Bài giảng phản ứng huyết thanh chẩn đoán

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN Người soạn : PGS,TS Võ Thị Chi Mai MỤC TIÊU Sau khi học xong, sinh viên có khả năng : 1/ Trình bày các tính chất của phản ứng kháng nguyên – kháng thể. 2/ Nêu nguyên tắc,phương pháp,kết quả của từng phản ứng. 3/ Nhận định được ý nghĩakết quả phản ứng. I. ĐẶC ĐIỂM CỦA PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ (KN-KT) Các đặc điểm của phản ứng huyết thanh: Đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể - Tỉ lệ thành phần tham gia – Động lực KT biểu thị bằng hiệu giá kháng thể. II. PHÂN LOẠI PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ II.1. CÁC PHẢN ỨNG DỰA TRÊN SỰ TẠO THÀNH HẠT II.1.1. Phản ứng kết tủa (precipitation): kháng nguyên hòa tan. II.1.2. Phản ứng ngưng kết (agglutination): kháng nguyên hữu hình. II.2. CÁC PHẢN ỨNG DỰA TRÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA KHÁNG THỂ II.2.1. Phản ứng kết hợp bổ thể (complement binding reaction) II.2.2. Phản ứng trung hòa (neutralization) II.3. CÁC PHẢN ỨNG DÙNG KHÁNG NGUYÊN HOẶC KHÁNG THỂ ĐÁNH DẤU II.3.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence, IFA): kháng nguyên hữu hình. II.3.2. Phản ứng miễn dịch men (enzyme immunoassay,EIA) II.3.3. Phản ứng miễn dịch phóng xạ (radio-immunoassay,RIA) II.3.4. Thử nghiệm western blot (dấu thấm miễn dịch). III. CÁC PHẢN ỨNG TẠO HẠT III.1. PHẢN ỨNG KẾT TỦA Đây là phản ứng với kháng nguyên hòa tan.Có thể tiến hành trên môi trường lỏng hoặc môi trường gel. Độ nhạy không cao. III.1.1. Phản ứng vòng (ring test) III.1.2. Kết tủa ở môi trường gel:Kháng nguyên và kháng thể khuếch tán trong gel, khi gặp nhau thể hiện bằng đường kết tủa. - Phản ứng khuếch tán kép (double diffusion): phản ứng Ouchterlony, định tính. Khuếch tán vòng (radial immunodiffusion): phản ứng Mancini, định lượng. Cung kết tủa: phản ứng đồng nhất- phản ứng không đồng nhất - phản ứng đồng nhất một phần. - Miễn dịch điện di (immunoelectrophoresis). 1 III.2. PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT Trong phản ứng này, kháng nguyên ở dạng hữu hình (vi khuẩn, hồng cầu, tế bào) hoặc bao bọc một hạt chất dẻo ở bên trong. Nhanh chóng sau vài phút. Độ nhạy cao hơn phản ứng kết tủa. III.2.1. Ngưng kết trực tiếp III.2.2. Ngưng kết hồng cầu gián tiếp(indirect hemagglutination) III.2.3. Ngăn ngưng kết hồng cầu (hemagglutination inhibition). Ví dụ: phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) trong chẩn đoán và nghiên cứu virus cúm, virus Dengue,.. IV. CÁC PHẢN ỨNG DỰA TRÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA KT IV.1. Phản ứng cố định bổ thể (complement fixation test, CFT): gây ly giải hồng cầu do kháng thể chống hồng cầu. IV.2. Phản ứng trung hòa độc lực, độc tố V. CÁC PHẢN ỨNG ĐÁNH DẤU KHÁNG NGUYÊN HOẶC KHÁNG THỂ V.1. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG (immunofluorescence, IF) Chất đánh dấu là thuốc nhuộm huỳnh quang như fluorescein hay rhodamin, phát màu xanh– vàng hay đỏ-cam dưới ánh sáng cực tím trong kính hiển vi huỳnh quang. Ap dụng cho các kháng nguyên hữu hình để xác định kháng nguyên bề mặt. V.1.1.Trực tiếp: phát hiện kháng nguyên (hoặc kháng thể) nhờ các kháng thể (hoặc kháng nguyên) đặc hiệu có đánh dấu chất huỳnh quang. V.1.2.Gián tiếp:nhạy cảm hơn. Định tính và định lượng. - kháng nguyên (hoặc kháng thể) được cho kết hợp đặc hiệu với kháng thể (hoặc kháng nguyên) tương ứng. - tiếp đó phức hợp KN-KT này được phát hiện nhờ hệ thống kháng kháng thể đánh dấu đặc hiệu với kháng thể trong phức hợp. Kháng kháng thể phản ứng được với IgG của các loài. V.2. MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ(radio immunoassay,RIA) Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3, Cacbon 14, I 125 ... đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể.. Phương pháp đồng vị phóng xạ không những có thể khu trú vị trí KN-KT một cách chính xác mà còn làm tăng độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.Ngưỡng phát hiện thấp nhất của RIA ở mức 0,1 nanogram/mL. Dùng RIA để định lượng các chất có rất ít trong dịch sinh học như hormon, thuốc trong huyết thanh, -globulin, IgE toàn phần, vitamin,… V.3.MIỄN DỊCH MEN ( enzyme immunoassay, EIA) Chất đánh dấu phosphatase kiềm hay peroxydase làm thay đổi màu của một cơ chất (substrate) tương ứng. Quan sát phản ứng cơ chất bằng mắt thường (định tính) hoặc đo bằng quang phổ kế (định lượng). Trong miễn dịch men đã có nhiều kỹ thuật được sử