PHẢN ỨNG HUYẾT THANH ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và bệnh nhiễm

PHẢN ỨNG HUYẾT THANH ứng dụng miễn dịch chẩn đoán vi sinh và bệnh nhiễm Võ Thị Chi Mai Đáp ứng miễn dịch Mục tiêu • Trình bày các tính chất của phản ứng KN-KT. • Nêu nguyên tắc, phương pháp, kết quả từng loại phản ứng. • Nhận định ý nghĩa kết quả phản ứng Cơ quan miễn dịch Chẩn đoán huyết thanh học • Nhận biết kháng nguyên hoặc kháng thể • Lượng giá kháng nguyên hoặc kháng thể Loại kháng nguyên – Kháng nguyên hòa tan = kết tủa • Không kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp – Kháng nguyên hữu hình = ngưng kết • Kết cụm nếu không có kháng thể kết hợp Loại kháng thể – Kháng thể đa dòng • Hỗn hợp tế bào B • Xác định nhiều epitope • Có thể phản ứng chéo với KN khác – Kháng thể đơn dòng • Từ 1 clone tế bào B • Đặc hiệu cho từng epitope • Ít nhạy cảm hơn KT đa dòng Phản ứng kết tủa Kết tủa trên thạch (Ouchterlony) • Ưu điểm – Rẻ – Đơn giản (“Có” / “Không” – Không cần KN tinh chế • Nhược điểm – – – – Ít nhạy. Không định lượng Tốn thời gian (24-48 giờ) Cần nhiều huyết thanh (0,5 mL/test) Có thể khó đọc kết quả Kết tủa trên thạch Control antibody Test Antibody Antigen Kết tủa vòng Mancini Khuếch tán vòng đơn Pha KT trong thạch Cho KN vào giếng Kết tủa dạng vòng Càng nhiều KN, vòng kết tủa càng lớn Diameter (mm) Thử nghiệm định lượng Test Standard Curve mg antibody / mL Phản ứng kết tủa Đường cong kết tủa Đường kết tủa xuất hiện khi tỉ lệ KN-KT tối ưu Phản ứng ngưng kết – Kháng nguyên hữu hình. Tạo mạng kết tụ với kháng thể • Ưu điểm – Đơn giản, rẻ – KN hòa tan có thể gắn vào phân tử tải để thành hữu hình • Nhược điểm – Có thể phụ thuộc isotype - IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG • Sử dụng: – Test sàng lọc – Định nhóm máu Ngưng kết trực tiếp Ngưng kết gián tiếp Tìm KN Tìm KT Đọc kết quả 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 No serum • Hiệu giá: Số nghịch đảo của nồng độ huyết thanh pha loãng cao nhất cho phản ứng dương tính. Hiệu giá là 100, không phải là 1/100. – Hiệu giá KT trong huyết thanh tùy thuộc loại test thực hiện • Do độ nhạy các loại test khác nhau. • Ví dụ: mẫu huyết thanh kháng Bartonella henselae có hiệu giá ngưng kết 20; hiệu giá miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 128; hiệu giá western blot 400; hiệu giá ELISA 4.000. Positive control Patient 1 Patient 2 Patient 3 Negative Control Dilution of serum Phản ứng trung hòa • Trung hòa: • Nuôi cấy tế bào bị tổn thương do độc tố, vi khuẩn, virus • Cho tác nhân gây bệnh tiếp xúc KT trước khi cho vào nuôi cấy tế bào • Sự hủy hoại tế bào nuôi bị ức chế. • Mục đích – Định danh virus – Định lượng kháng thể Phản ứng trung hòa Trung hòa độc tố Ngăn ngưng kết hồng cầu: trung hòa virus Phản ứng miễn dịch đánh dấu • Chất đánh dấu được gắn vào 1 thành