu nhận từ quả dứa, đu đủ, nội tạng để làm mềm thịt, làm
tăng hương vị của sản phẩm sau khi chế biến. Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến
câc sản phẩm có giá trị gia tăng.
- Sử dụng protease để sản xuất bột đạm thủy phân từ các nguyên liệu giàu
protein.
17
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT
[1], [12], [13]
Một số đề tài nghiên cứu sử dụng chondroitin sulphat:
Năm 2006, S.C. Shin, S.J. You, B.K. An và C. W. Kang – Trung tâm Nghiên
cứu Tài nguyên động vật, Cao đẳng chăn nuôi – Hàn Quốc đã công bố kết quả công
trình nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất mucopolysaccharide-protein có chứa
Chondroitin sulphat từ sụn gà”. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu của
việc chiết xuất bằng phương pháp đun nóng là ở 1000C trong 120 phút với sản lượng
40.09% và hàm lượng CS của sụn là 28.46%. Đối với alcalase, điều kiện tối ưu 2%
alcalase trong 120 phút thì năng suất thủy phân là 75.87% và hàm lượng CS là
26,61%. Việc sử dụng enzyme để chiết xuất CS có năng suất cao hơn so với đun
nóng. Đồng thời, kết luận rằng trong sụn gà có chứa một lượng chondroitin sulphat
đáng kể.
Năm 2014, đề tài nghiên cứu sản xuất Chondroitin sulphat từ khí quản vịt của
Vittayanont, M. and Jaroenviriyapap, T – Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa
Nông nghiệp, Đại học Prince of Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan. Tiến hành
nghiên cứu xử lý khí quản vịt bằng kiềm (NaOH 0.01 – 0.5M, ở 40C trong khoảng 1
– 6h), enzyme (alcalase 0.1 – 0.5%, ở 550C, pH = 8, 1 – 6h) và đun nóng (1 – 120
phút). Các mẫu được đun nóng được thủy phân bằng papain ở điều kiện 0.0625 – 1%
trong 1 – 10h. Kết quả nghiên cứu cho thấy 80% CS được chiết xuất ở điều kiện
0.025% papain trong 10h. Các hydrolysate đông khô từ khí quản sụn chứa 10.6% CS
thu được 39% sau khi kết tủa protein.
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách chiết CS từ các nguồn
nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn cá mập, sụn của cá mực, sụn gà, sụn
bò…Cho đến nay, tại Việt Nam vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ và
chưa phổ biến.
18
Hàm luợng CS được thu nhận khác nhau từ các nguồn nguyên liệu sụn khác
nhau, tuy nhiên chúng biến động trong khoảng 10.0 – 28.3%, phần lớn chứa các loại
CS4 và CS6.
Phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch
oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS
tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá
của neron thần kinh, còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên. Vì vậy, CS
được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
19
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1.
NGUYÊN VẬT LIỆU
Bột sụn cá mập
Sụn cá mập khô được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi thu
mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn và bảo quản
ở 40C trong suốt thời gian làm đề tài.
Hình 2.1. Hình ảnh về sụn cá mập
Enzyme neutrase: Neutrase là một protease có nguồn gốc từ vi khuẩn
B.amyloliquefaciens. Neutrase do hãng Novozyme – Đan Mạch cung cấp. Neutrase
dạng bột có đặc tính: hoạt độ 5000UI/g, nhiệt độ thích hợp 40 – 600C, pH thích hợp
5.5 – 7.5.
2.2.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [4], [11]
2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học
+ Xác định độ ẩm: Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến trọng
lượng không đổi ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700 – 1990.
20
+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số: Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng
phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705 – 1990.
+ Xác định hàm lượng khoáng: Xác định hàm lượng khoáng của sụn cá mập
bằng phương pháp nung ở 6000C.
2.2.2. Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson
a. Nguyên tắc
Dùng protein casein hoặc Hb (Hemoglobin) làm cơ chất xác định hoạt độ thủy
phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành
trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau. Dựa vào đồ thị
chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng
của enzyme protease.
Hoạt độ enzyme của chế phẩm được biểu diễn bằng “Đơn vị hoạt độ
proteolytic”.Một đơn vị hoạt độ proteolytic (PU) là lượng enzyme mà trong một phút
ở 300C có khả năng thủy phân protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid
tricloacetic cho phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau tương ứng với một
µmol tyrosine.
Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ proteolytic
trên 1mg protein của chế phẩm (số PU/mg protein).
b. Hóa chất và thiết bị
Dung dịch casein 2%: Hòa tan 2g casein vào 90 ml đệm Britton và Robinson
pH 7.2. Nếu pH dung dịch thấp hơn 7.2 thì dùng NaOH 1N để điều chỉnh, dẫn đệm
đến 100ml.
Thuốc thử Folin – Ciocalteau được pha loãng bằng nước cất theo tỷ lệ 1/5 trước
khi sử dụng. Dung dịch chuẩn tyrosine 1µmol/ml, Na2CO3 0.4M, acid tricloacetic
0.4M.
Máy so màu, thiết bị ủ nhiệt.
21
c. Cách tiến hành
Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống đối chứng.
Ống thí nghiệm: cho vào 1ml dung dịch cơ chất đã đạt được 300C và 1ml dung
dịch enzyme protease đã đạt tới 300C giữ đúng 10 phút ở 300C sau đó cho ngay vào
5ml dung dịch acid tricloacetic 0.4M lắc đều và giữ 30 phút ở 300C. Lọc và lấy 1ml
dịch lọc cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin –
Ciocalteau như sau: lấy một ống nghiệm sạch, thêm vào 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M
lắc đều và cho thêm 1ml thuốc thử Folin đã được pha loãng 5 lần lắc đều, giữ 20 –
30 phút ở nhiệt độ phòng.
Ống đối chứng: sau khi cho 1ml dung dịch enzyme cho ngay vào 5ml dung
dịch acid tricloacetic 0.4M rồi cho vào 1ml dung dịch cơ chất. Các bước tiếp theo
tiến hành giống như ống nghiệm. Sau đó so màu trên máy quang điện kế với kính lọc
màu đỏ ở bước sóng 660nm.
d. Tính kết quả
Lấy hiệu số mật độ quang đọc trên thiết máy của mẫu thí nghiệm và mẫu đối
chứng và mẫu đối chứng. Dựa vào đồ thì chuẩn tyrosine tính lượng tyrosine tương
ứng.
