Enzym protease là chất xúc tác sinh học, có bản chất là protein, loại enzym này chỉ xúc tác cho quá trình thủy phân mà cơ chất chính là protein.Là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử protein tạo thành các polypeptide, các peptide ngắn mạch và acid amin.
Các protease chiếm vị trí then chốt về chức năng sinh lý trong cơ thể sống đồng thời có tiềm năng ứng dụng thương mại rất lớn, chiếm khoảng 60% thị phần enzym công nghiệp toàn cầu [3]. Nguồn nguyên liệu để thu protease rất đa dạng và phong phú bao gồm các cơ thể thực vật, động vật và vi sinh vật.
Nhiều protease thực vật như Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); Phycin từ nhựa cây cọ (Ficus carica); Keratinase thuỷ phân tóc và len... đã được nghiên cứu và thu nhận. Papain và Bromelin là những enzym thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực (dược phẩm, mỹ phẩm, chế biến thực phẩm...). Việc sản xuất protease thực vật bị hạn chế vì phụ thuộc vào các yếu tố như diện tích và điều kiện khí hậu để trồng nguyên liệu, hơn nữa quy trình thu nhận enzym tốn nhiều thời gian.
Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã được nghiên cứu nhiều như trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày... Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu để thu các enzym này cũng bị hạn chế vì phụ thuộc nhiều vào sự phát triển của ngành chăn nuôi.
Khối lượng protease thực vật và động vật thu được không có khả năng đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thực tiễn cho nên các protease từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virut...) đang được quan tâm đặc biệt. Riêng protease vi khuẩn chiếm trên 40% thị phần enzym toàn cầu. Đặc điểm ưu việt là chúng có tất cả các đặc tính cần thiết cho các ứng dụng về công nghệ sinh học, nguồn nguyên liệu lại vô cùng lớn, đa dạng và phong phú, hơn nữa quy trình thu nhận lại ít tốn kém về thời gian và chi phí, hạ được giá thành.... Trong phạm vi đề tài này chỉ đề cập tới nhóm protease của vi khuẩn là những vi sinh vật sản sinh nhiều loại protease ngoại bào đang được
ứng dụng rộng rãi trong công nghệ dược phẩm, dệt may, tẩy rửa, thực phẩm và xử lý phế thải.
Đa số các protease thương mại từ vi khuẩn chủ yếu thuộc loại enzym trung tính và kiềm được sản suất từ chi (giống) Bacillus. Các protease vi khuẩn trung tính hoạt động trong dải pH hẹp (pH 5-8) và nhiệt độ tương đối thấp, chúng làm giảm vị đắng (so với protease động vật) cho các sản phẩm thuỷ phân protein, có ái lực cao với các amino acid kỵ nước nên nó được ưa chuộng cho công nghệ chế biến thực phẩm và sữa. Một số protease trung tính thuộc protease chứa kim loại nên đòi hỏi các ion kim loại hoá trị 2 cho hoạt động của chúng. [4].
1.5.2 Emzym neutrase
• Nguồn:
Emzym neutrase là một protease được sản xuất từ vi khuẩn bởi một chủng Bacillus amyloliquefaciens chọn lọc. Nó sẽ phá vỡ các liên kết peptide để thủy phân protein.
• Cách dùng:
Neutrase thường sử dụng để nâng cao chất lượng sản phẩm protein từ động vật và thực vật. Tuy nhiên, chúng ta dùng để làm biến tính protein để chuẩn bị chiết xuất DNA từ tế bào thực vật và động vật.
• Hoạt tính :
Giống như tên gọi của nó, Neutrase là một protease trung tính và hoạt động tối ưu của nó khoảng từ pH 5,5-7,5 và nhiệt độ trong khoảng 45-55°C.
Neutrase là một metallo- proteinase, cần các ion kẽm cho hoạt động của nó. Do đó, neutrase sẽ đạt được sự ổn định khi có mặt của ion canxi và ức chế bởi EDTA. Sự ổn định của Neutrase ở một nhiệt độ nhất định bị ảnh hưởng bởi các loại và nồng độ của protein. Neutrase có thể bị bất hoạt, ví dụ như xử lý nhiệt, 2 phút ở 85°C.
• Bảo quản:
Nếu được lưu trữ ở 3-5 °C thì Neutrase sẽ giữ được hoạt tính trong ít nhất một năm.