phần – 3 loại chất đánh dấu • Enzyme • Thuốc nhuộm huỳnh quang • Chất phóng xạ • 1 thành phần phản ứng được gắn lên pha rắn (solid phase) có thể rửa – Thủy tinh, nhựa, màng, tế bào … – Phiến kính, phiến nhựa, hạt, ... Miễn dịch huỳnh quang (IFA) UV light shines on dye Detection: dye becomes excited -electron shift light emitted from dye at a different wavelength Fluorecein Isothyocynate emits green light Rhodamine Isothyocynate emits red light positive cells negative cells • Ưu điểm – Độ nhạy cao – Có thể định lượng – Kỹ thuật có thể phát triển • Nhược điểm – Thiết bị đắt Ví dụ: microscope >$15,000; fluorometers >$25,000; flow cytometers >$100,000 • Mục đích – Phát hiện mầm bệnh – Định danh mầm bệnh – Định lượng / loại tế bào Thử nghiệm trực tiếp tìm KN • Ví dụ: test tìm KN virus bệnh dại – Dùng KT đánh dấu huỳnh quang phát hiện KN trong mô ký chủ Phản ứng gián tiếp tìm KT • Ví dụ: test huỳnh quang gián tiếp tìm KT chống Toxoplasma gondii – Dùng kháng kháng thể đánh dấu Miễn dịch phóng xạ (RIA) • Ưu điểm: - Rất nhạy - Định lượng • Nhược điểm: - Thiết bị đắt - Chất thải phóng xạ • Mục đích: - Thử nghiệm thuốc - Định lượng hormone Phản ứng miễn dịch gắn men (ELISA) Colorless substrate added Colored product produced • Ưu điểm – Nhạy, định lượng – Có thể đọc kết quả bằng mắt – An toàn • Nhược điểm – Cần có quang phổ kế định lượng • Thường được sử dụng hiện nay Test ELISA trực tiếp tìm KN Test ELISA gián tiếp tìm KT Test sandwich • Phản ứng 2 KT – KT đầu tiên gắn trên pha rắn, để bắt lấy KN – KT thứ nhì được gắn enzyme, phát hiện KN • Kháng nguyên phải có ít nhất 2 epitope khác nhau • Có thể dùng để phát hiện KT hoặc KN Test Western blot shows proteins recognized by antibodies Sera Animal #3 - positive Sera Animal #2 - negative Sera Animal #1 - negative No antisera • Test xác định Western Blot SDS-PAGE Stained • Phân tích protein theo kích SDS-PAGE thước shows – SDS-Page many proteins – Điện di in antigen • Chuyển protein qua màng • Phát hiện KN – Dùng kháng thể phù hợp • Phát hiện KT – Dùng protein đã biết để tìm KT Test Western blot Stained SDS-PAGE Western Blot shows many proteins in antigen shows proteins recognized by antibodies Sera Animal #3 - positive Sera Animal #2 - negative Sera Animal #1 - negative No antisera SDS-PAGE Mẫu huyết thanh • Huyết thanh đơn – Dương tính hoặc âm tính • Hiệu giá – Pha loãng mẫu – KT phản ứng chéo bị pha loãng • Huyết thanh kép – Lấy 2 lần, cách nhau ≥ 1 tuần – Kết quả • Hiệu giá tăng nhiều hơn 2 lần = mới nhiễm gần đây • Hiệu giá giảm / không tăng = nhiễm đã lâu – Cần thiết, để phân biệt nhiễm trùng mới mắc / do vaccine Quá nhiều test xét nghiệm? • Mỗi KN không thể đáp ứng cho mỗi test – Phản ứng không đặc hiệu cần loại test ít nhạy hơn • Các test khác nhau có độ nhạy khác nhau – RIA > EIA và IFA > ngưng kết > kết tủa • Khác biệt về chi phí – Test sàng lọc (screening assay): ít tốn kém – Test xác định: đắt hơn Quá nhiều test xét nghiệm? • Khó khăn kỹ thuật – Một số chỉ có thể thực hiện ở lab tham chiếu hay phải có đủ thiết bị • Không phải tất cả test đều phát hiện tất cả isotype – Chỉ IgG và IgM gắn được bổ thể – IgM cho ngưng kết và kết tủa tốt hơn IgG – Có thể điều chế antiglobulin đặc hiệu cho từng lớp KT • Vấn đề độ nhạy và độ đặc hiệu – Số phản ứng dương giả / âm giả phải chấp nhận được. Giá trị test huyết thanh: Độ nhạy – Độ đặc hiệu Âm tính “Gold-standard” Kết quả thử âm tính Kết quả thử dương tính Âm tính thực a Dương tính giả c Độ nhạy = tỉ lệ dương thực = d/(c+d) Độ đặc hiệu = tỉ lệ âm thực = a/(a+b) Dương tính “Gold-standard” Âm tính giả b Dương tính thực d Giá trị test huyết thanh Độ nhạy = tỉ lệ dương thực = d/(c+d) Độ đặc hiệu = tỉ lệ âm thực = a/(a+b) Giá trị tiên đoán dương tính: tỉ lệ có bệnh/số kết quả dương tính Giá trị tiên đoán âm tính: tỉ lệ không có bệnh/số kết quả âm tính [...]... Dilution of serum Phản ứng trung hòa • Trung hòa: • Nuôi cấy tế bào bị tổn thương do độc tố, vi khuẩn, virus • Cho tác nhân gây bệnh tiếp xúc KT trước khi cho vào nuôi cấy tế bào • Sự hủy hoại tế bào nuôi bị ức chế • Mục đích – Định danh virus – Định lượng kháng thể Phản ứng trung hòa Trung hòa độc tố Ngăn ngưng kết hồng cầu: trung hòa virus Phản ứng miễn dịch đánh dấu • Chất đánh dấu được gắn vào 1 thành... Mẫu huyết thanh • Huyết thanh đơn – Dương tính hoặc âm tính • Hiệu giá – Pha loãng mẫu – KT phản ứng chéo bị pha loãng • Huyết thanh kép – Lấy 2 lần, cách nhau ≥ 1 tuần – Kết quả • Hiệu giá tăng nhiều hơn 2 lần = mới nhiễm gần đây • Hiệu giá giảm / không tăng = nhiễm đã lâu – Cần thiết, để phân biệt nhiễm trùng mới mắc / do vaccine Quá nhiều test xét nghiệm? • Mỗi KN không thể đáp ứng cho mỗi test – Phản. .. 1:2560 1:5120 No serum • Hiệu giá: Số nghịch đảo của nồng độ huyết thanh pha loãng cao nhất cho phản ứng dương tính Hiệu giá là 100, không phải là 1/100 – Hiệu giá KT trong huyết thanh tùy thuộc loại test thực hiện • Do độ nhạy các loại test khác nhau • Ví dụ: mẫu huyết thanh kháng Bartonella henselae có hiệu giá ngưng kết 20; hiệu giá miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 128; hiệu giá western blot 400; hiệu... cytometers >$100,000 • Mục đích – Phát hiện mầm bệnh – Định danh mầm bệnh – Định lượng / loại tế bào Thử nghiệm trực tiếp tìm KN • Ví dụ: test tìm KN virus bệnh dại – Dùng KT đánh dấu huỳnh quang phát hiện KN trong mô ký chủ Phản ứng gián tiếp tìm KT • Ví dụ: test huỳnh quang gián tiếp tìm KT chống Toxoplasma gondii – Dùng kháng kháng thể đánh dấu Miễn dịch phóng xạ (RIA) • Ưu điểm: - Rất nhạy - Định... đích: - Thử nghiệm thuốc - Định lượng hormone Phản ứng miễn dịch gắn men (ELISA) Colorless substrate added Colored product produced • Ưu điểm – Nhạy, định lượng – Có thể đọc kết quả bằng mắt – An toàn • Nhược điểm – Cần có quang phổ kế định lượng • Thường được sử dụng hiện nay Test ELISA trực tiếp tìm KN Test ELISA gián tiếp tìm KT Test sandwich • Phản ứng 2 KT – KT đầu tiên gắn trên pha rắn, để bắt... hay phải có đủ thiết bị • Không phải tất cả test đều phát hiện tất cả isotype – Chỉ IgG và IgM gắn được bổ thể – IgM cho ngưng kết và kết tủa tốt hơn IgG – Có thể điều chế antiglobulin đặc hiệu cho từng lớp KT • Vấn đề độ nhạy và độ đặc hiệu – Số phản ứng dương giả / âm giả phải chấp nhận được Giá trị test huyết thanh: Độ nhạy – Độ đặc hiệu Âm tính “Gold-standard” Kết quả thử âm tính Kết quả thử dương... lượng Test Standard Curve mg antibody / mL Phản ứng kết tủa Đường cong kết tủa Đường kết tủa xuất hiện khi tỉ lệ KN-KT tối ưu Phản ứng ngưng kết – Kháng nguyên hữu hình Tạo mạng kết tụ với kháng thể • Ưu điểm – Đơn giản, rẻ – KN hòa tan có thể gắn vào phân tử tải để thành hữu hình • Nhược điểm – Có thể phụ thuộc isotype - IgM ngưng kết hiệu quả hơn IgG • Sử dụng: – Test sàng lọc – Định nhóm máu Ngưng... hiệu = tỉ lệ âm thực = a/(a+b) Dương tính “Gold-standard” Âm tính giả b Dương tính thực d Giá trị test huyết thanh Độ nhạy = tỉ lệ dương thực = d/(c+d) Độ đặc hiệu = tỉ lệ âm thực = a/(a+b) Giá trị tiên đoán dương tính: tỉ lệ có bệnh/ số kết quả dương tính Giá trị tiên đoán âm tính: tỉ lệ không có bệnh/ số kết quả âm tính .. .Phản ứng kết tủa Kết tủa trên thạch (Ouchterlony) • Ưu điểm – Rẻ – Đơn giản (“Có” / “Không” – Không cần KN tinh chế • Nhược điểm – – – – Ít nhạy Không định lượng Tốn thời gian (24-48 giờ) Cần nhiều huyết thanh (0,5 mL/test) Có thể khó đọc kết quả Kết tủa trên thạch Control antibody Test Antibody Antigen Kết tủa vòng Mancini Khuếch tán vòng đơn Pha KT trong thạch Cho KN vào giếng Kết tủa... đánh dấu • Chất đánh dấu được gắn vào 1 thành phần – 3 loại chất đánh dấu • Enzyme • Thuốc nhuộm huỳnh quang • Chất phóng xạ • 1 thành phần phản ứng được gắn lên pha rắn (solid phase) có thể rửa – Thủy tinh, nhựa, màng, tế bào … – Phiến kính, phiến nhựa, hạt, Miễn dịch huỳnh quang (IFA) UV light shines on dye Detection: dye becomes excited -electron shift light emitted from dye at a different wavelength ...Đáp ứng miễn dịch Mục tiêu • Trình bày tính chất phản ứng KN-KT • Nêu nguyên tắc, phương pháp, kết loại phản ứng • Nhận định ý nghĩa kết phản ứng Cơ quan miễn dịch Chẩn đoán huyết học... hồng cầu: trung hòa virus Phản ứng miễn dịch đánh dấu • Chất đánh dấu gắn vào thành phần – loại chất đánh dấu • Enzyme • Thuốc nhuộm huỳnh quang • Chất phóng xạ • thành phần phản ứng gắn lên pha... độc tố, vi khuẩn, virus • Cho tác nhân gây bệnh tiếp xúc KT trước cho vào nuôi cấy tế bào • Sự hủy hoại tế bào nuôi bị ức chế • Mục đích – Định danh virus – Định lượng kháng thể Phản ứng trung