Hoạt độ protease tính bằng công thức:
𝑃𝑈/𝑚𝑙 =
µmol/ml x 7
10
Trong đó:
7: Tỷ lệ thể tích của hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme (1ml dung dịch
cơ chất cộng 1 ml dung dịch enzyme cộng 5ml dương dịch caid tricloacteic).
10: Thời gian thủy phân cơ chất (phút).
22
2.2.3. Định lượng Chondroitin sulfate theo phương pháp sử dụng xanh
methylen
a. Nguyên tắc
Xanh methylen là một loại thuốc nhuộm cation khi tương tác với chondroitin
sulphat sẽ làm giảm độ hấp thụ của xanh methylen. Việc giảm sự hấp thụ tỷ lệ thuận
với nồng độ của chondroitin sulphat có trong dung dịch. Sự thay đổi độ hấp thụ là do
CS đã tương tác với phân tử màu xanh methylen.
b. Cách tiến hành
Chuẩn bị hóa chất:
- Pha xanh methylen: Cân chính xác 15 mg xanh methylen, hòa tan trong 75
ml nước cất và định mức lên 100 ml trong bình định mức 100 ml lắc đều trong 5
phút. Sau đó, chuyển 25 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml và định mức bằng
nước cất đến 100 ml. Thu được dịch xanh methylene có nồng độ 37.5 µg/ml.
- Chuẩn bị dung dịch CS chuẩn: Cân chính xác 100 mg CS chuẩn 92.42%, hòa
tan trong nước cất và định mức lên 100 ml. Sau đó, chuyển 5 ml dịch trên vào bình
định mức 100 ml định mức lên 100 ml và lắc đều. Thu được dịch CS chuẩn có nồng
độ 50 µg/ml.
- Chuẩn bị mẫu kiểm tra hàm lượng CS: Dịch thu được sau thủy phân, lấy 5ml
chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức đến 100ml.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 bình định mức 50 ml, gồm mẫu trống, mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra
hàm lượng CS. Cho vào mỗi bình 10 ml xanh methylen, thêm 2 ml dịch thủy phân
vào mẫu kiểm tra hàm lượng CS, 2 ml dung dịch CS chuẩn vào mẫu chuẩn và mẫu
trống là 2 ml nước cất. Sau đó, định mức lên 50 ml, lắc đều trong vòng 30 phút và
đo ở bước sóng 664nm.
23
c. Tính kết quả
Công thức tính hàm lượng CS khảo nghiệm:
𝐶𝑆 =
𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑡
× 𝐺𝑡 × 𝑃
𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑠𝑡
Trong đó:
- 𝑂𝐷𝑏 : Độ hấp thụ của mẫu trống.
- 𝑂𝐷𝑡 : Độ hấp thụ của mẫu kiểm tra hàm lượng CS.
- 𝑂𝐷𝑠𝑡 : Độ hấp thụ của mẫu CS chuẩn.
- 𝐺𝑡 : Khối lượng CS chuẩn sử dụng (mg)
- P: Phần trăm độ tinh khiết của chondroitin sulphat tiêu chuẩn (92.42%)
- CS: Hàm lượng CS trong mẫu (mg/10g mẫu)
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.4.1.
Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat
Quá trình tham khảo tài liệu, đề tài dự kiến qui trình thu nhận Chondroitin
sulfate từ sụn cá mập được trình bày ở hình 2.2.
24
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân
Bất hoạt enzyme
Ly tâm
Dịch thủy phân
Kết tủa protein hòa tan bằngTCA
Ly tâm
Dịch chứa CS thô
Kết tủa CS thô bằng ethanol
Ly tâm
Chế phẩm CS thô
Sấy khô
Chondroitin sulfate thô
Hình 2.2. Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập
25
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi
thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn. Sụn cá
mập sau khi thu nhận được tách bỏ thịt, làm khô để sử dụng làm nguyên liệu thủy
phân thu CS. Trước khi thủy phân, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với tốc
độ 25000 vòng/phút trong thời gian 30 phút.
+ Xử lý: Sụn cá được xử lý bằng cách đun nóng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ.
+ Thủy phân: Sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân các mối liên kết peptit
để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với protein bằng liên kết o – glycosid tạo thành
phức proteoglycan.
+ Bất hoạt enzyme: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme
bằng cách đun nóng ở 900C trong thời gian 15 phút.
+ Ly tâm: Loại bỏ phần bã, ly tâm 6000 v/phút để thu dịch thủy phân.
+ Kết tủa protein hòa tan: Sử dụng TCA để kết tủa hoàn toàn protein hòa
tan trong dung dịch.
+ Ly tâm: Tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa protein hòa tan trong dung dịch
và thu dịch chứa CS.
+ Kết tủa CS thô: CS không hòa tan trong ethanol nên sử dụng ethanol để
tủa CS. Sau đó, tiến hành ly tâm để thu chế phẩm CS.
+ Sấy khô: Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS đem đi sấy lạnh để thu
được CS thô.
2.2.4.2.
Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý sụn cá mập
Từ tham khảo các nghiên cứu trước đây, đồ án thử nghiệm xử lý sụn cá theo
quy trình trình bày ở hình 2.3.
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi thu
mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn.
26
+ Tách thịt: Quá trình tách sụn cá mập được tiến hành theo hai chế độ xử lý
sụn khác nhau:
- Chế độ 1: Tiến hành đun sụn ở 1000C trong 30 phút. Sau đó, làm nguội và
tách bỏ thịt cá.
- Chế độ 2: Sụn cá được ngâm trong nước trong 30 phút, không đun và được
tách bỏ thịt.
+ Xay nhỏ: Sau khi tách bỏ thịt, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với
tốc độ 25000 vòng/phút trong thời gian 20 phút.
+ Sấy khô: Sấy ở nhiệt độ 700C và bảo quản ở 40C suốt thời gian làm đề tài.
+ Đánh giá: Sụn cá mập sau khi sấy khô, tiến hành đánh giá cảm quan để chọn
được chế độ xử lý sụn tốt nhất. Sau đó, tiến hành phân tích hóa học sụn cá.
Sụn cá mập
Tách thịt theo chế độ khác nhau
Đun sụn ở 1000C trong 30 phút
Không đun, ngâm nước 30 phút
Sụn đã tách thịt
Xay nhỏ
Sấy khô
Đánh giá
Chọn chế độ xử lý sụn
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sụn cá mập
27
Xác định các thông số của quy trình
2.2.4.3.
Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở pH khác nhau
Tự nhiên
5.5
6.5
7
7.5
Bất hoạt hoạt enzyme
Ly tâm
Dịch thủy phân
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen
Chọn pH thích hợp
Hình 2.4. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với
5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân ở điều kiện nhiệt độ 450C trong thời gian 2h và
tỷ lệ enzyme bổ sung 0.1%, chỉ thay đổi thay đổi pH ở các mức: pH tự nhiên; 6; 6.5;
7; 7.5. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó,
28
tiến hành ly tâm ở 6000v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS
theo phương pháp xanh methylen. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4 xác
định pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở tỷ lệ enzyme khác nhau (%)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Bất hoạt hoạt enzyme
Ly tâm
Dịch thủy phân
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen
Chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp
Hình 2.5. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu,
mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
29
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích
và ở nhiệt độ 450C trong thời gian 2h với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau, mẫu 1:
mẫu đối chứng 0% E, mẫu 2: bổ sung 0.1% E, mẫu 3: 0.2% E, mẫu 4: 0.3% E, mẫu
5: 0.4% E. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau
đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS
theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.5 xác
định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở nhiệt độ khác nhau (0C)
40
45
50
55
60
Bất hoạt hoạt enzyme
Ly tâm
Dịch thủy phân
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen
Chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp
Hình 2.6. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
30
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu,
mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích
trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân ở
400C, mẫu 2: 450C, mẫu 3: 500C, mẫu 4: 550C, mẫu 5: 600C. Kết thúc quá trình thủy
phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 vòng/phút
để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene
Blue. Ta có sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.6 xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy
phân.
Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với
5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH, nhiệt độ
và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân trong 2h, mẫu 2: 3h,
mẫu 3: 4h, mẫu 4: 5h, mẫu 5: 6h. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở
900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và
xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố
trí thí nghiệm 2.7 xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân.
31
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở thời gian khác nhau (h)
2h
3h
4h
5h
6h
Bất hoạt hoạt enzyme
Ly tâm
Dịch thủy phân
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen
Chọn thời gian thủy phân thích hợp
Hình 2.7. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân
2.3.
CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU VÀ HÓA CHẤT ĐÃ SỬ DỤNG.
2.3.1. Các thiết bị chủ yếu
Sử dụng các thiết bị để thực hiện đề tài chủ yếu ở phòng thí nghiệm Công nghệ
Sinh học – Trung tâm Thực hành thí nghiệm – Trường Đại học Nha Trang, phòng
thí nghiệm Hóa phân tích và phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến, gồm các thiết
bị sau: tủ sấy (Memmert – Đức), bể ổn nhiệt (Memmert – Đức), máy so màu UV –
Vis (Labomed – Mỹ), máy ly tâm (Đức), thiết bị đo pH (Hanna – Mỹ).
32
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đồ án: Xanh methylene, NaOH, KH2PO4, axit
tricloacetic, Na2CO3, thuốc thử Folin – Ciocalteau, tyrosine, H2SO4 đậm đặc, CuSO4
và K2SO4 đều là hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn cho phân tích được Trung Quốc
sản xuất.
2.4.
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lý bằng phần mền Excel 2013, phân tích sâu ANOVA phần
mềm SPSS 20.0. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí
nghiệm song song.
33
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SỤN CÁ MẬP.
Sụn cá mập khô sau khi xử lý được đánh giá cảm quan để chọn chế độ xử lý sụn
thích hợp cho quá trình thủy phân. Theo kết quả đánh giá cảm quan ở bảng 3.1 nhận
thấy rằng: sụn cá được xử lý bằng nhiệt ở 1000C trong 30 phút khả tăng loại bỏ thịt
cá tốt hơn mẫu sụn không xử lý nhiệt.
Do vậy, để đảm bảo thích hợp cho quá trình thủy phân sụn chọn chế độ xử lý
xử lý sụn là đun ở 1000C trong 30 phút.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu cảm quan mẫu sụn cá có chế độ xử lý sụn
khác nhau
STT
1
Chế độ xử lý sụn
Đun ở nhiệt độ 1000C
trong 30 phút.
2
Không đun, ngâm trong
nước 30 phút.
Đánh giá cảm quan
Tách bỏ thịt dễ dàng và loại sạch phần thịt
ra khỏi sụn cá, sụn có màu trắng.
Thịt vẫn còn bám dính trong sụn cá,
không thể loại bỏ sạch phần thịt, sụn có
màu vàng nâu.
Tiến hành lấy mẫu sụn cá mập xác định thành phần hóa học. Kết quả được thể
hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của sụn cá mập
STT
Chỉ tiêu hóa học
Thành phần (%)
1
Hàm ẩm
37.67
2
Protein thô
10.5
3
Tro
19.79
34
Nhận xét:
Từ kết quả xác định trên cho thấy hàm lượng protein thô của sụn cá chiếm
10.5%, hàm ẩm 37.67% và tro tổng số 19.79%. Vì vậy, hàm lượng CS trong sụn cá
tương đối cao. Điều này cho thấy có thể tiến hành thu nhận CS từ sụn cá mập.
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH THỦY
PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE.
3.2.1. Xác định hoạt độ của enzyme neutrase.
Tiến hành lấy mẫu xác định hoạt độ enzyme neutrase. Kết quả xác định hoạt độ
enzyme neutrase được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Xác định hoạt độ enzyme neutrase
Enzyme
Hoạt độ enzyme (PU/g)
Neutrase
1.05
Nhận xét:
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy chế độ thủy phân enzyme Neutrase có
hoạt độ 1.05PU/g nếu so sánh với hoạt độ enzyme khi mua thì thấp hơn. Vì vậy,
enzyme cần được bảo quản ở nhiệt độ -100C.
3.2.2. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH
khác nhau. Mẫu 1: thủy phân ở pH tự nhiên, mẫu 2: ở pH 6, mẫu 3: pH 6.5, mẫu 4:
pH 7 và mẫu 5 pH 7.5.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng nhiệt ở
1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành tỷ lệ
enzyme 0.1% và nhiệt độ 500C trong thời gian 5h. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến
hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm
lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.1.
35
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
pH
1
TN
107.493
2
6
108.663
3
6.5
111.132
4
7
112.002
5
7.5
112.807
Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại)
STT
100
99
98
97
96
95
94
93
92
TN
6
6.5
7
7.5
pH
Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
Nhận xét:
Kết quả phân tích bảng 3.4 và hình 3.1 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi
tăng pH thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng tăng và đạt cao nhất
ở pH = 7.5. Như vậy, ở pH = 7.5 lượng CS tạo thành cao gấp tương ứng 1.05 lần so
với khi pH tự nhiên; 1.04 lần so với khi pH = 6; 1.02 lần so với pH = 6.5, và 1.01 lần
so với khi pH = 7.
36
Kết quả trên có thể lý giải như sau: pH ảnh hưởng đến hoạt độ của của enzyme,
ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa của enzyme và đến độ bền của protein
enzyme. Do vậy, khi thay đổi pH làm thay đổi hoạt tính enzyme nên hàm lượng CS
tạo thành cũng thay đổi.
Từ các phân tích trên cho thấy ở pH 7.5 khả năng thủy phân sụn cá mập bằng
enzyme neutrase tốt nhất được thể hiện qua hàm lượng CS được tạo thành là cao
nhất. Do vậy, pH 7.5 được lựa chọn làm pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
3.2.3. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase với
tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: mẫu đối chứng; 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%. Mẫu đối
chứng không bổ sung enzyme.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng cách đun
ở 1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành ở
450C trong thời gian 2h, pH tự nhiên. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất
hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm lượng CS.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.2.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
STT
Tỷ lệ enzyme (%)
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
1
0
95.706
2
0.1
101.424
3
0.2
101.662
4
0.3
98.546
5
0.4
98.705
Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại)
37
100
99
98
97
96
95
94
93
92
91
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Tỷ lệ enzyme (%)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
Nhận xét:
Kết quả phân tích ở bảng 3.5 và hình 3.2 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi
tỷ lệ enzyme neutrase sử dụng tăng thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng cũng
tăng và đạt cao nhất khi tỷ lệ enzyme sử dụng là 0.2%. Sau đó nếu tiếp tục tăng tỷ lệ
enzyme sử dụng thì hàm lượng CS tạo thành không tăng mà có xu hướng giảm. Như
vậy, ở tỷ lệ enzyme sử dụng 0.2% lượng CS tạo thành cao gấp tương ứng 1.06, 1.03,
1.02 lần so với khi sử dụng tỷ lệ enzyme là 0; 0.3; 0.4%. Mặt khác, nếu so sánh hàm
lượng CS tạo thành ở mẫu sử dụng 0.2% enzyme neutrase so với mẫu sử dụng với tỷ
lệ enzyme neutrase 0.1% thì hàm lượng CS thu được của các mẫu này không khác
nhau về ý nghĩa thống kê.
Kết quả trên có thể lý giải như sau: Khi không sử dụng enzyme, ở nhiệt độ 450C
vẫn có một lượng CS tạo thành là do protein bị thủy phân bởi nhiệt độ. Tuy vậy, khi
tăng tỷ lệ enzyme sử dụng làm tăng quá trình phân cắt protein của sụn cá dẫn đến
38
giải phóng ra CS làm hàm lượng CS tạo thành trong dung dịch tăng. Tuy vậy, khi tỷ
lệ enzyme tăng cao sẽ làm giảm hàm lượng CS tạo thành.
Từ các phân tích ở trên cho thấy ở tỷ lệ enzyme bổ sung 0.1% có khả năng thủy
phân sụn cá mập là tốt nhất. Do vậy, tỷ lệ enzyme neutrase bổ sung 0.1% được lựa
chọn là tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập.
3.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở
nhiệt độ 400C, 450C, 500C, 550C, 600C.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng nhiệt ở
1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành ở pH
nguyên liệu, tỷ lệ enzyme 0.1% trong thời gian 2h. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến
hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm
lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
STT
Nhiệt độ (0C)
1
40
2
45
3
50
4
55
5
60
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
91.891
98.524
100.119
98.879
96.975
39
Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại)
100
98
96
94
92
90
88
86
84
82
80
40
45
50
55
60
Nhiệt độ thủy phân (0C)
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
Nhận xét:
Kết quả phân tích bảng 3.6 và hình 3.3 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi tăng
nhiệt độ thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng cũng tăng và đạt cao
nhất ở 500C. Sau đó nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành
không tăng mà có xu hướng giảm. Như vậy, ở nhiệt độ thủy phân là 500C lượng CS
tạo thành cao gấp tương ứng 1.09, 1.02, 1.01 và 1.03 lần so với khi nhiệt độ thủy
phân lần lượt là 40, 45, 55, 600C.
Kết quả trên có thể lý giải như sau: Enzyme có bản chất là protein, do vậy, nếu
nhiệt độ thủy phân cao hơn nhiệt độ tối thích của enzyme sẽ làm hoạt tính của enzyme
bị giảm mạnh do cấu trúc của enzyme bị biến đổi bởi nhiệt. Khi nhiệt độ cao làm
hỏng cấu trúc phân tử của enzyme thẩm chí có thể làm biến tính hoàn toàn enzyme,
làm cho hiệu suất thu nhận CS giảm.
40
Từ các phân tích ở trên cho thấy ở nhiệt độ 500C khả năng thủy phân sụn cá
mập bằng enzyme neutrase là tốt nhất được thể hiện qua hàm lượng CS tạo thành là
cao nhất. Do vậy, ở nhiệt độ 500C được lựa chọn làm nhiệt độ thích hợp cho quá
trình thủy phân sụn cá mập.
3.2.5. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân.
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase thời
gian thủy phân kéo dài 2, 3, 4, 5, 6h.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng nhiệt ở
1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành ở pH
nguyên liệu, tỷ lệ enzyme 0.1% và nhiệt độ 500C. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến
hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm
lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.4.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
STT
Thời gian (h)
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
100.533
100.519
101.078
101.482
101.478
Hàm lượng CS tương đối (% so với cực đại)
41
100
99
98
97
96
95
94
93
92
91
90
2
3
4
5
6
Thời gian thủy phân (h)
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
Nhận xét:
Kết quả phân tích hình 3.3 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi kéo dài thời
gian thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng tăng và đạt cao nhất ở 5h.