dụng phổ biến, ví dụ như kỹ thuật ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Nguyên lý ELISA: Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên (kháng thể)tương ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với kháng thể (kháng nguyên) tác động lên cơ chất đặc hiệu.Thử nghiệm rất nhạy, và khả năng ứng dụng tương tự như RIA nhưng 2 không đòi hỏi thiết bị đặc biệt hoặc chất phóng xạ nên ELISA có xu hướng thay thế dần RIA. ELISA có các dạng: trực tiếp, gián tiếp, sandwich, cạnh tranh. V.4. PHƯƠNG PHÁP THẤM MIỄN DỊCH (immuno-blotting):western blot Tiến hành kỹ thuật qua ba giai đoạn: (1) Điện di trong gel acrylamid (PAGE = polyacrylamid gel electrophoresis) để tách rời các protein có trọng lượng phân tử khác nhau. (2) Di chuyển bằng điện qua một tờ nitrocellulose. (3) Làm hiện hình phản ứng kháng nguyên - kháng thể bằng miễn dịch men hoặc miễn dịch phóng xạ (trực tiếp hoặc gián tiếp). V.5.KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Nguyên lý: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu. VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ CÁC PHẢN ỨNG HUYẾT THANH VI.1. Kết quả định tính Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét nghiệm có hay không có kháng thể hoặc kháng nguyên. Thông thường kết quả các phản ứng được ký hiệu bằng các mức độ dương tính (1+, 2+, 3+) , không rõ dương tính hay âm tính (+/-), âm tính (-). Các ký hiệu này tuy có tiêu chuẩn quy định nhưng phụ thuộc vào chủ quan của người đọc kết quả. VI.2. Kết quả định lượng Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm trùng qua việc xác định kháng thể trong huyết thanh được gọi là chẩn đoán huyết thanh học. Kết quả định lượng trong chẩn đoán huyết thanh cho biết hiệu giá kháng thể. Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay thấp được đánh giá qua hiệu giá kháng thể. Thông thường kháng thể người bệnh được pha loãng dần theo cấp sô 2. Đậm độ huyết thanh thấp nhất cho kết quả dương tính đó là hiệu giá. Các phản ứng định lượng cần thiết để theo dõi động lực kháng thể của các huyết thanh kép thường lấy cách nhau 7 ngày. Động lực kháng thể là đại lượng đặc trưng cho mức độ thay đổi hiệu giá kháng thể theo thời gian. Hiệu giá kháng thể tăng lên 4 lần mới có giá trị chẩn đoán. VI.3. Ranh giới hiệu giá Là ranh giới giữa hiệu giá kháng thể bình thường và hiệu giá bệnh lý. Liên cầu thường cư trú ở hầu hết mọi người nên trong huyết thanh của hầu hết mọi người đều có kháng thể kháng streptolysin O (ASO). Vì thế người ta xem 1/200 (200 đơn vị /mL), là hiệu giá ranh giới. Chỉ khi nào trong huyết thanh có 400 đơn vị/mL trở lên mới là bệnh lý. VI.4. Hiện tượng dương tính giả – âm tính giả Gặp lúc làm phản ứng huyết thanh học do vấn đề kỹ thuật và trong một vài trạng thái sinh lý bệnh của người bệnh. Dương tính giảlà kết quả phản ứng biểu hiện dương tính nhưng trong mẫu thử không có kháng nguyên hoặc kháng thể cần tìm. Âm tính giảlà kết quả phản ứng biểu hiện âm tính nhưng trong mẫu thử có kháng nguyên hoặc 3 kháng thể cần tìm Để khắc phục hiện tượng dương tính giả, âm tính giả phải chuẩn độ các thành phần tham gia phản ứng, đảm bảo đúng các điều kiện của phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ, thời gian ủ...) và phải luôn luôn có chứng dương, chứng âm. VI.5. Giá trị một phản ứng kháng nguyên – kháng thể - Độ nhạy cảm (sensitivity) là tỉ lệ test dương tính trong một bệnh nào đó. Một test có độ nhạy cảm cao sẽ ít có kết quả âm tính giả. - Độ đặc hiệu (specificity) là tỉ lệ test âm tính trong những người không mắc bệnh ấy. Một test có độ đặc hiệu cao sẽ ít có kết quả dương tính giả. - Giá trị tiên đoán dương là tỉ lệ có bệnh thực sự trong số test dương tính. - Giá trị tiên đoán âmlà tỉ lệ những người thực sự không có bệnh trong số test âm tính. 4  ... định lượng Chẩn đoán gián tiếp bệnh nhiễm trùng qua việc xác định kháng thể huyết gọi chẩn đoán huyết học Kết định lượng chẩn đoán huyết cho biết hiệu giá kháng thể Nồng độ kháng thể huyết cao... (hemagglutination inhibition) Ví dụ: phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) chẩn đoán nghiên cứu virus cúm, virus Dengue, IV CÁC PHẢN ỨNG DỰA TRÊN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA KT IV.1 Phản ứng cố định bổ thể (complement... phải chuẩn độ thành phần tham gia phản ứng, đảm bảo điều kiện phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ, thời gian ủ ) phải luôn có chứng dương, chứng âm VI.5 Giá trị phản ứng kháng nguyên – kháng thể -