2.2.1. Phương pháp phân tíchhóa học 2.2.1.1. Xác định hàm ẩm
Áp dụng phương pháp sấy khô đến sản phẩm không đổi ở nhiệt độ 105oCtheo
Độ ẩm của chế phẩm CS được tính theo công thức: 100 ) ( )] ( ) [( % × − + + − + = c t c s c t c m m m m m m m A Trong đó:
mc: khối lượng chén sau khi đã sấy ở nhiệt độ 105 °C , tính bằng (g); mt: khối lượng của mẫu trước khi sấy, tính bằng (g);
ms: khối lượng của mẫu sau khi sấy, tính bằng (g).
2.2.1.2.Xác định hàm lượng tro
a)Nguyên lý: dùng sức nóng (550-6000C)nung cháy toàn phần chất hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần trong thực phẩm.
b)Dụng cụ, hóa chất
- Chén nung bằng sứ
- Đèn cồn hay bếp điện
- Lò nung điều chình được nhiệt độ
- Cân phân tích
- Bình hút ẩm,
- H2O2 10 thể tích, hoặc HNO3 đậm đặc.
c)Cách tiến hành
- B1: nung chén đã rửa sạch ở lò nung đến khối lượng không đổi để nguội ở
bình hút ẩm cân ở cân phân tích chính xác đến 10-4g) G
- B2: Cân chính xác khoảng từ 1-5g chất thử cân tất cả ở cân phân tích với độ
chính xác như trên G1
- B3: hóa tro đen trên biếp điện.
- B4: chuyển vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ đến 550-6000C nung thành tro
trắng khoảng 6-7 giờ
- B5: nung tới khối lượng không đổi cân G2
d)Kết quả
G G G G X − − = 1 2 (%) Trong đó: 1
G : khối lượng chén nung và mẫu (g)
2
G : khối lượng chén nung và tro trắng
G: khối lượng chén nung
2.2.1.3.Xác định hàm lượng protein theo phương pháp kejdahl
a)Tài liệu tham khảo:xác định Nito tổng số theo phương pháp kejdahl
b) Nguyên tắc
Vô cơ hóa mẫu bằng axit sunfuric đậm đặc với sự có mặt của chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4.5H2O) để chuyển hóa nito trong các chất hữu cơ về dạng (NH4)2SO4 rồi dùng kiềm mạnh (NaOH) để đẩy NH3 ra. Khí NH3 được hấp thụ vào dung dịch axit boric dư. Sau đó chuẩn độ dung dịch tạo ra bằng dung dịch chuẩn H2SO4 với chỉ thị hỗn hợp Tashiro (methyl đỏ + methyl xanh) đến lúc dung dịch chuyển từ màu lục sang tím.
c) Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
- Thiết bị: hệ thống phá mẫu và chưng cất bán tự động Kjeldahl
- Dụng cụ Buret 25ml Ống đong 1000ml Bình định mức 25ml, 1000ml Erlen 100ml - Hóa chất Nước cất 1 lít H2SO4 đậm đặc
Hỗn hợp xúc tác (K2SO4và CuSO4.5H2O), NaOH, H3BO3 Methyl đỏ và methyl xanh
Ethanol 95%
- Pha hóa chất
Xúc tác hỗn hợp gồm K2SO4và CuSO4.5H2O được cân theo tỉ lệ 5:1 trộn đều. NaOH 40%: hòa tan 400g NaOH trong nước và định mức lên thành 1lit. H3BO3 4%: hòa tan 40g H3BO3 trong nước và định mức thành 1lit. Ethanol 95%: 950ml ethanol trong nước và định mức thành 1000ml.
Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05 mol (0,1N): pha ống chuẩn H2SO4 (0,1N) và đinh mức thành 1lit.
d) Tiến hành
Vô cơ hóa mẫu
- Lấy 10ml mẫu cho vào ống kjeldahl có dung tích phù hợp (thường 250ml)
- Thêm 0,9 – 1,2 g chất xúc tác K2SO4và CuSO4.5H2O
- Thêm 10ml H2SO4 đậm đặc và đặt ống kjeldahl vào bộ phá mẫu
- Cài đặt nhiệt độ và thời gian cho máy. Tổng thời gian vô cơ hóa từ 3 – 4h
- Sau khi phá mẫu hoàn tất chất lỏng trong bình trong và có màu xanh da trời
nhạt. Để nguội, nếu thấy quá trình vô cơ hóa xuất hiện cặn rắn thì cho một ít nước cất vào rồi lắc đều.