Sau đó nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành không
tăng. Ở thời gian thủy phân 5h hàm lượng CS tạo thành cao gấp tương ứng 1.01 lần
so với thời gian thủy phân là 3h. Tiếp tục thủy phân đến 6h, hàm lượng CS thu được
không có sự khác nhau về ý nghĩa thống kê với mẫu 5h.
Kết quả trên có thể lý giải: Thời gian thủy phân là điều kiện để enzyme thực
hiện nhiệm vụ phân cắt các liên kết giữa CS – protein, thủy phân protein để giải
phóng CS. Thời gian phải đủ dài cho quá trình phân cắt hết cơ chất dẫn đến hàm
lượng CS tạo thành cao. Tuy nhiên, khi thời gian thủy phân dài hay thời gian tối ưu
42
lượng cơ chất bị thủy phân hết không còn cơ chất cho enzyme tác động nên lượng
CS tạo thành không tăng.
Từ các phân tích ở trên cho thấy ở thời gian 5h khả năng thủy phân sụn cá mập
bằng enzyme neutrase là tốt nhất được thể hiện qua hàm lượng CS tạo thành là cao
nhất. Do vậy, ở thời gian 5h được lựa chọn làm thời gian thích hợp cho quá trình
thủy phân sụn cá mập.
3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP ĐỂ THU
NHẬN CHONDROITIN SULFATE.
Quy trình thu nhận chondroitin sulfate
Từ kết quả nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất quy trình thủy phân và thu nhận CS
từ sụn cá mập được trình bày ở hình 3.6.
Thuyết minh quy trình
+ Xử lý: Sụn cá mập được xử lý bằng cách đun nóng ở nhiệt độ 1000C trong
1h, tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
+ Thủy phân: Đây là khâu quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm sau
này. Sụn cá sau khi xử lý được làm nguội và tiến hành hành thủy phân ở điều kiện
nhiệt độ 500C, thời gian 5h, pH = 7.5 và tỷ lệ enzyme là 0.1%. Trong quá trình thủy
phân, cách 30 phút tiến hành khuấy đảo nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzyme
và cơ chất, đồng thời đảm bảo sự truyền nhiệt đồng đều giữa các vị trí trong mẫu.
+ Bất hoạt enzyme: Nhằm ngừng hoạt động của enzyme, kết thúc quá trình
thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút.
+ Ly tâm: hỗn hợp sau khi thủy phân tiến hành ly tâm nhằm tách bỏ cặn. Tiến
hành ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút.
+ Tủa dịch bằng TCA: Nhằm loại bỏ protein còn trong dịch sau khi thủy phân,
tăng độ tinh sạch của CS. Tiến hành tủa bằng TCA 7%, tỷ lệ 1:2. Sau đó, ly tâm loại
bỏ phần tủa.
+ Tủa ethanol: Thu CS tinh sạch, sử dụng ethanol 960, tỷ lệ 1:3 để thu tủa hoàn
toàn. Sau khi tủa bằng ethanol để thu được CS, tiến hành sấy khô.
43
Sụn cá mập
Xử lý nhiệt 1000C trong 1h
Thủy phân trong điều kiện thích hợp đã xác định
Bất hoạt enzyme
Ly tâm ở 6000 v/phút trong 10 phút
Dịch thủy phân
Kết tủa protein hòa tan bằng TCA 7%
Ly tâm
Dịch chứa CS thô
Kết tủa CS bằng ethanol
Ly tâm
Chế phẩm CS
Sấy khô
Chondroitin sulphat thô
Hình 3.5. Sơ đồ quy trình thủy phân sụn cá mập để sản xuất chondroitin
sulphat bằng Neutrase
44
Thử nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase
Tiến hành thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở các điều kiện thích
hợp ở trên. Sau khi thủy phân thu nhận CS và đánh giá hiệu suất thu nhận CS, kết
quả được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hiệu suất thu nhận Chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Khối lượng sụn cá (g)
Khối lượng CS thu được (g)
Hiệu suất (%)
100
17.2802
17.2802
Hình 3.6. Hình ảnh về dịch thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase
Hình 3.7. Hình ảnh về chế phẩm Chondroitin sulphat thô thủy phân từ sụn cá
mập
45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra kết luận như sau:
1) Đã tiến hành thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase và thu được một
số thông số thích hợp: pH = 7.5, tỷ lệ enzyme 0.1%, ở nhiệt độ 500C trong thời gian
5h.
2) Đã tiến hành thử nghiệm thủy phân CS bằng enzyme Neutrase với các thông
số tối ưu đã lựa chọn, cho thấy hiệu suất thu CS so với tổng lượng sụn là 17.3%.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Qua quá trình nhiên cứu cho phép đề xuất cho phép đề xuất một số ý kiến sau:
- Cần tiếp tục nghiên cứu về khoảng pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
- Nghiên cứu tối ưu hóa cho quá trình thủy phân.
- Tinh sạch CS theo phương pháp sử dụng enzyme để thủy phân sụn cá mập.
46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt.
1. Võ Hoài Bắc, Ðỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Ðình, Lê Thị Lan Oanh, (2010),
“Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (Dasyatis kuhlii)
và cá nhám (Carcharhinus sorrah) bằng công nghệ sinh học”, Tạp chí Viện nghiên
cứu Hải sản Số 16, tr 26 – 30.
2. Vũ Ngọc Bội (2004), “Nghiên cứu sản xuất protease từ B.subtilis và ứng
dụng để sản xuất dịch đạm thủy phân từ cá mối”, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa
học cấp bộ, Trường Đại học Nha Trang.
3. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Ðỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, (1998)
“Công nghệ enzyme”. Nhà xuất bản nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
4. Ðặng Văn Hợp, Ðỗ Minh Phụng, (1997), Giáo trình phân tích kiểm nghiệm
sản phẩm thủy sản, Truờng ÐH Nha Trang.
5. Phạm Thị Khánh Vân, Vũ Thị Thái, (2004), Phím nuớc mắt và tác dụng của
Chondrroitin sulfate, Tạp chí Thuốc và Sức khoẻ, Số 273.
6. Nguyễn Văn Long và Võ Sĩ Tuấn, Tạp chí khoa học và công nghệ biển –
12/2012. Viện hải dương học Nha Trang.
Tài liệu tiếng anh.
7. Antonilli L, Paroli E, (1993), Role of the oligosaccharide inner core in the
inhibition of human leukocyte elastase by chondroitin sulfates.
8. Bruyere O, Reginster JY, (2007), Glucosamine and chondroitin sulfate
astherapeutic agents for knee and hip osteoarthritis Drugs Aging.
9. Hascall V.C. (1988), Proteoglycans: The chondroitin sulfate/keratin sulfate
proteoglycan of cartilage, Institute for Scientific Information Atlas of Science,
Biochemistry, Institute for Scientific Information, Philadelphia.
47
10. Kazufusa S, Yozo K, Toshihiko T, Toshio I, Yoichiro I, (2001), Separation
of chondroitin sulfate and hyaluronic acid fragments by centrifugal precipitation
chromatography, Journal of Chromatography A.
11. Somashekar P.L, Tripathy A. S, Sathish K.P, Chandrashekar Javali (2011)
“Colorimetric estimation of Chondroitin Sulfate in bulk drug and pharmaceutical
formulation using cationic dye Methylene Blue”
12. Vittayanont, M. and Jaroenviriyapap, T (2013) “Production of crude
chondroitin sulfate from duck trachea”
13. Xie, J., Ye, H. Y. and Luo, X. F. (2014) “An efficient preparation of
chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage”
14. Trang web tham khảo
http://www.hiendaihoa.com/environment_detail.php?id=224
http://dictionary.bachkhoatoanthu.gov.vn
http://ccbolgroup.com/hierbas2E.html
http://vi.wiktionary.org/wiki/hplc
http://wikipedia.Cartilage
http://wikipedia.BME/ME 456 Biomechanics
http://wikipedia.Chondrroitin Sulfate
48
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
KIỂM NGHIỆM HÓA HỌC
1.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NƯỚC THEO PHƯƠNG PHÁP SẤY
KHÔ.
a. Nguyên lý
Dùng sức nóng làm bay hơi hết hơi nuớc trong thực phẩm. Cân trọng lượng
thực phẩm truớc và sau khi sấy khô. Từ đó tính ra phần trăm (%) nước có trong thực
phẩm.
b. Dụng cụ - hóa chất
- Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ (100 – 1050C).
- Bình hút ẩm.
- Cân phân tích chính xác 10-4g.
- Cốc cân.
- Đũa thủy tinh
c. Tiến hành
Lấy 1 cốc thủy tinh có đựng 10 ÷ 30g cát và 1 đũa thủy tinh dẹt đầu đem sấy ở
100 ÷ 1050C cho đến khối lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và đem cân
ở cân phân tích chính xác 10-4g. Sau đó cho vào cốc cân khoảng 10g mẫu thử đã
chuẩn bị sẵn. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác như trên.
Dùng đũa thủy tinh trộn đều mẫu thử rồi dàn đều thành lớp mỏng. Cho tất cả
vào tủ sấy, sấy ở 100 ÷ 1050C, sấy khô đến khối lượng không đổi (thường là sau 6h).
Trong thời gian sấy, cứ sau 1h lại dùng đũa thủy tinh dẹp nghiền nhỏ các phần vón
cục, sau đó lại dàn đều và tiếp tục sấy. Sấy xong đem làm nguội trong bình hút ẩm
đem cân ở cân phân tích.
49
Cho lại vào tủ sấy, sấy ở 100 ÷ 1050C trong 30 phút rồi lấy ra làm nguội trong
bình hút ẩm và cân như trên cho tới trọng lượng không đổi. Kết quả giữa hai lần cân
không cách nhau quá 0.5mg cho mỗi mẫu thử.
d. Tính kết quả
Độ ẩm được tính theo công thức:
𝑋=
(𝐺1 − 𝐺2 ) × 100
(%)
𝐺1 − 𝐺
Trong đó:
X: độ ẩm của mẫu thử (%).
G: Trọng lượng cốc cân (g)
G1: Trọng lượng cốc cân + mẫu trước khi sấy (g)
G2: Trọng lượng cốc cân + mẫu sau khi sấy (g)
Sai lệch kết quả 2 lần xác định song song không được lớn hơn 0.5%. Kết quả
cuối cùng là kết quả của 2 lần xác định song song.
Tính chính xác đến 0.01%
1.2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHOÁNG THEO PHƯƠNG PHÁP
NUNG
a. Nguyên lý
Dùng sức nóng 550 ÷ 6000C nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Phần còn lại
đem cân và tính ra hàm lượng khoáng có trong thực phẩm.
b. Dụng cụ - hóa chất
- Dụng cụ.
- Tủ nung.
- Cốc nung
- Bếp điện
50
- Bình hút ẩm.
- Kẹp, khay inox
- H2O2 hoặc HNO3.
c. Tiến hành
Nung chén sứ đã rửa sạch trong lò nung ở nhiệt độ 5500C đến trọng lượng không
đổi sau đó lấy ra, để nguội trong bình hút ẩm và cân ở cân phân tích chính xác đến
10-4g. Cho vào chén khoảng 5g mẫu thử. Cân tất cả ở cân phân tích với độ chính xác
như trên. Cho tất cả vào lò nung và tăng nhiệt độ từ từ cho đến 550 ÷ 6000C.
Nung đến tro trắng nghĩa là đã loại bỏ hết các hợp chất hữu cơ, thường 6 ÷ 7 h.
Trường hợp tro còn đen lấy ra để nguội, cho thêm vài giọt H2O2 hoặc HNO3
đậm đặc và nung lại cho đến tro trắng. Để nguội trong bình hút ẩm và cân đến độ
chính xác như trên. Tiếp tục nung thêm ở nhiệt độ trên trong 30 phút rồi để nguội
trong bình hút ẩm và cân cho đến trọng lượng không đổi.
d. Tính kết quả
Độ ẩm được tính theo công thức:
𝑋=
(𝐺1 − 𝐺2 ) × 100
(%)
𝐺1 − 𝐺
Trong đó:
X: độ ẩm của mẫu thử (%).
G: Trọng lượng cốc nung (g)
G1: Trọng lượng cốc nung+ mẫu (g)
G2: Trọng lượng cốc nung + tro (g)
Trong trường hợp các loại thực phẩm dễ bốc cháy nên đốt trên bếp điện thành
tro đen, không bốc cháy nữa mới cho vào lò nung.
Nếu thực phẩm lỏng, cô cạn trên ngọn lửa bếp điện trước khi nung.
51
1.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP
KJELDAHL.
a. Nguyên lý
Để xác định đạm trong thực phẩm người ta dùng H2SO4 đậm đặc và hóa chất
xúc tác đặc biệt CuSO4 và K2SO4 theo tỷ lệ 1/10 hoặc 1/3 để vô cơ hóa mẫu, mục
đích để chuyển toàn bộ đạm trong thực phẩm về dạng muối (NH4)2SO4. Sau đó dùng
NaOH đẩy NH3 ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH3 ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốc
hứng chứa H2SO4 0.1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0.1N chuẩn độ lại H2SO4 dư.
Các phản ứng sau:
R1 - CH - CO – NH – CH – R2 + H2SO4
COOH
NH2
(NH4)2SO4 + 2NaOHđặc
(NH4)2SO4 + CO2 + H2S + SO2
Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O
2NH3 + H2SO4
(NH4)2SO4
NaOH + H2SO4 dư
Na2SO4 + 2H2O
b. Dụng cụ, vật liệu và thuốc thử
- Dụng cụ, vật liệu thông dụng của phòng thí nghiệm
- Bình kjeldahl
- H2SO4 đậm đặc.
- Các chất xúc tác: Có thể sử dụng một trong các hỗn hợp dưới đây:
1.
2.
K2SO4:
50g
CuSO4:
3,5g
K2SO4:
100g
CuSO4:
10g
Seleni bột
1g
52
3.
K2SO4:
100g
CuSO4:
10g
HgO:
10g
Hai loại xúc tác 2 và 3, vô cơ hóa rất nhanh, nhưng loại xúc tác thứ 3 bay hơi
Hg rất độc.
- NaOH 40% (D = 1.33, không chứa carbonate).
- Chỉ thị màu: có thể sử dụng một trong các chất chỉ thị sau:
Alizarin natri sunfonat hoặc
Chỉ thị màu Tashiro gồm:
Dung dịch A: Methyl đỏ
0.10g
Cồn 950 vừa đủ
100ml.
Hòa tan ở nồi cách thủy sôi.
Dung dịch B: Dung dịch xanh methylene 1% trong nước
Cồn 950 vừa đủ
4ml
100ml
Khi dùng pha 1 thể tích dung dịch A với 1 thể tích dung dịch B.
Hỗn hợp chỉ thị màu có màu xanh lục ở pH > 5.5 chuyển thành tím ở pH < 5.5.
Chuyển màu ở giai đoạn màu xám bẩn pH = 5.5.
Trong trường hợp chuyển màu không rõ ràng, có thể thay đổi tỷ lệ pha chế giữa
hai dung dịch để làm sao khi chuyển màu thì màu xanh lục giảm từ từ và 1 giọt dung
dịch chuẩn NaOH 0.1N làm màu chuyển sang xám bẩn đột ngột và thêm một giọt
nữa màu chuyển sang màu tím.
- Dung dịch acid boric bão hòa có pH = 5.5:
Acid boric
40g
Nước cất vừa đủ
1000ml
Hòa tan 40g acid boric vào trong một ít nước nóng, sau khi để nguội, cho thêm
nước vừa đủ 1000ml. Điều chỉnh đến pH = 5.5 bằng NaOH 0.1N (khoảng 13ml) với
hỗn hợp chỉ thị màu Tashiro cho đến màu xám bẩn.
53
- Dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N hoặc HCl 0.1N.
- Natri hyposulphite tinh khiết (Na2S2O3) hoặc natri hypophosphite
(NaPO2H2).
c. Cách tiến hành
Lấy chính xác 1g mẫu cho cẩn thận vào bình Kjeldahl, thêm 2g hỗn hợp chất
xúc tác (CuSO4/K2SO4) và 10ml H2SO4 đậm đặc để nghiêng trên bếp đun từ từ. Trong
quá trình vô có hóa màu sắc của của mẫu chuyển từ màu nâu đen sang màu vàng rồi
xanh trong hoặc không màu là được.
Rửa thiết bị chưng cất: Tiến hành sục rửa thiết bị chưng cất và kiểm tra các
khớp nối phải đảm bảo độ kín.
Chuẩn bị cốc hứng: Cho vào cốc hứng 10ml dung dịch H2SO4 0.1N và vài giọt
methyl đỏ, đặt cốc hứng ngập dưới đầu ống sinh hàn của thiết bị chưng cất. Sau đó,
cho mẫu đã vô cơ hóa vào bình cầu chứa mẫu, thêm vài giọt phenolphthalein và cho
từ từ dung dịch NaOH 40% cho đến khi có màu hồng đậy kín các khớp nối và tiến
hành chưng cất lôi cuống hơi nước. Định lượng trực tiếp NH3 bay ra bằng H2SO4
0.1N dư có trong cốc hứng sau đó dùng NaOH 0.1N chuẩn độ lại lượng H2SO4 0.1
dư.
d. Tính kết quả
Hàm lượng đạm toàn phần theo phần trăm:
N
tp
0,0014 A B 100
P
Trong đó:
A: là số ml d2 H2SO4 0.1N dùng trong cốc hứng.
B: là số ml d2NaOH 0.1N dùng trong chuẩn độ.
P: là trọng lượng mẫu.
0.0014: là số gam Nitơ tương ứng với 1ml d2 H2SO4 0.1N
54
1.4. CÔNG THỨC TÍNH HIỆU SUẤT THU NHẬN CHONDROITIN
SULFATE.
Công thức tính hiệu suất thu nhận CS:
𝑋 (%) =
𝑀 × 100
𝑀1
Trong đó:
- X: Hiệu suất thu nhận CS (%).
- M: Khối lượng CS thu được (g)
- M1: Khối lượng sụn cá (g).
55
PHẦN II. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH
THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME
NEUATRASE.
2.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson.
Bảng 2.1. Kết quả đo nồng độ tyrosin ở bước sóng 660nm
Mật độ quang (OD)
Tyrosine
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
(ml)
HCl 0.2M 4.95
4.9
4.85
4.8
4.75
4.7
4.65
4.6
4.55
4.5
(ml)
Nồng độ 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
0.1
tyrosine
(µmol/ml)
OD
0.026 0.057 0.084 0.094 0.113 0.143 0.151 0.174 0.185 0.201
0.30
0.25
y = 1.8921x + 0.0187
R² = 0.9865
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
Nồng độ tyrosine (µmol/ml)
Hình 2.1. Đường chuẩn tyrosin
56
2.2. Kết quả xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Hình 2.2. Ảnh hưởng của pH thủy phân đến lượng CS thu được từ 10g nguyên liệu
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
CS
CS
CS
CS
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
0.3131
107.573
0.2994
108.790
0.2764
110.833
0.2621 112.103 0.2586 112.414
0.3129
107.514
0.3002
108.636
0.2719
111.137
0.2628 111.941 0.2592 112.260
0.3137
107.392
0.3004
108.563
0.2679
111.425
0.2618 111.963 0.2596 112.156
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
CS
114
113
112
111
110
109
108
107
106
105
104
NL
6
6.5
7
7.5
pH
Hình 2.2. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
57
2.3. Kết quả xác định tỷ lệ enzyme với nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy
phân.
Bảng 2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được từ 10g sụn
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
CS
CS
CS
CS
CS
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
0.3584 95.935 0.2956 101.581 0.2940 101.725 0.3245 98.983 0.3249 98.947
0.3569 95.942 0.3012 100.872 0.2931 101.589 0.3249 98.774 0.3230 98.942
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
0.3647 95.241 0.2924 101.819
0.294
101.674 0.3357 97.879 0.3319 98.225
103
102
101
100
99
98
97
96
95
94
93
92
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Tỷ lệ enzyme bổ sung (%)
Hình 2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
58
2.4. Kết quả xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến lượng CS thu được từ 10g nguyên
liệu
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
CS
CS
CS
CS
CS
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
91.475
0.3848
98.570
0.3586
100.187 0.3750 99.175 0.4097 97.032
0.4908
91.949
0.3809
98.666
0.3581
100.059 0.3804 98.697 0.4189 96.344
0.4864
92.249
0.3868
98.336
0.3578
100.109 0.3798 98.764 0.3997 97.548
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
0.4997
102
100
98
96
94
92
90
88
86
40
45
50
55
60
Nhiệt độ thủy phân (0C)
Hình 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
59
2.5. Kết quả xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến lượng CS thu được từ 10g
nguyên liệu
Mẫu 1
Mẫu 2
Mẫu 3
Mẫu 4
Mẫu 5
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
Đo
Hàm
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
OD
lượng
CS
CS
CS
CS
CS
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
(mg)
100.489
0.3572
100.614
0.3496
101.111
0.3429 101.548 0.3436 101.503
0.3586
100.531
0.3598
100.453
0.3512
101.014
0.3438 101.497 0.3441 101.477
0.3581
100.577
0.3594
100.492
0.3499
101.109
0.3454 101.402 0.3446 101.454
Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
0.3591
102.0
101.8
101.6
101.4
101.2
101.0
100.8
100.6
100.4
100.2
100.0
2
3
4
5
6
Thời gian thủy phân (h)
Hình 2.5. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau
thủy phân
[...]... 2.2 Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập 25 Thuyết minh quy trình + Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang Sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn Sụn cá mập sau khi thu nhận được tách bỏ thịt, làm khô để sử dụng làm nguyên liệu thủy phân thu CS Trước khi thủy phân, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với tốc độ 25000... Chondroitin sulphat từ sụn cá mập Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat Quá trình tham khảo tài liệu, đề tài dự kiến qui trình thu nhận Chondroitin sulfate từ sụn cá mập được trình bày ở hình 2.2 24 Sụn cá mập Xử lý Thủy phân Bất hoạt enzyme Ly tâm Dịch thủy phân Kết tủa protein hòa tan bằngTCA Ly tâm Dịch chứa CS thô Kết tủa CS thô bằng ethanol Ly tâm Chế phẩm CS thô Sấy khô Chondroitin. .. quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học để thuỷ phân sụn Phương pháp hoá học: Mô sụn được xử lý bằng dung dịch muối, kiềm (NaOH) hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…), phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò Nhược điểm của phương pháp hóa học là có hiện tượng tác động... vòng/phút trong thời gian 30 phút + Xử lý: Sụn cá được xử lý bằng cách đun nóng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ + Thủy phân: Sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS Vì CS thường gắn với protein bằng liên kết o – glycosid tạo thành phức proteoglycan + Bất hoạt enzyme: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme bằng cách đun nóng ở 900C trong thời gian 15... được chế độ xử lý sụn tốt nhất Sau đó, tiến hành phân tích hóa học sụn cá Sụn cá mập Tách thịt theo chế độ khác nhau Đun sụn ở 1000C trong 30 phút Không đun, ngâm nước 30 phút Sụn đã tách thịt Xay nhỏ Sấy khô Đánh giá Chọn chế độ xử lý sụn Hình 2.3 Sơ đồ xử lý sụn cá mập 27 Xác định các thông số của quy trình 2.2.4.3 Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân Sụn cá mập Xử lý Thủy phân ở pH khác... trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý sụn cá mập Từ tham khảo các nghiên cứu trước đây, đồ án thử nghiệm xử lý sụn cá theo quy trình trình bày ở hình 2.3 Thuyết minh quy trình + Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang Sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn 26 + Tách thịt: Quá trình tách sụn cá mập được tiến hành theo hai chế độ xử lý sụn khác... tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705 – 1990 + Xác định hàm lượng khoáng: Xác định hàm lượng khoáng của sụn cá mập bằng phương pháp nung ở 6000C 2.2.2 Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson a Nguyên tắc Dùng protein casein hoặc Hb (Hemoglobin) làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng. .. 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, cụ thể là: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ thủy phân. .. Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân cần thích hợp để enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt Thời gian thủy phân kéo... hoạt enzyme Ly tâm Dịch thủy phân Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Chọn pH thích hợp Hình 2.4 Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân Thuyết minh sơ đồ Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10% Tiến hành quá trình thủy phân ở điều kiện nhiệt độ 450C trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme ... cứu chondroitin sulphat có xu hướng sử dụng enzyme để thủy phân sụn cá 2 Được chấp nhận Nhà trường em tiến hành đề tài: Thử nghiệm thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat phương pháp sử dụng. .. enzyme neutrase Mục tiêu đề tài: Thử nghiệm sử dụng enzyme neutrase thủy phân sụn cá mập để tạo chondroitin sulphat Nội dung thực đề tài: Xác định điều kiện phù hợp cho trình thủy phân sụn cá. .. sụn cá mập tạo chondroitin sulphat phương pháp sử dụng enzyme neutrase: tỷ lệ enzyme, pH thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân Sơ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin