Thử nghiệm thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase

Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy chondroitin sulphat có thể được thu nhận từ một số nguồn nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò… Chondroiti

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o

NGUYỄN THỊ THU THẢO

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

o0o

NGUYỄN THỊ THU THẢO

THỬ NGHIỆM THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP TẠO CHONDROITIN SULPHAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LỜI CẢM ƠN

Ðể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này,

Em xin gửi tới Ban Giám hiệu Truờng Ðại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên cứu tại Truờng trong những năm qua

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy TS Vũ Ngọc Bội – Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nha Trang và TS Nguyễn Duy Nhứt – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang: Số 2 Hùng Vương – Nha Trang – Khánh Hòa, đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình em thực hiện đề tài

Xin cảm ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp

đỡ và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại Trường Xin chân thành biết ơn các thầy cô quản lý các phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Hoá sinh, phòng thí nghiệm Hóa đại cương, phòng thí nghiệm CNCB, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Môi truờng đã tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình làm đề tài

Xin chân thành cảm ơn các anh chị, cô chú làm việc tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm nghiên cứu tại Viện

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các bạn

đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ em thực hiện đề tài

Sinh viên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ SỤN ĐỘNG VẬT 3

1.2 GIỚI THIỆU VỀ CHONDROITIN SULPHAT 4

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat 4

1.2.2 Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat 6

1.2.3 Ứng dụng của chondroitin sulphat 7

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP 9

1.3.1 Giới thiệu về cá mập 9

1.3.2 Tình hình khai thác cá mập hiện nay 10

1.4 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 11

1.4.1 Phân loại và đặc điểm của protease 11

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng của quá trình thủy phân 14

1.4.3 Ứng dụng của protease 15

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT 17 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 19

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa học 19

2.2.2 Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson 20

2.2.3 Định lượng chondroitin sulphat theo phương pháp xanh methylen 22

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

2.3 CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU VÀ HÓA CHẤT ĐÃ SỬ DỤNG 31

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SỤN CÁ MẬP 33

3.2 XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE 34

3.2.1 Xác định hoạt độ của enzyme neutrase 34

3.2.2 Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân 34

3.2.3 Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân 36

3.2.4 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân 38

3.2.5 Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân 40

3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP ĐỂ THU NHẬN CHONDROITIN SULPHAT 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 45

KẾT LUẬN 45

ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM HÓA HỌC 48

PHỤ LỤC II KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUATRASE 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS 5

Hình 1.2 Cấu trúc mạch của các CS 5

Hình 1.3 Phân loại cá mập 10

Hình 2.1 Hình ảnh về sụn cá mập 19

Hình 2.2 Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập 24

Hình 2.3 Sơ đồ xử lý sụn cá mập 26

Hình 2.4 Xác định pH tối thích cho quá trình thủy phân 27

Hình 2.5 Xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân 28

Hình 2.6 Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân 29

Hình 2.6 Xác định thời gian tối thích cho quá trình thủy phân 31

Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 35

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 37

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 39

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 41

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình thủy phân sụn cá mập để sản xuất CS bằng neutrase 43

Hình 3.6 Hình ảnh về dịch thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase 44

Hình 3.7 Hình ảnh về chế phẩm chondroitin sulphat thô thủy phân từ sụn cá mập 44

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn 3

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá chỉ tiêu cảm quan mẫu sụn cá có chế độ xử lý sụn khác nhau 33

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của sụn cá mập 33

Bảng 3.3 Xác định hoạt độ enzyme neutrase 34

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 35

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 36

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 38

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân 40

Bảng 3.8 Hiệu suất thu nhận chondrotin sulphat từ sụn cá mập 44

LỜI MỞ ĐẦU

Chondroitin sulphat là thành phần cơ bản cấu tạo nên sụn khớp Chondroitin sulphat còn có mặt trong các tổ chức sợi chun (gân, cơ, dây chằng…) tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi trong hoạt động khớp, tạo độ bền khi bị nén ép Trong y học, chondroitin sulphat được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp Chondroitin sulphat làm tăng sản xuất chất nhầy và khả năng bôi trơn của dịch khớp, đảm bảo chức năng dinh duỡng và sự vận động linh hoạt của khớp Vì vậy, chondroitin sulphat giúp hạn chế quá trình thoái hoá khớp Chondroitin sulphat còn

có vai trò bảo vệ sụn khớp bằng cách ức chế các enzyme phá huỷ sụn khớp như collagenase, phospholipase A2, N–acetylglucosamindase Ngoài ra, chondroitin sulphat cũng góp phần nuôi duỡng các tế bào của giác mạc mắt, tái tạo lớp giác mạc Một trong những tác dụng quan trọng khác của chondroitin sulphat là khả năng ức chế hoạt chất angiogenesis - chất kích thích tạo tân mạch trong các khối u, làm cho khối u hạn chế phát triển Hiện nay, các thuốc kết hợp chondroitin sulphat và glucosamine đang được sử dụng hiệu quả để điều trị bệnh viêm khớp