Chưng cất
- Đem mẫu đi chưng cất. Cài đặt thông số cho máy như sau:
H2O: 2s H3BO3: 3s NaOH: 5s
- Thời gian chưng cất: 5 phút
- Nhỏ 3 giọt chỉ thị Tashiro vào bình hấp thu và tiến hành chưng cất mẫu.
Chuẩn độ
- Chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,05 mol (0,1N), ghi nhận điểm cuối khi
dung dịch chuyển từ màu xanh dương sang màu tím. Đọc và ghi thể tích H2SO4 tiêu
tốn trên buret
e)Tính toán kết quả
14.01 1000
Trong đó
V0: Thể tích của mẫu thử (ml)
V1: Thể tích dung dịch tiêu chuẩn H2SO4 đã dùng để chuẩn độ (ml)
V2: Thể tích dung dịch tiêu chuẩn H2SO4 đã dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml)
C: Nồng độ chính xác của dung dịch H2SO4 đã dùng để chuẩn độ (N)
14.01: Khối lượng nguyên tử tương đối của nitơ.
2.2.1.4.Xác định hoạt độ enzym neutrase theo phương pháp Anson cải tiến
• Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Cho enzym tác dụng với cơ chất casein, sau đó kết tủa protein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym trong điều kiện chuẩn, sau 1 phút phân giải protein
tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương ứng với 1µmol tyrosine [45].
• Hoá chất
Thuốc thử folin pha loãng 5 lần, Na2CO36%; TCA 5%; Casein 1% trong đệm
phosphate 0,01M, pH 7,0 • Tiến hành
- Phản ứng enzym: Lấy 0,5ml enzym, giữ 10–15phút ở 30oC, thêm 1ml dung
dịch casein 1% (đã đạt 30oC), lắc đều, giữ ở 30oC đúng 10phút. Sau đó cho ngay 2,5ml TCA vào, lắc đều và để lắng 30phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10phút để thu dịch trong suốt có chứa sản phẩm hoà tan của phản ứng enzym. Hàm lượng của sản phẩm trong dung dịch lọc được xác định bằng phản ứng màu.
- Phản ứng màu: Lấy 0,5ml dịch sau phản ứng enzym cho vào ống nghiệm,
thêm 2ml Na2CO3 6%, lắc đều, thêm 0,5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắc đều. Sau 30phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 750nm.
khác nhau 0,1-1 µmol/ml trong HCl 0,2N. Lấy 0,5ml từ mỗi nồng độ làm phản ứng màu như trên. Đo mật độ quang học của các ống. Dựng đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosine. Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượng µmol tyrosine tương ứng. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzym ở điều kiện tiêu chuẩn
30oC, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sản phẩm hoà tan trong TCA tương
ứng với 1 micromol tyrosin.
Bảng 2.1 Bảng nồng độ xác định đường chuẩn tyrosin
Hoạt độ phân giải protein của 1 ml dịch enzym được xác định như sau:
t k a X .4. = Trong đó:
X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzyme 4: Thể tích của hỗn hợp phản ứng và TCA
a: Số µmol tyrosine tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của ống thí nghiệm và ống kiểm tra
k: Độ pha loãng dung dịch enzyme. t: Thời gian phản ứng (10 phút).
2.2.1.5.Định lượng Chondroitin sulfate bằng phương pháp quang phổ phức xanh methylene
a)Nguyên lý cơ bản của phương pháp
Dựa trên sự thay đổi trong quang phổ hấp thụ của methylene blue khi tác dụng với glycosaminoglycan sulfate tại bước sóng 664nm. Phương pháp so màu methylene blue này rất nhạy có thể định tính và định lượng CS với khối lượng rất
Nồng độ tyrosine (µmol/ml)
0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
nhỏ (µg). Methylene xanh là một loại thuốc nhuộm cation mà tương tác với chondroitin sulfate và làm giảm hấp thụ của xanh methylen tại bước sóng 664nm. Việc giảm sự hấp thụ ở 664 nm là tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sulate, cung cấp một cơ sở cho việc xác định việc định lượng của chondroitin sulate bằngxanh methylene [12].
Với việc bổ sung các nồng độ ngày càng tăng của chondroitin sulfate, có giảm hấp thụ của methylene xanh tại 664 nm. Kết quả cho thấy độ hấp thụ có sự thay đổi chỉ ra rằng chondroitin sulfate đã tương tác với phân tử xanh methylen. Bởi vì có hai điện tích âm trong từng đơn vị trùng hợp phân tử disaccharide của chondroitin sulfate tươngtác với cation của thuốc nnhuộm xanh methylene, lực tĩnh điện là động lực tham gia tương tác. Các phân tử thuốc nhuộm đã được liên kết với chondroitin sulfate bởi một lực tĩnh điện. Điều này được thể hiện qua cách xếp mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue [13] được thể hiện ở hình.2.1
Hình 2.1 Mô hình liên kết phức tạp giữa chondroitin sulfate - methylene blue
Chuẩn độ quang phổ được thực hiện bằng cách đo độ hấp thụ ở 664 nm . Độ hấp thụ được đo tương đối với nước. Các giá trị độ hấp thụ thực tế đã thu được bằng độ hấp thụ của dung dịch methylene trừ đi độ hấp thụ tương ứng của chondroitin sulfate trong dung dịch xanh methylen.
b) Vật liệu và hóa chất
- Dung dịch thuốc thử methylene blue pha sẵn
c)Tiến hành
- Thuốc màu xanh methylene : cân 15mg xanh methylene cho 75ml nước cất
vào hòa tandịch, rồi cho vào bình định mức 100ml định mức lên 100ml lắc đều trong 5 phút, tiếp tục pha loãng hút 25ml cho vào bình định mức 100 ml định mức bằng nước cất lên đến vạch định mức.
- Dịch CS chuẩn: cân 100mg CS chuẩn hòa tan cho vào bình định mức
100ml. dùng pipet hút 5ml tiếp tục cho vào bình định mức 100ml định mức bằng nước cất lên đến vạch lắc đều trong 5 phút rồi cho ra cốc.
- Dịch thủy phân (mẫu test): pha loãng hút 5ml dịch thủy phân cho vào bình
định mức 100ml định mức bằng nước cất lên đến vạch định mức lắc đều trong 5 phút.
- Lấy 3 bình định mức 50ml đánh dấu theo thứ tự mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra
và mẫu trắng. Cho vào mỗi bình chính xác 10ml dung dịch xanh methylen đã được chuẩn bị ở trên. Dùng pipet lấy 2ml dịch tiêu chuẩn cho vào bình định mức tiêu chuẩn, 2ml dịch thử cho vào bình định mức thử nghiện và 2ml nước cất vào bình định mức mẫu trắng. Sử dụng nước cất định mức cho mỗi bình lên đến vạch định mức 50ml, nghịch đảo bình trong vòng 5 phút. Cho ra ống nghiệm lắc trong vòng 30 phút. Tiến hành đi đo độ hấp thụ của mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử nghiệm ở bước sóng 664nm. Các giá trị độ hấp thụ thực tế đã thu được bằng độ hấp thụ của dung dịch methylene trừ đi độ hấp thụ tương ứng của chondroitin sulfate trong dung dịch xanh methylen.
- Công thức tính lượng sulfate chondroitin (tính cho giá trị khảo nghiệm của
CS mg/ 10g mẫu)
Trong đó:
Blank
A : độ hấp thụ của xanh methylen (mẫu trắng)
Test
.
Std
A : độ hấp thụ của sulfate chondroitin trong mẫu chuẩn.
WtStd : Trọng lượng của chondroitin sulfate chuẩn (mg ) Wt.Test: Trọng lượng của mẫu (mg) thử nghiệm
P = Phần trăm độ tinh khiết của chondroitin sulfatechuẩn(92,42%)
WAvekhối lượng trung bình của mẫu thử (mg)
2.2.1.6.Nghiên cứu tỉ lệ ethanol tủa CS
Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Ethanol ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của protein và làm protein kết tủa. Tuy nhiên phụ thuộc vào nồng độ ethanol mà có thể thu được hàm lượng CS cao nhất. Từ dịch chứa CS sau thủy phân, sử dụng các nồng độ ethanol khác nhau để khảo sát sự thu hồi CS hiệu quả nhất
Tiến hành: lấy 5 cốc cho vào mỗi cốc 10ml dung dịch thủy phân. Tiến hành thử nghiệm với các tỉ lệ cồn: 50%; 100%; 200%; 300%; 400% so với 10ml dịch thủy phân, xác định hàm lượng CS thu được trong dịch sau thủy phân lần lược ở các nồng độ trên. Có thể quan sát bằng mắt và kiểm chứng lại bằng cách sấy cân xác định khối lượng. Tìm ra tỉ lệ cồn cho hiệu quả thu hồi CS cao nhất.
2.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu
Từ tham khảo các nghiên cứu của các tác giả trước đây, cùng với quá trình khảo sát thực nghiệm. Em dự kiến đưa ra quá trình nghiên cứu tổng quát. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu thể hiện đẩy đủ tất cả nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2 . Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu Bất hoạt enzym Ly tâm thu dịch Xử lý Kết tủa protein Ly tâm Chế phẩm CS thô Cá đuối Tách thịt Sụn cá đuối Đồng nhất mẫu Xử lý nhiệt (1h) Phân tích Độ ẩm Hàm lượng tro Nitơ tổng số Ly tâm Nồng độ cồn
Thời gian tủa Dịch chứa CS
Thủy phân bằng enzym Neutrase Xác định hoạt độ E neutrase Tìm các thông số thích hợp pH Nồng độ E Nhiệt độ Thời gian Nồng độ nước
Giải thích sơ đồ
a) Cá đuối
Cá được thu thập từ vùng biển Nha Trang tại cảng cá Vĩnh Lương, xã Vĩnh Lương Khánh Hòa.
b)Tách thịt
Đầu tiên cần tách hoàn toàn thịt cá ra khỏi sụn để loại bỏ lượng protein của thịt cá bám trên sun. Tiến hành gia nhiệt tách thịt.
c)Sụn cá đuối
Sụn sau khi đã tách hoàn toàn thịt cá đem đi xay nhuyễn đồng nhất mẫu. Việc xay nhuyễn không những đồng nhất mẫu cho tiến hành thí nghiệm mà còn làm tăng diện tích túc xúc giữa enzym và cơ chất trong quá trình thủy phân.
Tiến hành: vì sụn khó xay nhuyễn em bổ sung nước vào tiến hành xay bằng máy xay cho đến khi mẫu sụn nhuyễn đồng nhất.
d)Xử lý nhiệt mẫu.
Xử lý nhiệt cho mẫu sụn trước khi thủy phân mục đích là để làm mền sụn bẻ gảy liên kết giải phóng Ca2+, protein không tan. Xử lý ở nhiệt độ cao trước còngiúp cho dịch chứa protein gắn với CS dễ bị thủy phân bởi enzyme, do các liên kết peptit lộ ra nhiều nên dễ bị enzym tấn công. Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân giải phóng CS.
Em tiến hành đun mẫu trong 1giờ, ở 1000C lọc tách Ca2+ , protein không tan,
và một số tạp chất không tan khác. Để nguội mẫu xuống nhiệt độ phòng.
e)Thuỷ phân
Sụn cá sau khi được nghiền nhỏ sử dụng enzyme neutraseđể thuỷ phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một proteoglycan.
f) Bất hoạt enzym
Kết thúc quá trình thủy phân bất hoạt enzym ở 900C trong 10 phút.
g)Ly tâm, thu dịch
chứa CS và cả protein tan, protein dư do chưa thủy phân hết.
h) Kết tủa protein
Quá trình thủy phân đã giải phóng ra CS, protein và một phần nhỏ protein dư do chưa thủy phân hết. Em sử dụng TCA ở nồng độ 7% tạo kết tủa không thuận nghịch để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch.
Tiến hành: thu dịch sau ly tâm đem đi tủa TCA ở 40C để qua đêm
i) Ly tâm
Dịch sau khi tủa protein đem ly tâm 6000v/phút trong 15 phút để thu dịch chứa chondroitin sulfate.
j) Kết tủa CS
Sử dụng cồn 960 ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được sau khi đã
tủa TCA. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Cồn ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của polysacharid và làm CS kết tủa. Sau đó tiếp tục ly tâm để thu tủa chứa CS.
k) Sấy thu CS thô
Tiến hành sấy để loại nước thu chế phẩm thô. Sử dụng tủ sấy có bộ phận cấp
nhiệt và quạt gió. Sấy lạnh ở 400C trong 8 giờ, cân xác định đến khối lượng không
đổi. Sấy ở nhiệt độ thấp vì sợ ảnh hưởng đến chất lượng của CS. Tốt nhất nên tiến
hành sấy phun ở 400C để thu CS dạng bột.
2.2.2.2 Bố trí xác định các thông số của quy trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym Neutrase
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzym bổ sung