1.5.3 Sự thủy phân protein bằng enzym
Quá trình thủy phân protein:
Protein polypeptide peptite acid amine
Quá trình thủy phân bắt đầu thực hiện khi ở một đều kiện thích hợp (nhiệt độ, ph,…) nhất định, enzym chuyển từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động, tiến hành cắt đứt các liên kết peptite trong cơ chất. Ban đầu sản phẩm tạo thành là polypeptide sau một thời gian thủy phân sẽ hình thành các peptite ngắn hơn và một số acid amine. Thời gian thủy phân càng dài thì quá trình thủy phân càng triệt để hơn đồng nghĩa với hàm lượng acid amine càng nhiều.[5]
1.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân
Trong quá trình thủy phân có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym cụ thể như sau:
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: bản chất của enzym là protein nên nhiệt độ ảnh
hưởng rất lớn đến quá trình thủy phân. Nếu nhiệt độ quá cao trên 700C sẽ làm cho
enzym bị biến tính không thuận nghịch dẫn đến mất khả năng xúc tác, quá trình thủy phân diễn ra chậm hoặc bị ngừng trệ. Đối với nhiệt độ thấp enzym bị biến tính thuận nghịch nên quá trình thủy phân sẽ diễn ra rất chậm, không đạt hiệu quả cao. Hầu hết các enzym điều hoạt động ở 45-550C và bị bất hoạt ở nhiệt độ trên 700C (ngoại trừ papain (có trong đu đủ), bromelin (có trong dứa) ). Nhiệt độ tối thích của một enzym không phải là một hằng số mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác: nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, PH môitrường các chất kích hoạt,…[4]
- Ảnh hưởng của PH môi trường: PH cho biết [OH-] và [H+]; PH ảnh hưởng
đến khả năng ion hóa của enzym và cơ chất nếu giá trị PH là tối thích thì tại đó enzym và cơ chất đạt trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng đễ dàng kết hợp với nhau và làm cho vận tốt phản ứng sảy ra cao nhất. Đa số enzym hoạt động trong vùng PH lân cận 7 (môi trường PH yếu, bazo yếu), ngoại trừ một số enzym pepsin trong dạ dày (PH=1,2-2,5); trysin trong ruột non (PH gần bằng 9) [4].
- Ảnh hưởng của nồng độ enym: nồng độ enzym ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân. Khi nồng độ enzym thấp và lượng cơ chất lớn thì tốc độ enzym phụ thuộc tuyến tình vào nồng độ enzym (nồng độ enzym tăng, tốc độ phản ứng tăng). Khi nồng độ enzym cao thì quá trình thủy phân sẽ sảy ra nhanh chóng nhưng khi tốc độ
phản ứng tăng đến một giá trị V=Vmax , việc tăng thêm nồng độ enzym thì tốc độ
thủy phân rất chậm hoặc không tăng [4]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản
ứng càng tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt giá trị V=Vmax , nếu tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng hầu như không tăng [4].
- Ảnh hưởng của chất kìm hãm hay chất ức chế: là chất làm cho enzym giảm
khả năng xúc tác, có khi vô hoạt. Các chất này cấu tạo tương tự như cơ chất nhưng enzym không nhận, enzym kết hợp với chất đó. Kết quả chất lạ chiếm chổ của cơ chất chính nên không tạo ra sản phẩm. Vì mỗi loại enzym xúc tác cho một cơ chất riêng nên chúng có chất kìm hãm khác nhau [4].
- Ảnh hưởng của chất hoạt hóa: là những chất khi thêm vào sẽ làm tăng khả
năng hoạt tính của enzym, các chất này có bản chất là ion kim loại kiềm (Na+, K+, Li+), kiềm thổ (Ca+, Mg+, Ba+), hay một vài anion (Cl- , I-, Br- ) chúng làm cầu nối giữa enzym với cơ chất làm tăng diện tích tiếp xúc giữa enzym và cơ chất, vận tốc phản ứng tăng, nhưng các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng trong giới hạn nồng độ xác định khi dùng quá nồng độ cho phép hoạt độ enzym sẽ giảm [4].
- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân: tùy thuộc vào từng loại enzym xúc tác
khác nhau mà có thời gian thủy phân tối thích khác nhau. Thời gian thủy phân là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thời gian càng dài thì quá trình thủy phân diễn ra triệt để hơn do enzym cắt mạch trong cơ chất nhiều hơn.[4].
- Ảnh hưởng của hàm lượng nước: nước là môi trường để hòa tan enzym và
cơ chất để phản ứng xảy ra nhanh hơn và đồng thời cũng trực tiếp tham gia vào quá trình phản ứng thủy phân [4].
1.6 PHÂN TÍCH ĐÁNH GIÁ NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐÃ CÓ, NHỮNG VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU GIẢI QUYẾT
1.6.1 Các kết quả nghiên cứu đã có và những hạn chế của nó
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tách chiết CS từ một số nguồn nguyên liệu tự nhiên bằng các phương pháp hóa học NaOH, HCl…hoặc chế phẩm Ezym protease.
Các nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được nhiều phương pháp định lượng chondroitin Sulfate. Phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp quang phổ. Dựa trên nguyên tắc cấu tạo của chondroitin sulfate là liên kết giữa D- galactosamin and D-glucuronic acid có một vài nghiên cứu nước ngoài đã định lượng CS qua việc định lượng D-glucuronic acid (sử dụng nhiệt, acid để làm đứt liên kết) tính ra số mol D-glucuronic acid và suy ra được khối lượng của CS. Tuy nhiên việc xác định khối lượng CS qua số mol còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như việc thay đổi liên tục của gốc R dẫn đến khó xác định được chính xác khối lượng phân tử của D-galactosamin. Cùng với việc sử dụng nhiều acid đậm đặc hóa chất khó tìm là hạn chế của phương pháp.Nhiều nghiên cứu khác xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu DMMB (1,9-dimethylmethylene blue) khi nó gắn với CS. Bên cạnh đó cũng có một vài công trình nghiên cứu trong nước thủy phân sụn cá tách chiết CS bằng công nghệ sinh học sử dụng chế phẩm từ enzym protease cũng đã tách chiết được CS trong sụn cá đuối vá cá nhám tuy nhiên quá trình thủy phân kéo dài tốn nhiều thời gian.
Như vậy để tách chiết CS thì có thể sử dụng: hóa chất NaOH, HCl, enzym.Vấn đề là nếu dùng hóa chất thì tốc độ phản ứng nhanh hiệu suất thu hồi cao tuy nhiên làm ảnh hưởng đến chất lượng CS nếu dùng NaOH làm mất gốc Sulfate 6, nếu dùng HCl thì làm mất gốc Sulfate 4 còn sử dụng các chế phẩm Enzym như các đề tài nghiên cứu trước tốn rất nhiều thời gian và hiệu suất thủy phân thấp. Cũng như việc định lượng CSphương pháp của các đề tài nghiên cứu trước còn rất phức tạp đòi hỏi công nghệ cao và tốn kém
1.6.2 Những vấn đề cần nghiên cứu giải quyết, tính mới của đề tài
- Không sử dụng phương pháp hóa học để tách chiết chodroitin sulfate.
- Nghiên cứu thủy phân tách chiết CS bằng công nghệ sinh học trên đối tượng
sụn cá đuối. Sử dụng nguyên liệu sụn cá đuối dễ tìm, giá thành thấp và là phế liệu của các nhà máy chế biến.
- Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn cá đuối bằng
enzym neutrase (nhiệt độ thích hợp, pH, tỉ lệ enzym, thời gian thủy phân)
- Ứng dụng các thông số đã tối ưu trên đề xuất quy trình sản xuất CS thô.
- Chọn phương pháp định lượng CS đơn giản, có độ chính xác cao, có tính khả thi trong việc tiến hành thí nghiệm với hóa chất dễ tìm không độc hại. Xác định hàm lượng CS theo sự thay đổi quang phổ hấp thụ của chất màu MB (methylene blue) khi nó gắn với CS, đo độ hấp thụ của dung dịch màu ở bước sóng 664nm trên máy quang phổ [12].
Vì phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharid ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS: tổng hợp được một số CS tetrasaccharid, có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron trong khi đó disaccharid không có tác dụng trên. Vì vậy, các CS chủ yếu được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
Đều đáng chú y là các loài cá sụn (chondrichthyes) như cá mập, cá đuối, cá nhám là những loài động vật có xương sống nhưng bộ xương chứa hoàn toàn sụn cả khi ở tuổi trưởng thành. Đây là nguồn nguyên liệu dễ kiếm và có chứa thành phần CS. Cho đến nay, tại Việt Nam còn ít công trình nghiên cứu tách chiết CS từ sụn cá đuối và cá nhám.
Và hiện nay hầu hết các chế phẩm CS có bán trên thị trường được sản xuất từ sụn cá mập là chủ yếu, một phần từ sụn bò, sụn gà... nên giá thành cao. Ở Việt Nam, nguồn nguyên liệu CS là nhập từ nước ngoài giá thành lại càng cao và cũng chưa có nhiều công trình nghiên cứu thu nhận CS. Vì thế việc nghiên cứu tách chiết CS từ sụn các loại cá đuối có trong nước ta là điều rất cần thiết để thay thế nguồn nguyên liệu đắt tiền là vi sụn cá mập.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU