2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu
Từ tham khảo các nghiên cứu của các tác giả trước đây, cùng với quá trình khảo sát thực nghiệm. Em dự kiến đưa ra quá trình nghiên cứu tổng quát. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu thể hiện đẩy đủ tất cả nội dung nghiên cứu cụ thể của đề tài được trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2 . Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình nghiên cứu Bất hoạt enzym Ly tâm thu dịch Xử lý Kết tủa protein Ly tâm Chế phẩm CS thô Cá đuối Tách thịt Sụn cá đuối Đồng nhất mẫu Xử lý nhiệt (1h) Phân tích Độ ẩm Hàm lượng tro Nitơ tổng số Ly tâm Nồng độ cồn
Thời gian tủa Dịch chứa CS
Thủy phân bằng enzym Neutrase Xác định hoạt độ E neutrase Tìm các thông số thích hợp pH Nồng độ E Nhiệt độ Thời gian Nồng độ nước
Giải thích sơ đồ
a) Cá đuối
Cá được thu thập từ vùng biển Nha Trang tại cảng cá Vĩnh Lương, xã Vĩnh Lương Khánh Hòa.
b)Tách thịt
Đầu tiên cần tách hoàn toàn thịt cá ra khỏi sụn để loại bỏ lượng protein của thịt cá bám trên sun. Tiến hành gia nhiệt tách thịt.
c)Sụn cá đuối
Sụn sau khi đã tách hoàn toàn thịt cá đem đi xay nhuyễn đồng nhất mẫu. Việc xay nhuyễn không những đồng nhất mẫu cho tiến hành thí nghiệm mà còn làm tăng diện tích túc xúc giữa enzym và cơ chất trong quá trình thủy phân.
Tiến hành: vì sụn khó xay nhuyễn em bổ sung nước vào tiến hành xay bằng máy xay cho đến khi mẫu sụn nhuyễn đồng nhất.
d)Xử lý nhiệt mẫu.
Xử lý nhiệt cho mẫu sụn trước khi thủy phân mục đích là để làm mền sụn bẻ gảy liên kết giải phóng Ca2+, protein không tan. Xử lý ở nhiệt độ cao trước còngiúp cho dịch chứa protein gắn với CS dễ bị thủy phân bởi enzyme, do các liên kết peptit lộ ra nhiều nên dễ bị enzym tấn công. Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân giải phóng CS.
Em tiến hành đun mẫu trong 1giờ, ở 1000C lọc tách Ca2+ , protein không tan,
và một số tạp chất không tan khác. Để nguội mẫu xuống nhiệt độ phòng.
e)Thuỷ phân
Sụn cá sau khi được nghiền nhỏ sử dụng enzyme neutraseđể thuỷ phân các mối liên kết peptit để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một proteoglycan.
f) Bất hoạt enzym
Kết thúc quá trình thủy phân bất hoạt enzym ở 900C trong 10 phút.
g)Ly tâm, thu dịch
chứa CS và cả protein tan, protein dư do chưa thủy phân hết.
h) Kết tủa protein
Quá trình thủy phân đã giải phóng ra CS, protein và một phần nhỏ protein dư do chưa thủy phân hết. Em sử dụng TCA ở nồng độ 7% tạo kết tủa không thuận nghịch để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch.
Tiến hành: thu dịch sau ly tâm đem đi tủa TCA ở 40C để qua đêm
i) Ly tâm
Dịch sau khi tủa protein đem ly tâm 6000v/phút trong 15 phút để thu dịch chứa chondroitin sulfate.
j) Kết tủa CS
Sử dụng cồn 960 ở 40C trong 24 giờ để tủa dịch CS vừa thu được sau khi đã
tủa TCA. Ethanol là dung môi hữu cơ thường được sử dụng tủa protein và polysacharid. Cồn ở nồng độ cao háo nước làm mất lớp vỏ hydrat của polysacharid và làm CS kết tủa. Sau đó tiếp tục ly tâm để thu tủa chứa CS.
k) Sấy thu CS thô
Tiến hành sấy để loại nước thu chế phẩm thô. Sử dụng tủ sấy có bộ phận cấp
nhiệt và quạt gió. Sấy lạnh ở 400C trong 8 giờ, cân xác định đến khối lượng không
đổi. Sấy ở nhiệt độ thấp vì sợ ảnh hưởng đến chất lượng của CS. Tốt nhất nên tiến
hành sấy phun ở 400C để thu CS dạng bột.
2.2.2.2 Bố trí xác định các thông số của quy trình thủy phân sụn cá đuối bằng enzym Neutrase
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ enzym bổ sung Mục đích:
Để đánh giá sự ảnh hưởng của nồng độ enzym đến khả năng thủy phân protein giải phóng CS và tìm ra được nồng độ thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều nồng độ enzym khác nhau. Theo các nghiên cứu trước sử dụng nồng độ enzym hiệu quả nhất từ 0,1- 0,3%. Nên em bố trí thí nghiệm theo hình 2.1
Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm:
Nồng độ enzym ảnh hưởng đến tốc độ thủy phân. Khi nồng độ enzym cao thì quá trình thủy phân sẽ sảy ra nhanh chóng nhưng khi tốc độ phản ứng tăng đến một
giá trị V=Vmax , việc tăng thêm nồng độ enzym thì tốc độ thủy phân rất chậm hoặc
không tăng. Nên việc nghiên cứu tìm ra nồng độ enzym thích hợp nhất cho quá trình thủy phân là rất cần thiết.
Cách tiến hành:
Với cùng một điều kiện giống nhau pH =7, tỉ lệ nước 500%/10g sụn , nhiệt độ
450C trong 2h, chỉ thay đổi tỉ lệ enzym trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15
thí nghiệm với 5 tỉ lệ nồng độ enzym từ 0-0,4%(tính theo 10g sụn) mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, em tiến hành đo OD bằng máy đo quang UV-vis xác định nồng độ enzym tối ưu cho hoạt động của enzym neutrase trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối.
Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều
kiệnở 450 C trong 2h, pH nguyên liệu, với các nồng độ enzym khác nhau, sau đó bất
hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn nồng độ enzymcho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất.
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ enzym bổ sung pH: 7, tỉ lệ nước 500%, Nhiệt độ: 450C, Thời gian 2h 0,04g/10g
Thủy phân bằng Neutrase với tỉ lệ enzym khác nhau
0g 0,01g/10g 0,02g/10g 0,03g/10g
Vô hoạt enzym Sụn cá đuối Kết tủa protein Dịch CS Ly tâm Đánh giá Chọn tỉ lệ enzym
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân Mục đích:
để đánh giá sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein giải phóng CS và tìm ra được nhiệt thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.2
Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm:
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym. Hoạt tính enzym sẽ mạnh nhất khi hoạt động tại vùng nhiệt độ tối thích và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ này. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông số nhiệt độ thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết.
Cách tiến hành:
Với cùng một điều kiện giống nhau: nồng độ enzym tối thích, pH tối thích, tỉ lệ nước 500%/g sụn, trong 2h, chỉ thay đổi nhiệt độ trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị nhiệt độ từ 50-600Cmỗi nồng độ lăp lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối.
Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu trong 2h, nồng độ enzym tối ưu với 5 giá trị nhiệt độ khác nhau, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chon nhiệt độ tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất.
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ thích hợp
600C
400C 450C 500C 550C
Vô hoạt enzym Sụn cá đuối Kết tủa protein Dịch CS Ly tâm Đánh giá Chọn nhiệt độ thích hợp Tỉ lệ enzym thích hợp, pH: 7, tỉ lệ nước 500%/10g sụn, thời gian 2h
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nước thủy phân Mục đích:
Để đánh giá sự ảnh hưởng của tỉ lệ nước đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được tỉ lệ nước thích hợp cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều tỉ lệ nước khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.3
Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm:
Nước là môi trường để hòa tan enzym và cơ chất để phản ứng xảy ra nhanh hơn và đồng thời cũng trực tiếp tham gia vào quá trình phản ứng thủy phân. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông số tỉ lệ nước thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết.
Cách tiến hành:
Với cùng một điều kiện giống nhau: nồng độ enzym, nhiệt độ thích hợp, pH: 7, trong 2 giờ, chỉ thay đổi tỉ lệ nước trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 tỉ lệ nước khác nhau 400%, 500%, 600%, 700%, 800% mỗi giá trị lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định tỉ lệ nước tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối.
Lấy 5 mẫu 10g sụn, bổ sung lần lược 40ml, 50ml, 60ml, 70ml, 80ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu, nồng độ enzym tối ưu, nhiệt độ tối ưu, thời gian tối ưu, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn tỉ lệ nước tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất.
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỉ lệ nước thích hợp
80ml
Thủy phân bằng Neutrase với tỉ lệ nước khác nhau
40ml 50ml 60ml 70ml
Vô hoạt enzym Sụn cá đuối Kết tủa protein Dịch CS Ly tâm Đánh giá Chọn tỉ lệ nước thích hợp Tỉ lệ enzym thích hợp , nhiệt độ thích hợp, thời gian 2h, pH: 7
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân Mục đích:
Để đánh giá sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được thời gian tối thích cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều thời gian khác nhau. Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.3
Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm:
Thời gian thủy phân là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng lớn đến quá trình thủy phân thời gian càng dài thì quá trình thủy phân diễn ra triệt để hơn do enzym cắt mạch trong cơ chất nhiều hơn. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông s thời gian thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết.
Cách tiến hành:
Với cùng một điều kiện giống nhau: pH tối thích, nồng độ enzym tối thích, nhiệt độ tối thích, tỉ lệ nước 500%, chỉ thay đổi thời gian trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị thời gian từ 2-6hmỗi giá trị lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, tôi tiến hành xác định thời gian tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối.
Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều kiện ở pH tối ưu, nồng độ enzym tối ưu, nhiệt độ tối ưu trong 2h với 5 giá trị nhiệt độ khác nhau, sau đó bất hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chọn thời gian tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất.
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn thời gian thích hợp
6h
Thủy phân bằng Neutrase với thời gian khác nhau
2h 3h 4h 5h
Vô hoạt enzym Sụn cá đuối Kết tủa protein Dịch CS Ly tâm Đánh giá Chọn thời gian thích hợp Tỉ lệ enzym thích hợp, pH: 7, nhiệt độ thích hợp, tỉ lệ nước thích hợp
Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân Mục đích:
Để đánh giá sự ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy protein giải phóng CS và tìm ra được pH tối thích cho hoạt động của enzym neutrase cần tiến hàng thí nghiệm thủy phân định lượng CS với nhiều tỉ lệ pH khác nhau nằm trong khoảng điều kiện hoạt động tối ưu pH: 5.5-7.5 . Thí nghiệm được bố trí như sơ đồ hình 2.1
Cơ sở khoa học bố trí thí nghiệm:
PH ảnh hưởng đến khả năng ion hóa của enzym và cơ chất nếu giá trị PH là tối thích thì tại đó enzym và cơ chất đạt trạng thái ion hóa tốt nhất, chúng đễ dàng kết hợp với nhau và làm cho vận tốt phản ứng sảy ra cao nhất. Nên việc nghiên cứu tìm ra thông s thời gian thích hợp trong quá trình thủy phân là rất cần thiết.
Cách tiến hành:
Với cùng một điều kiện giống nhau:nồng độ enzym tối thích,nhiệt độ 450C, tỉ
lệ nước 1:5 trong 2h, chỉ thay đổi pH của dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0) trong phản ứng thủy phân. Em tiến hành 15 thí nghiệm với 5 giá trị pH khác nhau 6; 6,5; 7; 7,5; 8mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Dựa vào phương pháp so màu MB, em tiến hành xác định pH tối ưu cho hoạt động của enzym trong quá trình thủy phân xương sụn cá đuối.
Lấy 10g sụn, bổ sung 50ml H2O nước cất đun cách thủy trong một tiếng trên bếp điện để nguội xuống nhiệt độ phòng. Tiến hành thủy phân trong cùng điều
kiệnở 450 C trong 2h,nồng độ enzym tối ưu với 5 giá trị pH khác nhau,sau 2h đi bất
hoạt enzym, ly tâm thu dịch sau thủy phân. Lấy dịch đi so màu MB bằng máy quang phổ UV- Vis định lượng độ hấp thụ CS trong dịch test để chon pH tối ưu cho ra hiệu quả thủy phân giải phóng CS cao nhất.
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp.
8
Thủy phân bằng Neutrase với pH khác nhau
6 6,5 7 7,5
Vô hoạt enzym Sụn cá đuối Kết tủa protein Dịch CS Ly tâm Đánh giá Chọn pH thích hợp Tỉ lệ enzym, nhiệt độ, tỉ lệ nước, thời gian thích hợp.