Do phân tử chondroitin sulphat rất đa dạng và phức tạp cho nên chondroitin sulphat chưa đuợc tổng hợp bằng con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên Trong đó, sụn cá thường có hàm lượng chondroitin sulphat cao hơn các loại động vật khác Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy chondroitin sulphat có thể được thu nhận từ một số nguồn nguyên liệu như da của cá

Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…

Chondroitin sulphat có thể thu nhận từ sụn động vật bằng phương pháp thủy phân với tác nhân xúc tác là acid Nhược điểm của phương pháp sử dụng acid là có hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn đến làm giảm hoạt tính Vì vậy, các nhà nghiêm cứu về chondroitin sulphat đang có xu hướng sử dụng enzyme để thủy phân sụn cá

Được sự chấp nhận của Nhà trường em tiến hành đề tài: “Thử nghiệm thủy

phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase”

Mục tiêu của đề tài:

Thử nghiệm sử dụng enzyme neutrase thủy phân sụn cá mập để tạo chondroitin sulphat

Nội dung thực hiện của đề tài:

1 Xác định điều kiện phù hợp cho quá trình thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng phương pháp sử dụng enzyme neutrase: tỷ lệ enzyme, pH

thích hợp, nhiệt độ thích hợp, thời gian thủy phân

2 Sơ bộ đề xuất quy trình thủy phân sụn cá mập tạo chondroitin sulphat bằng

enzyme neutrase

3 Thử nghiệm tạo chondroitin sulphat từ sụn cá mập

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Số liệu nghiên cứu của đề tài là số liệu mốc, khẳng định việc có thể sử dụng enzyme neutrase nói riêng và enzyme protease nói chung trong việc thủy phân để thu chondroitin sulphat

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài là các số liệu ban đầu làm nền tảng cho quá trình tiếp tục sử dụng enzyme neutrase trong thủy phân sụn cá để sản xuất chondroitin sulphat

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

Sụn động vật là loại mô liên kết đặc, tồn tại trong cơ thể động vật có xương sống cũng như ở động vật không xương sống Trong cơ thể nguời và các loài động vật có xương sống khác, sụn có ở nhiều bộ phận như các khớp, xương suờn, tai, mũi, ống hô hấp, đĩa đệm cột sống… Sụn là phần chính trong bộ xương của bào thai, nhưng nó sẽ biến đổi thành xương khi cơ thể truởng thành Các loài cá sụn

(Chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những loài động vật có xương sống nhưng

bộ xương hoàn toàn sụn ngay cả khi ở tuổi truởng thành

Sụn chỉ chứa một loại tế bào, không có mạch máu, không chứa các tế bào thần kinh – aneurol và không chứa hệ bạch huyết – alymphatic

Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm Thành phần hoá học của hai loại sụn trên gồm hai pha: chủ yếu là pha lỏng bao gồm nuớc và các chất điện phân, pha rắn

do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes) Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn

Bảng 1.1 Thành phần chính của mô sụn

Sụn khớp 68.0 – 85.0 10.0 – 20.0 (loại I) 5.0 – 10.0

Sụn chêm 60.0 – 70.0 15.0 – 25.0 (loại II) 1.0 – 2.0

Thành phần chính của hai loại sụn đuợc thể hiện trong bảng 1.1 Ba thành phần chính này tác động đồng bộ, tạo nên đặc tính cơ học của sụn Sự thay đổi của các thành phần này (do bị bệnh lão hoá ) sẽ làm thay đổi đặc tính cơ học phụ thuộc vào

thời gian của sụn Có tới 30% nuớc nằm trong khoảng không giữa các sợi collagen Chondroitin là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong sụn

[12], [13]

1.2.1 Đặc điểm và cấu trúc của chondroitin sulphat

Vào những năm 60, Davidson và Meyer là người đã phát hiện và lần đầu tiên tách chiết được CS CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide được gọi là glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polime mạch thẳng không phân nhánh CS gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 đuờng

(disaccharide) N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen

kẽ nhau (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này

được sulfate hóa hoặc không được sunlfate hóa , một số gốc GlcA bị epime hoá thành L-iduronic acid (IdoA) CS là một polime có phân tử lớn gồm 15 – 150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc Khối luợng phân tử của CS thuờng biến động

trong khoảng 10.000 – 100.000 Dalton

Kato (1994) và Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thuờng gắn với các protein

bằng liên kết o-glycosid tạo thành một proteoglycan (PG), là hợp chất hữu cơ thuộc

nhóm mucopolysaccharide

Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzym và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có diện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào Phân tử (monomer) PG của mô sụn (chứa khoảng 80 – 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất

Công thức hoá học của chondroitin sulphat (C14H21NO14S)n:

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của một đơn vị trong chuỗi CS

Hình 1.2 Cấu trúc mạch của các chondroitin sulphat

Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C chúng đặc trưng bởi số luợng và vị trí của nhóm sulphat trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide Chondroitin sulphat A: gốc sulphat gắn ở vị trí C-4 (chondroitin-4-sulphat, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit Chondroitin sulphat B: acid iduronic thay thế acid glucuronic Chondroitin sulphat C: gốc sulphat gắn ở vị trí C-6 (chondroitin-6-sulphat, CS6) Loại A và B (CS4) thuờng được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), nguợc lại loại C (CS6) đuợc tìm thấy chủ yếu

ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối (rays, skates) ) Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thuớc, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số luợng các isome của CS, có tới 16n isome của CS, phụ thuộc vào

sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đuờng đôi tạo nên 16 isome/mỗi cặp Trong

đó, CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG

CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hoà tan tốt trong nuớc vì thế rất dễ hút ẩm, nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, cetone Khối luợng phân tử của CS nguyên liệu thuờng đuợc sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn, khoảng 15000 - 20000 Dalton

1.2.2 Các phương pháp thu nhận và định lượng chondroitin sulphat

Do phân tử CS rất đa dạng và phức tạp cho nên CS chưa đuợc tổng hợp bằng con đuờng hóa học mà chủ yếu được thu nhận từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy CS có thể được thu nhận từ một số nguồn

nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, sụn gà, sụn bò…

CS thô mới chỉ được thu nhận duy nhất từ các nguồn tự nhiên nhờ chiết xuất

CS từ các loại mô động vật Sụn cá mập (xương sọ, xương sống, vây ) là nguồn nguyên liệu CS phổ biến nhất trong các chế phẩm thuốc và chế phẩm bổ sung dinh

duỡng

CS trong mô động vật liên kết chặt với protein trong dạng phức proteoglycan Cho nên để tách CS ra khỏi protein cần làm yếu mối liên kết giữa CS – protein và phân huỷ protein để giải phóng các phân tử CS

Hiện nay, quá trình thu nhận chế phẩm CS thô từ sụn được thực hiện bằng phương pháp hoá học hoặc phương pháp sinh học để thuỷ phân sụn

Phương pháp hoá học: Mô sụn được xử lý bằng dung dịch muối, kiềm (NaOH)

hoặc acid (HCl, CH3COOH ) để tách GAG khỏi các phân tử khác (protein, hyaluronic acid…), phương pháp này đã được áp dụng để thu CS từ sụn gà, sụn bò Nhược điểm của phương pháp hóa học là có hiện tượng tác động đến gốc sulfate dẫn đến làm giảm hoạt tính

Phương pháp sinh học: Dùng enzym để thuỷ phân mô sụn và là phương pháp

rất hiệu quả CS thu nhận theo phương pháp này không bị biến đổi về cấu trúc, giữ

đuợc hoạt tính sinh học của chúng và làm giảm thiểu ô nhiễm môi truờng do các hoá

chất (muối, kiềm, acid ) gây nên Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các protease (papain, actinase, pronase…) để thuỷ phân sụn giải phóng GAG khỏi các protein liên kết Sau khi loại bỏ protein thì CS đuợc tách ra và tinh sạch Phương pháp này đã đuợc dùng

để thu nhận GAG từ da cá Labeo rohita, sụn của mực, cá mập, cá sấu, cá đuối, sụn

khí quản vịt…

Các chuỗi dài hydrophilic polymers GAG không tan trong ethanol, cetone và methanol Vì vậy, có thể sử dụng các dung môi này để thu CS Một số nghiên cứu cho thấy ethanol 60-70% tủa đuợc hàm luợng CS cao nhất và tách CS với một số polysaccharide khác

1.2.3 Ứng dụng của chondroitin sulphat

CS đuợc xem là chế phẩm bổ sung dinh duỡng và sử dụng rộng rãi Trong một năm từ 1998 đến 1999 doanh thu bán lẻ ở Mỹ đạt tới 500 triệu USD CS có nhiều tác dụng trong lĩnh vực bệnh lý trong thời gian dài và đang ngày càng đuợc mở rộng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau

Ứng dụng trong y học:

- Bệnh khớp:

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh CS có tác dụng hỗ trợ điều trị các bệnh lý về xương khớp, đặc biệt là bệnh viêm xương khớp CS đuợc tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp, tăng sự mềm mại của khớp

Cơ chế tác dụng của chondroitin sulphat trong việc làm giảm bệnh lý xương khớp chính là bảo vệ khớp bằng cách ức chế các enzym có vai trò phá hủy sụn như collagenase, elastase, proteoglycanase, phospholipase A2 và N – acetylglucosamindase và kích thích tăng hoạt các enzym có vai trò xúc tác phản ứng tổng hợp acid hyaluronic (là chất giúp khớp hoạt động tốt) Ðiều trị CS với liều dùng

800 mg/ngày trong 3 tháng với liệu trình 2 đợt một năm có tác dụng giảm đau và cải thiện chức năng rõ rệt ở bệnh nhân bị viêm khớp

Các nghiên cứu duợc lý tại châu Âu trong khoảng 10 năm gần đây cho thấy CS đuợc sử dụng điều trị cho bệnh nhân đã không có một phản ứng phụ nào nghiêm trọng xảy ra

CS đuợc dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt, mỏi mắt, thoái hoá võng mạc Hiện nay, tại Việt Nam Công ty TNHH ROHTO-MENTHOLATUM đã sản xuất thuốc nhỏ mắt New V.Rohto có chứa CS chữa các bệnh: mỏi mắt, xung huyết kết mạc, bệnh mắt do tia cực tím hay các tia sáng khác, nhìn mờ do tiết dịch, mắt ngứa, viêm mi…

- Các bệnh khác:

CS của sụn cá mập đuợc một số công trình nghiên cứu ghi nhận có chứa chất

“ức chế sự hình thành các vi mao mạch tân sinh” (angiogenesis) của khối u ung thư, ngăn các tế bào ung thư không sinh sản và tăng trưởng CS kết hợp với mitomycin C

có thể ức chế các tế bào ung thu cổ truớng sarcoma 180

Sụn cá mập cũng có khả năng tăng cuờng hệ miễn dịch nên giúp giảm nhẹ các chứng thấp khớp, đau nhức xương, vẩy nến, chàm…

Nhiều nghiên cứu cho thấy CS có khả năng tăng cuờng kháng viêm ức chế sự tiết các cytokine tiền viêm TNF-a, interleukin-1ß nitric oxid và các gốc oxy hóa tự

do

Những công dụng của CS đã và đang góp phần lớn cho ngành y học và nhiều lĩnh vực khác Do đó, việc nghiên cứu để thu nhận và ứng dụng CS trong thực tế là một điều hết sức cần thiết hiện nay

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÁ MẬP [6], [14]

1.3.1 Giới thiệu về cá mập

Cá mập thuộc lớp cá sụn (Chondrichthyes) cùng Bộ cá đuối, cá kiếm Thân hình

thủy động học dễ dàng rẽ nước, có từ 5 đến 7 khe mang dọc mỗi bên hoặc ở gần đầu Khe đầu tiên sau mắt gọi là lỗ thở, da có nhiều gai nhỏ bao bọc cơ thể chống lại các

ký sinh trùng

Với một thân hình không nhỏ, lẽ ra chúng phải có một khung xương chắc khỏe, tuy nhiên loài cá này lại không hề có xương Bộ khung nâng đỡ cơ thể được kết bằng chất sụn Trong suốt cuộc đời mình, cá mập có thể thay răng nhiều lần: có 3000 chiếc răng xếp bên trong bộ hàm khỏe và ngay khi một chiếc răng bị rụng đi khi cắn phải vật cứng thì sẽ có chiếc khác thay thế chỉ trong vòng 24 tiếng Chúng có thói quen đớp mồi và nuốt chửng thay vì xé, nhai và nhấm nháp con mồi

Cá mập thuộc loài ít di chuyển và được xem là kình ngư cừ nhất đại dương, có thể bơi với vận tốc 46km/h, trong khi con người chỉ có thể đạt vận tốc 4km Nhìn xa,

cá mập không có vảy, nhưng thực chất bộ da của chúng được phủ rất nhiều vảy nhỏ rất nhám

Cá mập có khứu giác hoàn hảo và thị giác khá tốt cộng thêm khả năng cảm nhận điện trường của động vật đã ấn định cho cá mập ngôi vị vua biển cả Với giác quan này, một con cá mập có thể xác định mùi máu, hay nước tiểu của con mồi ở xa hàng

km

Có hơn 440 loài cá mập dựa theo hình thái sinh học được liệt kê dưới đây theo mối quan hệ tiến hóa của chúng từ thời cổ xưa đến hiện đại Được chia thành 8 nhóm Quần thể cá mập rất không đồng nhất và được đại diện bởi một loạt các loài, chúng có sự khác biệt rõ rệt trong những thói quen và sinh học, đặc biệt trong sự phát triển và sinh sản Chúng sinh sống ở các môi trường khác nhau, rộng từ đáy đại dương biển nước ngọt sông, hồ, vùng cửa sông ven biển và đầm phá, từ vùng biển Bắc Cực

để làm ấm các vùng nhiệt đới Cá mập khác nhau rất nhiều về kích thước bao gồm

các loài có kích cỡ chỉ bằng bàn tay, như Euprotomicrus bispinatus là một loài cá

sống dưới đáy biển chỉ dài 22 xentimet, đến cá mập voi khổng lồ (Rhincodon typus),

loài cá lớn nhất với chiều dài 12 mét Hình thức sinh sản cá mập cũng rất khác nhau giữa các loài, có loài đẻ trứng, mang thai và một số tạo phôi Cá mập đẻ trứng nhưng hầu hết các trứng được nuôi dưỡng trong cơ thể mẹ cho tới khi nở

Hình 1.3 Phân loại cá mập

1.3.2 Tình hình khai thác cá mập hiện nay

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tuấn Long và Võ Sĩ Tuấn – Viện Hải Dương học Nha Trang vào năm 2012 đã báo cáo rằng:

Có khoảng 530 phương tiện đang tham gia khai thác cá nhám/mập tại 6 tỉnh ven biển từ Quảng Ngãi đến Bình Tuận, nhiều nhất là là Bình Thuận 181 chiếc, Bình Định 140 chiếc, Khánh Hòa 98 chiếc, Phú yên 74 chiếc, Quãng Ngãi 32 chiếc và Ninh Thuận 5 chiếc

Nhìn chung, nghề khai thác cá nhám/mập tương đối đa dạng gồm câu cá mập, câu cá ngừ đại dương, lưới cản (lưới rê tầng mặt), lưới ba màng, lưới vây và lặn Trong đó, nghề câu cá mập có số lượng phương tiện khai thác nhiều nhất 187 chiếc

và khu vực khai thác khá rộng từ bờ ra khơi, cao nhất là Bình Định có 80 chiếc (chủ yếu tại Nhơn Lý, Tân Phụng và Tam Quan Bắc), Bình Thuận 70 chiếc (ở La Gi, Phú Quý và Liên Hương), Quãng Ngãi 27 chiếc, Phổ An và Phú Yến 12 chiếc

Hoạt động khai thác cá nhám/mập của 6 tỉnh ven biển từ Quảng Ngãi đếm Bình Thuận diễn ra tại nhiều khu vực khác nhau tùy từng loại nghề, trong đó tập trung tại

3 khu vực chính là vùng ven bờ (từ bờ ra đến 24 hải lý) số lượng phương tiện khai thác rất ít 12 chiếc, ở tuyến lộng từ 6 – 24 hải lý và tuyến khơi Có khoảng 13 loài cá nhám/mập được ngư dân khai thác, hầu hết các loài đều bắt gặp vùng tuyến khơi

Một số loài khai thác phổ biến gồm cá nhám đuôi dài (Alopias pelagicus), cá nhám

đá (Carcharhinus albimarginatus), cá mập da trơn (Carcharhinus falciformis), cá mập thâm (Carcharhinus limbatus), cá mập sọc trắng (Carcharhinus

amblyrhynchoides)…

Năng suất khai thác nghề câu cá mập là cao nhất (trung bình: 0.53 tấn/ghe/tháng), trong đó tuyến khơi có năng suất khai thác cao gấp 2 lần (0.80 tấn/ghe/tháng) so với tuyến bờ (0.45 tấn/ghe/tháng) Mùa vụ khai thác hầu hết của các loại nghề không khác nhiều và chủ yếu tập trung từ tháng 2 – 10 Ở tuyến bờ mùa vụ khai thác tập trung vào tháng 2 – 8, trong khi đó hoạt động ở tuyến khơi kéo dài từ 2 – 10 tháng Tháng 5 – 7 là tháng khai thác tập trung và năng suất cao nhất Hiện nay, ở Việt Nam nguồn nguyên liệu CS được nhập từ nước ngoài nên giá thành còn rất cao và các công trình nghiên cứu thu nhận CS vẫn chưa được phổ biến

Vì thế việc nghiên cứu tách chiết từ các loài sụn động vật là điều hết sức cần thiết và

ý nghĩa trong việc giảm giá thành của CS

1.4.1 Phân loại và đặc điểm của protease

Nhóm enzyme proteaza xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptit (-CO – NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin

 Phân loại protease có thể căn cứ vào các tiêu chí:

+ Căn cứ vào cơ chất phản ứng của enzyme tham gia

+ Căn cứ vào pH tối thích cho hoạt động của enzyme như protease acid, protease

kiềm và protease trung tính

+ Nguồn thu nhận enzyme protease chủ yếu từ 3 nguồn cơ bản:

 Enzyme được tách từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột của nội tạng của một số động vật thủy sản (mực, cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin,

cathepsin

 Từ thực vật có thể thu được papain (từ đu đủ), bromelain (từ thân, lá, vỏ

dứa)

 Vi sinh vật là một nguồn rất phong phú để thu enzyme, thường từ các loài

Aspergillus, Bacillus, Clostridium, Streptomyces và một số loài nấm men

+ Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme gồm: endopeptidase (endopeptit hydrolase,

hay proteinase) và exopeptidase (peptidase), amino peptidase, cacboxyl peptidase,

+ Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit

+ Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch

 Theo Barret và Donald (1956), Protease được phân chia thành 2 nhóm lớn

là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase

+ Nhóm 1: Endopeptidase là enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch

polypeptide Dựa vào động học của cơ chất xúc tác, endopeptidase được chia thành

4 phân nhóm:

- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những proteinase chứa nhóm –OH của

gốc serin trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của các enzyme Nhóm này gồm các enzyme như: trypsin, chymotrypsin

- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt động

của nó chứa nhóm thiol (-SH) của acidamin xistein Nhóm này gồm các enzyme cathepxin

- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease trong trung tâm hoạt

động của nó có các nhóm cacboxyl (-COOH) của aspactic như enzyme pepsin

- Phân nhóm 4: Protease – kim loại Đây là những protease trong trung tâm

hoạt động của nó có ion kim loại và hoạt động trong môi trường trung tính

+ Nhóm 2: Exopeptidase hay peptidase Các enzyme thuộc nhóm này gồm:

Cacboxylpeptidase, amino peptidase, dipeptidase Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptit ngoài cùng của chuỗi polypeptit hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acidamin ra khỏi chuỗi polypeptit

Trong các nguồn thu nhận enzyme thì vi sinh vật là nguồn thích hợp cho việc sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp vì có những ưu điểm sau:

- Có thể chủ động trong quá trình sản xuất

- Chu kỳ phát triển của vi sinh vật ngắn do đó có thể sản xuất enzyme từ vi

sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 – 60h

- Có thể định hướng việc tổng hợp enzyme ở vi sinh vật theo hướng sản xuất

chọn lọc enzyme với số lượng lớn

- Giá thành chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thấp hơn so với các nguồn khác vì

môi trường nuôi cấy nuôi cấy tương đối đơn giản, rẻ tiền

Do những ưu điểm này mà ngày nay việc nghiên cứu ứng dụng enzyme trong đời sống này mang nhiều ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn hơn

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Tốc độ thủy phân bằng enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố, cụ thể là:

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Khi nồng độ enzyme thấp, lượng cơ chất

lớn, vận tốc thủy phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng đến một giá trị giới hạn v = vmax thì nếu nồng độ enzyme tiếp tục tăng, tốc độ thủy phân bởi enzyme tăng không đáng kể và thậm chí không tăng

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn tới tốc

độ phản ứng thủy phân, khi tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng thủy phân càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng thủy phân đạt tới giới hạn v=vmax, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng thủy phân hầu như không tăng

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Enzyme là protein có hoạt tính xúc tác nên kém bền

với nhiệt, chúng chỉ có hoạt tính trong khoảng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ làm chúng biến tính Trong khoảng nhiệt độ đó, khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng thủy phân tăng Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng thủy phân do enzyme xúc tác được đặc trưng bằng hệ số:

50oC Nhiệt độ làm cho enzyme mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, và nhiệt độ tới hạn của enzyme khoảng 700C, vói các enzyme bền nhiệt (bromelin, papain…), nhiệt

dộ tới hạn cao hơn

Ảnh hưởng của pH: pH có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme vì

pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và đến độ bền của protein enzyme Đa số enzyme có khoảng pH thích hợp từ 5 – 9, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzyme

Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: Thời gian thủy phân cần thích hợp để

enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân nhằm đảm bảo hiệu suất thủy phân cao, chất lượng sản phẩm tốt Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng sản phẩm thủy phân Thời gian thủy phân dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào loại enzyme, nồng độ cơ chất, pH, nhiệt độ, sự có mặt của các chất hoạt hóa, ức chế… Trong thực tế, thời gian thỷ phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thỷ phân cụ thể

Ảnh hưởng của lượng nước: Nước vừa là môi trường để phân tán enzyme và

cơ chất lại, vừa trực tiếp tham gia phản ứng nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc

độ, chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: Chất hoạt hóa là những chất khi có mặt trong

phản ứng có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme, các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ Tuy nhiên, các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ cho phé, hoạt độ enzyme sẽ giảm

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Chất kìm hãm (hay chất ức chế) là những

chất vô cơ hay hữu cơ mà khi có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính Với mỗi enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm khác nhau, vì vậy khi sử dụng enzyme ta phải biết rõ các chất kìm hãm để điều chỉnh phản ứng

1.4.3 Ứng dụng của protease

Từ xưa, con nguời đã biết sử dụng enzyme vào thực tiễn và các ứng dụng này chỉ mang tính tự phát chưa có cơ sở khoa học Ở nuớc ta, việc nghiên cứu và sử dụng protease đã đuợc bắt đầu từ những năm 60 và cũng thu đuợc một số thành tựu đáng

kể, tạo nhiều chế phẩm có ý nghĩa thực tiễn lớn như: thuốc, thực phẩm (sản xuất nuớc mắm ngắn ngày, bột làm mềm thịt, bột dinh duỡng cao cấp), chế biến sữa, dệt may, thức ăn cho chăn nuôi và thuỷ sản, xử lý môi truờng

Trong công nghiệp: Nguời ta dùng protease bổ sung vào xà phòng, chất tẩy

rửa để nâng cao tính năng tẩy rửa các loại dầu mỡ và chất bẩn hay có thể dùng protease để khử lông trâu bò trong công nghệ thuộc da

Trong công nghệ dược phẩm và y học: Protease được sử dụng để sản xuất các

loại thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein, dùng để phân giải các cục protein trong

cơ thể, chữa bệnh nghẽn tim mạch, tiêu mũ các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp

Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm:

- Các enzyme amylase thường được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thực

phẩm và đã mang lại chất lượng hiệu quả cao

- Sử dụng enzyme amylase trong sản xuất maltose sử dụng trong công nghệ

sản xuất bia, nước giải khất, sản xuất bánh kẹo

- Nếu đưa vào bột nhào 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase thì chất lượng bánh

mì tăng cao, bánh xốp hơn, ngọt hơn và màu sắc đẹp hơn

- Sử dụng enzyme amylase để sản xuất glucose từ tinh bột thay cho phương

pháp dùng acid clohidric kém hiệu quả

- Sử dụng protease thu nhận từ quả dứa, đu đủ, nội tạng để làm mềm thịt, làm

tăng hương vị của sản phẩm sau khi chế biến Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến câc sản phẩm có giá trị gia tăng

- Sử dụng protease để sản xuất bột đạm thủy phân từ các nguyên liệu giàu

protein

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHONDROITIN SULPHAT [1], [12], [13]

Một số đề tài nghiên cứu sử dụng chondroitin sulphat:

Năm 2006, S.C Shin, S.J You, B.K An và C W Kang – Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên động vật, Cao đẳng chăn nuôi – Hàn Quốc đã công bố kết quả công trình nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất mucopolysaccharide-protein có chứa Chondroitin sulphat từ sụn gà” Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu của việc chiết xuất bằng phương pháp đun nóng là ở 1000C trong 120 phút với sản lượng 40.09% và hàm lượng CS của sụn là 28.46% Đối với alcalase, điều kiện tối ưu 2% alcalase trong 120 phút thì năng suất thủy phân là 75.87% và hàm lượng CS là 26,61% Việc sử dụng enzyme để chiết xuất CS có năng suất cao hơn so với đun nóng Đồng thời, kết luận rằng trong sụn gà có chứa một lượng chondroitin sulphat đáng kể

Năm 2014, đề tài nghiên cứu sản xuất Chondroitin sulphat từ khí quản vịt của Vittayanont, M and Jaroenviriyapap, T – Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Đại học Prince of Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan Tiến hành nghiên cứu xử lý khí quản vịt bằng kiềm (NaOH 0.01 – 0.5M, ở 40C trong khoảng 1 – 6h), enzyme (alcalase 0.1 – 0.5%, ở 550C, pH = 8, 1 – 6h) và đun nóng (1 – 120 phút) Các mẫu được đun nóng được thủy phân bằng papain ở điều kiện 0.0625 – 1% trong 1 – 10h Kết quả nghiên cứu cho thấy 80% CS được chiết xuất ở điều kiện 0.025% papain trong 10h Các hydrolysate đông khô từ khí quản sụn chứa 10.6% CS thu được 39% sau khi kết tủa protein

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách chiết CS từ các nguồn

nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn cá mập, sụn của cá mực, sụn gà, sụn

bò…Cho đến nay, tại Việt Nam vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ và chưa phổ biến

Hàm luợng CS được thu nhận khác nhau từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau, tuy nhiên chúng biến động trong khoảng 10.0 – 28.3%, phần lớn chứa các loại CS4 và CS6

Phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron thần kinh, còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên Vì vậy, CS được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

 Enzyme neutrase: Neutrase là một protease có nguồn gốc từ vi khuẩn

B.amyloliquefaciens Neutrase do hãng Novozyme – Đan Mạch cung cấp Neutrase

dạng bột có đặc tính: hoạt độ 5000UI/g, nhiệt độ thích hợp 40 – 600C, pH thích hợp

5.5 – 7.5

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa học

+ Xác định độ ẩm: Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến trọng

lượng không đổi ở nhiệt độ 1050C theo TCVN 3700 – 1990

+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số: Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng

phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705 – 1990

+ Xác định hàm lượng khoáng: Xác định hàm lượng khoáng của sụn cá mập

Hoạt độ enzyme của chế phẩm được biểu diễn bằng “Đơn vị hoạt độ proteolytic”.Một đơn vị hoạt độ proteolytic (PU) là lượng enzyme mà trong một phút

ở 300C có khả năng thủy phân protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic cho phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau tương ứng với một µmol tyrosine

Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ proteolytic trên 1mg protein của chế phẩm (số PU/mg protein)

b Hóa chất và thiết bị

Dung dịch casein 2%: Hòa tan 2g casein vào 90 ml đệm Britton và Robinson

pH 7.2 Nếu pH dung dịch thấp hơn 7.2 thì dùng NaOH 1N để điều chỉnh, dẫn đệm đến 100ml

Thuốc thử Folin – Ciocalteau được pha loãng bằng nước cất theo tỷ lệ 1/5 trước khi sử dụng Dung dịch chuẩn tyrosine 1µmol/ml, Na2CO3 0.4M, acid tricloacetic 0.4M

Máy so màu, thiết bị ủ nhiệt

c Cách tiến hành

Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống đối chứng

dịch enzyme protease đã đạt tới 300C giữ đúng 10 phút ở 300C sau đó cho ngay vào 5ml dung dịch acid tricloacetic 0.4M lắc đều và giữ 30 phút ở 300C Lọc và lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau như sau: lấy một ống nghiệm sạch, thêm vào 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M lắc đều và cho thêm 1ml thuốc thử Folin đã được pha loãng 5 lần lắc đều, giữ 20 –

30 phút ở nhiệt độ phòng

Ống đối chứng: sau khi cho 1ml dung dịch enzyme cho ngay vào 5ml dung

dịch acid tricloacetic 0.4M rồi cho vào 1ml dung dịch cơ chất Các bước tiếp theo tiến hành giống như ống nghiệm Sau đó so màu trên máy quang điện kế với kính lọc màu đỏ ở bước sóng 660nm

d Tính kết quả

Lấy hiệu số mật độ quang đọc trên thiết máy của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng và mẫu đối chứng Dựa vào đồ thì chuẩn tyrosine tính lượng tyrosine tương ứng

Hoạt độ protease tính bằng công thức:

𝑃𝑈/𝑚𝑙 =µmol/ml x 7

10Trong đó:

7: Tỷ lệ thể tích của hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme (1ml dung dịch

cơ chất cộng 1 ml dung dịch enzyme cộng 5ml dương dịch caid tricloacteic)

10: Thời gian thủy phân cơ chất (phút)

2.2.3 Định lượng Chondroitin sulfate theo phương pháp sử dụng xanh methylen

a Nguyên tắc

Xanh methylen là một loại thuốc nhuộm cation khi tương tác với chondroitin sulphat sẽ làm giảm độ hấp thụ của xanh methylen Việc giảm sự hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sulphat có trong dung dịch Sự thay đổi độ hấp thụ là do

CS đã tương tác với phân tử màu xanh methylen

b Cách tiến hành

Chuẩn bị hóa chất:

- Pha xanh methylen: Cân chính xác 15 mg xanh methylen, hòa tan trong 75

ml nước cất và định mức lên 100 ml trong bình định mức 100 ml lắc đều trong 5 phút Sau đó, chuyển 25 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến 100 ml Thu được dịch xanh methylene có nồng độ 37.5 µg/ml

- Chuẩn bị dung dịch CS chuẩn: Cân chính xác 100 mg CS chuẩn 92.42%, hòa

tan trong nước cất và định mức lên 100 ml Sau đó, chuyển 5 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml định mức lên 100 ml và lắc đều Thu được dịch CS chuẩn có nồng

đo ở bước sóng 664nm

c Tính kết quả

Công thức tính hàm lượng CS khảo nghiệm:

𝐶𝑆 = 𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑡

𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑠𝑡× 𝐺𝑡× 𝑃 Trong đó:

- 𝑂𝐷𝑏: Độ hấp thụ của mẫu trống

- 𝑂𝐷𝑡: Độ hấp thụ của mẫu kiểm tra hàm lượng CS

- 𝑂𝐷𝑠𝑡: Độ hấp thụ của mẫu CS chuẩn

- 𝐺𝑡: Khối lượng CS chuẩn sử dụng (mg)

- P: Phần trăm độ tinh khiết của chondroitin sulphat tiêu chuẩn (92.42%)

- CS: Hàm lượng CS trong mẫu (mg/10g mẫu)

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.4.1 Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat từ sụn cá mập

 Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat

Quá trình tham khảo tài liệu, đề tài dự kiến qui trình thu nhận Chondroitin sulfate từ sụn cá mập được trình bày ở hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập

Chế phẩm CS thô

 Thuyết minh quy trình

+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang Sau khi

thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn Sụn cá mập sau khi thu nhận được tách bỏ thịt, làm khô để sử dụng làm nguyên liệu thủy phân thu CS Trước khi thủy phân, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với tốc

độ 25000 vòng/phút trong thời gian 30 phút

+ Thủy phân: Sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân các mối liên kết peptit

để giải phóng CS Vì CS thường gắn với protein bằng liên kết o – glycosid tạo thành phức proteoglycan

+ Bất hoạt enzyme: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme

bằng cách đun nóng ở 900C trong thời gian 15 phút

+ Ly tâm: Loại bỏ phần bã, ly tâm 6000 v/phút để thu dịch thủy phân

+ Kết tủa protein hòa tan: Sử dụng TCA để kết tủa hoàn toàn protein hòa

tan trong dung dịch

+ Ly tâm: Tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa protein hòa tan trong dung dịch

và thu dịch chứa CS

+ Kết tủa CS thô: CS không hòa tan trong ethanol nên sử dụng ethanol để

tủa CS Sau đó, tiến hành ly tâm để thu chế phẩm CS

+ Sấy khô: Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS đem đi sấy lạnh để thu

được CS thô

2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý sụn cá mập

Từ tham khảo các nghiên cứu trước đây, đồ án thử nghiệm xử lý sụn cá theo quy trình trình bày ở hình 2.3

 Thuyết minh quy trình

+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang Sau khi thu

mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn