NGHIÊN cứu lý THUYẾT về PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT hợp CHẤT PROTIT

Cấu trúc bậc nhất Protit là một chuỗi aminoaxit kết hợp với nhau bằng liên kết peptit tạo nên một chuỗi mạch dài polypeptit gọi Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì

NGHIÊN CỨU LÝ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP

TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT PROTIT

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hợp chất thiên nhiên (Natural product) là một trong những lĩnh vực rất thú

vị trong bộ môn Hóa Hữu cơ Lĩnh vực này nghiên cứu về thành phần, cấu tạo và tính chất của những hợp chất thiên nhiên và cách trích ly chúng từ nguồn thiên nhiên vô tận

Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực vật, chủ yếu là trong động vật Protit bao gồm protein và proteit, là những hợp chất quan trọng và cần thiết trong đời sống của động vật, thực vật và cả con người

Protein là một trong những thành phần quan trọng nhất của động vật và thực vật Tất cả các enzyme, hầu hết các hoóc môn, một phần lớn hệ thống miễn dịch của chúng ta, tất cả các cơ và rất nhiều các mô khác của cơ thể được tạo nên bởi protein

Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó là thành phần dinh dưỡng cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung cấp vật liệu như da, lông, tơ phục vụ sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian bảo quản

Nhiều năm qua việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protein, đặc biệt là các enzyme, đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn

Phần lớn enzyme sử dụng trong công nghiệp là các protein ngoại bào từ các

cơ thể Nhiều loại trong số này vẫn còn được sản xuất từ các chủng gốc tự nhiên của vi sinh vật Tuy nhiên, trong sản xuất protein/enzyme để sử dụng trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng và cho các ứng dụng trị liệu, công nghệ

protein/enzyme và công nghệ DNA tái tổ hợp đã thể hiện một vai trò ngày càng quan trọng

Nhiều loại loại protein/enzyme được sản xuất trong các hỗn hợp nội bào phức tạp đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình tinh sạch chúng Những protein/enzyme được tinh sạch này thường được sản xuất để sử dụng trong trị liệu, do đó phải cố gắng hướng tới các tiêu chuẩn tinh sạch rất cao và để có được điều này người ta cần phải phát triển các quy trình tinh sạch phức tạp

Vì những lý do đó tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu lý thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm hiểu về protit, cấu tạo, tính chất và phân loại protit

- Các phương pháp tách chiết, tinh sạch protit

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cơ sở lí thuyết, phương pháp tách chiết protit

- Phạm vi nghiên cứu: Các phương pháp tách chiết protit

4 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong khóa luận này nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

- Nghiên cứu tài liệu, giáo trình liên quan đến phương pháp tách chiết protit

- Nghiên cứu ví dụ cho phương pháp tách chiết, tinh sạch protit

5 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp nghiên cứu lí luận: Đọc các giáo trình, tài liệu tham khảo liên quan đến phương pháp tách chiết protit và ví dụ về phương pháp tách chiết protit

- Phương pháp lấy ý kiến chuyên gia: Lấy ý kiến của giáo viên trực tiếp hướng dẫn và các giáo viên khác trong lĩnh vực đề tài để hoàn thiện nội dung và hình thức của khóa luận này

- Phương pháp học hỏi và tổng kết: Học hỏi kinh nghiệm của các anh, chị khóa trước, sau đó rút ra kinh nghiệm cho bản thân và tổng kết những kiến thức

đã tìm hiểu để hoàn thành khóa luận

6 Đóng góp của khóa luận

- Đưa ra được lí thuyết về phương pháp tách chiết, tinh sạch protit, một hợp chất quan trọng đối với con người, động vật và thực vật

- Giới thiệu về protit gồm cấu trúc, tính chất, phân loại Giúp chúng ta nhận

ra được tầm quan trọng của protit trong đời sống

7 Cấu trúc khóa luận

Ngoài phần Mở đầu, Kết luận và Danh mục tài liệu tham khảo, khóa luận gồm 3 chương:

Chương 1: Tổng quan sơ lược về protit

Chương 2: Các kỹ thuật cơ bản trong quá trình tinh sạch protein

Chương 3: Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng và đầu tôm sú bằng phương pháp sắc kí lọc gel

NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT

1.1 Giới thiệu về protit

Protit là hợp chất cao phân tử sinh học, có trong cơ thể động vật và thực vật, chủ yếu là trong động vật Thực vật tổng hợp protit từ CO2 và H2O bằng quang hợp cùng với các nguyên tố khác như N, P, S, Fe, Mg có trong muối tan của đất, còn cơ thể động vật có thể tự tổng hợp được một số aminoaxit, gọi là aminoaxit thế, còn đại đa số aminoaxit là đưa từ ngoài vào cơ thể, từ đó có thể tổng hợp ra protit

Khi thủy phân đến cùng sẽ tạo thành các α-aminoaxit, thường protit có khối lượng phân tử khoảng 104 đến 107

1.2 Phân loại protit

Protit được chia ra làm hai loại chính: protein và proteit:

1.2.1 Protein

Protein là loại protit đơn giản, cấu trúc chỉ từ những α-aminoaxit khác nhau Các α-aminoaxit kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptit (gọi là chuỗi polypeptit)

H | (gốc hữu cơ R) R – C – COOH (nhóm cácbôxylic)

|

NH2 (nhóm amin) Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein

Protein bao gồm hai loại chủ yếu: Protein tan trong nước và protein không tan trong nước

1.2.1.1 Protein tan trong nước

Protein tan trong nước thường kết tủa khi đun nóng, khó kết tủa trong dung dịch muối

 Albumin là protein đơn giản phổ biến nhất Nó được tìm thấy ở trong máu, dịch tế bào, dịch tuỷ sống Anbumin có trong lòng trắng trứng, mô bắp thịt, sữa Anbumin chứa trong sữa cùng với protit khác gọi là cazein, bọt nổi lên khi đun sôi sữa chủ yếu là anbumin Albumin hoà tan trong nước và các dung dịch muối Anbumin trung tính, tương đối khó kết tủa trong dung dịch muối, vón lại khi đun nóng Albumin đông khi đun nhưng ở các nhiệt độ khác nhau: albumin trứng đông ở nhiệt độ 560ºC, albumin huyết thanh ở 670ºC, albumin sữa ở 720ºC

Albumin của động vật (như albumin huyết thanh của máu) khi thuỷ phân cho 19 axit amin và thành phần các axit amin ít khác nhau ở các động vật (trừ vịt) Albumin thường chứa số lượng lớn các axit amin sau: leucin, axit glutamic, axit aspartic, lysin, còn các axit amin như methionin, tryptophan, glycocol số lượng ít hơn Trọng lượng phân tử của albumin khoảng 35.000 - 70.000, điểm đẳng điện nằm trong khoảng 4,6-4,7

Albumin thường tạo thành các phức chất với lipid, axit béo, axit amin, kháng thể nên có quan điểm cho rằng nó giữ vai trò tích cực trong trao đổi vật chất

1.2.1.2 Protein không tan trong nước

Protein không tan trong nước có tính axit hoặc bazơ yếu, không tan trong dung dịch muối Loại này có vài nhóm sau:

 Globulin không tan trong nước, là axit yếu, tan trong dung dịch muối loãng, kết tủa trong dung dịch muối đặc hơn Globulin có trong protit của lòng

đỏ trứng, trong máu, cơ bắp thịt, thường là chất đầu để hình thành protit thực vật Globulin hầu như nằm cùng với albumin và rất phổ biến trong tự nhiên Nó

có nhiều trong máu động vật, trong các cơ quan, tế bào, trong các dịch lỏng của

cơ thể

Globulin chứa khoảng 14-19 axit amin quan trọng như: leucin, vang, ly sin, axit glutamic, sâm, treo nin Trọng lượng phân tử của globulin khoảng 90.000 - 1.500.000 hoặc lớn hơn, điểm đẳng điện nằm trong khoảng 5,0-7,5

 Histon là protein có cấu tạo đơn giản là protit có tính bazơ, có trong hồng cầu, trong các nucleoproteit leucocit Histon dễ tan trong nước, không tan trong dung dịch amoniac loãng Nó chứa số lượng axit amin quan trọng ít hơn so với albumin và globulin Trong histon không có cystein, cystin, tryptophan, mà chủ yếu là arginin và lysin (20-30%) Histon được Koccel tìm thấy trong nhân

tế bào, trong thành phần của nucleoprotein và các protein phức tạp khác Điểm đẳng điện của histon nằm trong khoảng 9,0 - 11,0

 Protamin có tính bazơ mạnh, không chứa S, có trong cá nhà táng được coi là chất protit đơn giản nhất trong protit, cho muối kết tinh Protamin được Miser và Koccel tìm thấy trong thành phần của nucleoprotein của tế bào sinh dục cá Sau đó còn phát hiện ở lách, tuyến điều và các cơ quan khác Protamin có trọng lượng phân tử thấp (2.000-8.000), thành phần chứa ít axit amin (6 - 8), trong đó chủ yếu là axit amin điamin (tới 80% arginin) Khi đun protamin không đông và không sa lắng, nó chỉ sa lắng bởi muối kim loại nặng Điểm đẳng điện của protamin nằm trong khoảng 10,5 - 12,0

 Prolamin có trong ngũ cốc, tan trong rượu 80% Chất tiêu biểu là glyadin,

là thành phần chính của gluten Gluten (protit dính, tách được khi lọc tinh bột) là hỗn hợp protit, ưu tiên có glyadin tan trong rượu còn các protit khác không tan trong rượu Prolamin có nhiều ở các hạt thảo Đặc điểm của prolamin là tính hoà tan trong cồn 70% và không tan trong nước Khi thuỷ phân prolamin thường cho nhiều thoăn và axit glutamic (43%)

 Keratin là chất chủ yếu của tóc, lông, sừng, móng, lớp thượng bì hoàn toàn không tan, kể cả trong dung dịch axit, kiềm Khi thuỷ phân cho nhiều cystin (7 - 12%) và axit glutamic (4 - 17%)

 Colagen (và procolagen) là protein của sợi mô liên kết ở gân, ở da, ở

dưới da, có trong cơ bắp, xương, … Nó không hoà tan trong nước, nhưng khi tác

động lâu của nhiệt sẽ trở thành dạng hoà tan là gelatin Keo dán chế ở da trâu chính là colagen Hàm lượng glycin của colagen khá cao (25%), nhưng về nhiều axit amin không thay thế được thì lại thiếu

 Lipoproteit khi thủy phân cho protein và chất béo

 Về mặt cấu trúc, protit được chia ra làm hai loại: prrotit sợi và protit dạng hạt cầu

1.3 Cấu trúc của protit

Cấu trúc của protit rất phức tạp, nhất là các proteit, song về cơ bản gồm các loại khác nhau phụ thuộc vào mạch phân tử và tương tác giữa các phân tử

Cấu trúc không gian: có 4 bậc cấu trúc cơ bản

Cấu trúc bậc 1: Là trình tự sắp xếp các amino axit trong chuỗi polipeptit, là chuỗi axit amin ở dạng mạch thẳng, có tính đặc thù bởi số lượng, thành phần, trật tự sắp xếp các axit amin

Cấu trúc bậc 2: Được tạo thành từ các chuỗi protein bậc 1 xoắn cuộn vào nhau một cách đều đặn Các protein có thể xoắn tạo nên cấu trúc xoắn α hoặc gấp khúc tạo nên cấu trúc gấp β

Cấu trúc bậc 3: Là hình dạng không gian ba chiều của protein do kiểu bậc 2 cuộc xếp theo kiểu đặc trưng cho từng loại protein

Cấu trúc bậc 4: Do các cấu trúc bậc 3 kết hợp với nhau tạo thành khối

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của protein

1.3.1 Cấu trúc bậc nhất

Protit là một chuỗi

aminoaxit kết hợp với nhau

bằng liên kết peptit tạo nên một

chuỗi mạch dài polypeptit gọi

Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptit sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptit, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính

chất cũng như vai trò của protein Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein

1.3.2 Cấu trúc bậc hai

Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptit trong không gian Chuỗi polypeptit thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, được cố định bởi các liên kết hyđro giữa những axit amin ở gần nhau Các protein sợi như keratin, Collagen (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein cầu có nhiều nếp gấp β hơn

Tính cứng của mạch peptit do hạn chế khả năng quay của liên kết như trên

đã nói, ngoài ra cấu trúc ba chiều của phân tử peptit còn do hai nhân tốt khác: liên kết giữa các mạch và tương tác van der Waals hay tương tác Coulomb Liên kết giữa các mạch là liên kết đisunfua, chẳng hạn giữa hai đơn vị cystein của hai mạch như trong insulin, đã hạn chế sự quay của phân tử

Liên kết hiđro giữa hai phân tử hay trong nội bộ phân tử do mạch peptit có chứa nhóm CO và NH Liên kết hidro giữa oxi của CO với H của NH

Liên kết sunfua và hiđro làm cho peptit có cấu dạng gọi là cấu trúc bậc hai (có tài liệu gộp cấu trúc bậc một và hai thành cấu trúc chung bậc nhất)

1.3.2.1 Cấu trúc vòng xoắn α

Cấu trúc này tự quay quanh nó mỗi vòng có chiều cao là 5.4 Aº có chiều cao là 5.4 A Nên chúng ta nói rằng chuỗi xoắn α tương ứng khoảng 3.6 amino axit mỗi vòng

Cấu trúc này được bền vững hóa nhờ liên kết hiđro gắn với nguyên tử nitơ tích điện âm của liên kết peptit và nhóm nguyên tử -CO- tích điện âm của amino axit thứ 4 trên vùng tận cùng của amino axit của liên kết peptit Bên trong chuỗi helix, mỗi liên kết peptit (trừ liên kết kề với 2 đầu của chuỗi) tham gia vào liên kết peptit đó Mỗi vòng liên tiếp của chuỗi helix chứa 3 đến

4 liên kết hiđro Tất cả liên kết hiđro đó tạo nên tính ổn định cho cấu trúc chuỗi xoắn helix

Hình 1.3 Cấu trúc vòng xoắn α 1.2.3.2 Cấu trúc nếp gấp β

Trong dạng cấu trúc polypeptit này không có dạng xoắn ốc, thay vì thế, nó

có dạng zigzag hơn là xoắn α

Các chuỗi polypeptit zigzag có thể được sắp xếp kế tiếp nhau tạo thành cấu trúc một loạt các nếp gấp gọi là phiến (sheet); liên kết hiđro được tạo bởi các đoạn kề nhau của chuỗi polypeptit Các chuỗi polypeptit trong một phiến có thể song song hoặc đối song (cùng hoặc ngược hướng amino – carboxyl tương ứng) Cấu trúc này khá giống nhau, mặc dù đoạn lặp lại ở cấu trúc song song là ngắn hơn (6.5Ao , ở cấu trúc đối song là 7 Ao ) và kiểu liên kết hiđro khác nhau

Phiến β song song ít xoắn hơn dạng đối song và luôn bị chôn vùi Ngược lại, phiến đối song có thể thấy sự xoắn rõ rệt hơn và dễ hòa tan hơn

Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfua (-S-S-), nhóm -R của prolin cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các

nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử Các liên kết yếu hơn như liên kết hyđro hay điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu

Hình 1.5 Cấu trúc bậc ba của protein

1.3.4 Cấu trúc bậc bốn

Khi protein có nhiều chuỗi polypeptit phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein Các chuỗi polypeptit liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hyđro

Chuỗi polypeptit (có cấu trúc bậc một) được xoắn lại thành ống trụ (cấu trúc bậc hai), ống trụ cuộn tròn lại thành trụ (cấu trúc bậc ba), các thành trụ kết hợp lại với nhau thành một tổ hợp các phân tử protein (cấu trúc bậc bốn)

Hình 1.6 Cấu trúc bậc bốn của protein

1.4 Tính chất của protit

1.4.1 Tính chất lưỡng tính

Do thành phần protit là các phân tử axit amin, mà axit amin là chất lưỡng tính nên protit cũng là phân tử lưỡng tính, có điểm đẳng điện đặc trưng cho từng loại protit Nói chung, điểm đẳng điện nằm trong vùng axit pH = 4,6 - 6,3 Đặc tính của protit là tính chất của dung dịch đệm

Ngoài ra, do trong thành phần amino axit của protein có 2 nhóm:

- Các amino axit: trong cấu tạo có 2 nhóm COOH, trong đó 1 nhóm dùng

để tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành ion COO-

- Các amino axit kiềm: trong cấu trúc có 2 nhóm NH2, trong đó một nhóm tạo liên kết peptit còn một nhóm hình thành NH3

 Phản ứng ninhidrin: protein tác dụng với dung dịch ninhidrin trong nước cho dung dịch màu xanh Phản ứng này đặc trung cho α-amino axit có trong phân tử protein

1.4.3 Tính tan

Tính tan của protit thay đổi phụ thuộc vào khối lượng phân tử, trật tự kết hợp giữa các phân tử, tương tác giữa các phân tử, nhất là sự hình thành liên kết hiđro và đisunfua và còn phụ thuộc vào dung môi, môi trường, nhiệt độ

Các protein hình sợi như keratin (của móng, tóc, sừng), fibroin (của tơ tằm) hoàn toàn không tan trong nước Protein hình cầu của anbumin, globulin của sữa

và của máu có thể tan trong nước tạo thành dung dịch keo vì trên bề mặt phân tử

có nhiều nhóm nguyên tử phân cực tích điện, các phân tử lưỡng cực của nước bị hấp thụ bởi các nhóm nguyên tử nêu trên, tạo thành màng nước bao quanh phân

tử protein gọi là lớp vỏ hiđrat hóa

Tại điểm đẳng nhiệt protein tan kém nhất, nếu thêm axit hoặc kiềm có thể làm tăng độ tan

Một số muối trung tính có thể làm ảnh hưởng đến độ tan của protein Tính tan của protein tan khi nồng độ muối thấp, khi nồng độ muối cao gây ra sự kết tủa protein Ở nhiệt độ thấp tính tan của protein giảm

1.4.4 Sự biến tính của protit

Tính chất của protit thay đổi dưới tác động của các tác nhân vật lý hoặc hóa học gọi là sự biến tính protit, như:

 Nhiệt

 Các bức xạ tử ngoại

 Sự biến đổi độ pH

 Các chất tẩy rửa

 Các dung môi hữu cơ (trừ nhiệt độ dưới 0oC)

 Dung dịch ure hay guanidin

 Sự pha loãng đơn giản hay sự khuấy đơn giản cũng có thể là nguyên nhân gây sự biến tính của protit, điều này rất cản trở khi ta muốn tinh chế một protein

Quá trình biến tính đã gây ra sự thay đổi cấu trúc của phân tử protit, làm thay đổi liên kết

Sự biến tính có thể là quá trình thuận nghịch hay không thuận nghịch Điều này xảy ra khi có sự chuyển từ trạng thái trật tự cao xuống trạng thái ít trật tự

Ở trạng thái tự nhiên, protein có cấu dạng bền nhất theo quan điểm năng lượng ở những điều kiện trong tế bào; nếu ta thay những điều kiện này, các cấu dạng của protein sẽ bị biến tính, các liên kết hyđro và các liên kết khác cũng sẽ đứt và gây nên sự xáo trộn cấu trúc bậc hai và bậc ba

- Các axit: HNO3, axit axetic, axit tricloaxetic

- Các dung môi hữu cơ: Ancol etylic, axeton, ancol metylic

Có hai loại kết tủa: Kết tủa thuận nghịch và kết tủa bất thuận nghịch

Kết tủa thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây ra

kết tủa, protein lại tan trong nước tạo thành dung dịch keo như trước và vẫn giữ nguyên tính chất của chúng Kết tủa thuận nghịch không làm thay đổi tính chất của protein

Ví dụ như cho dung dịch (NH4)2SO4 vào dung dịch lòng trắng trứng sẽ xuất hiện kết tủa bông của globulin Khi loại bỏ (NH4)2SO4, kết tủa globulin lại tan trở lại trong nước tạo thành dung dịch keo

Kết tủa bất thuận nghịch: Sau khi protein kết tủa, nếu loại bỏ tác nhân gây

kết tủa, protein mất khả năng tạo dung dịch keo bền Kết tủa bất thuận nghịch làm thay đổi tính chất của protein

Khi đun nóng trứng hoặc sữa, thì sau khi đun chúng không thể trở về dạng đồng thể như ban đầu Kết tủa bất thuận nghịch cũng xảy ra trong trường hợp có mặt của muối kim loại nặng như Fe, Cu, Hg, Pb Các tác nhân này thường làm thay đổi lớp vỏ hiđrat hóa và lớp vỏ điện tích

1.4.6 Hoạt tính sinh lý

Protein cũng như polypeptit có vai trò rất quan trọng và rất đa dạng trong

sự sống của sinh vật Để đơn giản và vắn tắt, có thể nói vai trò chủ yếu của protein là vai trò cấu trúc hóa Chẳng hạn; α-keratin là cấu tử cấu trúc nên tóc,

da lông, móng Collagen là nguyên liệu cấu thành các mô liên kết như xương, sụn, gân Fibroin là tơ của các mạng nhện và của kén…

Một số protein là nguồn dự trữ Ovalbumin có bản chất làm nguồn thức ăn trong lòng trắng trứng Cazein có vai trò quan trọng trong sữa Một số protein làm vai trò của hoocmon như insulin điều hòa quá trình trao đổi chất của glucozơ, β-endorphin, giống như morphin, gây ra sự đau tự nhiên cho cơ thể Một polypeptit khác là mellitin có 26 aminoaxit, là chất độc của ong, có chức năng sinh học bao gồm các khả năng thấm sâu vào màng tế bào và phân hủy erythrocyt (tế bào máu đỏ)

Protit còn đóng vai trò của enzym, có liên quan tới cấu trúc phân tử, lực tương tác nội và giữa các phân tử, liên quan tới tính chất hóa học của nhóm chức, tính axit và tính bazơ, tính oxi hóa và khử, cũng liên quan tới sự thay đổi năng lượng và tốc độ phản ứng

CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH

TINH SẠCH PROTEIN

2.1 Chuẩn bị dịch protein thô

Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng siêu âm Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lý các mô mềm, mô động vật, thực vật Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất là nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lý với lysozyme (enzyme phá vách tế bào) Đối với những loại tế bào có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một

số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vỡ tế bào Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu

2.2 Ổn định protein trong dịch chiết thô

Sau khi giải phóng khỏi vách tế bào, protein bắt đầu chịu tác động phá hoại của nhiều yếu tố khác nhau Do vậy việc đầu tiên là phải tạo điều kiện ổn định cho protein

Sự ổn định của protein phụ thuộc vào độ phân cực hay lực ion, pH, sự có mặt hay vắng mặt của ion kim loại, sự oxy hóa, protease nội bào và nhiệt độ Thông dụng nhất là sử dụng giá trị pH sinh lý hoặc đệm Tris và phosphate Các ion Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ thường làm tăng sự ổn định của protein, trong khi các ion kim loại nặng Ag

Để giảm thiểu tác động của protease nội bào cùng giải phóng cần bổ sung chất ức chế protease như phenyl metyl sufonyl florua Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp

2.3 Các phương pháp tủa protein

Có 5 phương pháp lắng tủa protein: tủa bằng muối, lắng tủa bằng dung môi hữu cơ, lắng tủa điểm đẳng điện, lắng tủa bằng polyme không mang điện và lắng tủa bằng các chất đa điện phân

2.3.1 Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau

Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng amonium sulfat thường được sử dụng bước đầu trong quy trính tách chiết và tinh sạch protein Ở các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại Khi đủ một lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa Nếu quá trình này được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính Sau đó thu tủa protein bằng cách ly tâm và hòa tan trở lại trong dung dịch đệm có nồng độ muối thấp Dung dịch lúc này vẫn chứa nhiều muối còn lại trong tủa

Có nhiều phương pháp để rửa muối khỏi protein nhưng người ta thường loại muối bằng phương pháp thẩm tích hay phương pháp lọc gel Dung dịch sau khi rửa sạch muối được giữ để sử dụng cho các quá trình tinh sạch và phân tích tiếp theo

2.3.2 Tủa bằng dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ như: acetone, isopropanol, ethanol (được dùng nhiều nhất) Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tủa tốt hơn so với tủa bằng muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc ký, cách tiến hành đơn giản Nhưng khi tủa bằng dung môi hữu cơ phải thực hiện trong điều kiện lạnh vì nếu tủa ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lượng dung môi cần dùng tương đối nhiều

2.3.3 Tủa bằng điểm đẳng điện

Tại điểm đẳng điện, protein bị mất điện tích nên gây tủa Phương pháp này cho kết quả rất cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ

2.3.4 Tủa bằng các loại polyme

Bao gồm: polyacrylic axit, polysaccarit, polyphotphat Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polyme, hiệu suất tạo kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao

2.3.5 Tủa bằng chất đa điện phân

Thường dùng polyetylen glycol có phân tử lượng 6.000 và 20.000 Có thể

sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao Nhược điểm của phương pháp là rất đắt tiền và dễ gây biến tính protein

2.4 Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein

Sau khi nhận được dịch tủa protein, công việc tiếp theo sẽ là chiết tách, tinh sạch để nhận được các phân đoạn protein khác nhau

2.4.1 Mục tiêu

Mục tiêu của quy trình tinh sạch là nhằm thu được một lượng protein tối

đa dựa trên lượng hoạt tính thu được so với hoạt tính tổng của protein trong dịch chiết ban đầu Hơn nữa sản phẩm protein nhận được cũng phải đạt hoạt tính tối

đa, có nghĩa là protein không bị mất hoạt tính trong quá trình bảo quản, không bị phân giải, và độ tinh sạch cũng phải đạt tối đa, nghĩa là không có sự hiện diện của các protein hay các đại phân tử sinh học khác

Không có cách nào để dự đoán hoạt tính của một protein đã được tinh sạch trong một số điều kiện nhất định nào đó, vì vậy quá trình tinh sạch được tiến hành cho đến khi nào hoạt tính đặc hiệu của protein (Unit/mg) tăng đến một giá trị không đổi sau một vài công đoạn của quy trình tinh sạch

2.4.2 Sơ đồ tinh sạch protein

Sơ đồ chung cho quá trình tinh sạch protein có thể được biểu diễn như sau:

a)

b)

c)

Sơ đồ 2.1 Quá trình tinh sạch protein

Trong sơ đồ tổng quát này, quy trình tinh sạch cho một protein nào đó bao gồm: (a) Nguồn nguyên liệu, (b) Phương pháp nghiền, (c) Phương pháp tinh sạch

Nguồn

(nguyên liệu)

Sản phẩm thô Enzyme tinh

sạch

Nghiền

sơ bộ, tách các

Trích ly

Quy trình tinh sạch (quy mô lớn)

Tinh sạch (quy mô nhỏ) Phân tách bằng phương pháp ái lực hấp phụ

2.4.2 Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein

Bảng 2.1 Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein

Kích thước hay khối

 Điện di điểm đẳng điện

 Sắc ký tương tác kỵ nước

 Thay đổi lực ion

 Thay đổi hằng số điện môi

 Lớn

 Lớn và nhỏ

 Lớn Tâm bám đặc hiệu

2.4.3 Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein

Sau khi đánh giá về những ưu và khuyết điểm của các phương pháp tinh sạch khác nhau, cần phải xác định một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến các phương pháp tinh sạch và trình tự của các phương pháp này trong quy trình tinh sạch Trong thực tế cần phải nhấn mạnh rằng rất ít khi chỉ cần một hay phối hợp của hai phương pháp mà có thể tinh sạch được protein Quy trình tinh sạch cụ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

 Qui mô và hiệu suất tinh sạch

 Thời gian cần thiết cho quá trình tinh sạch

 Trang thiết bị hiện có

Ngày nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thực sự có hiệu quả trong

biết lựa chọn các phương pháp riêng kết hợp với nhau, tạo ra phương pháp nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất

2.4.4 Tinh sạch protein

Trong dịch chiết thô thu được ngoài protein còn có chất cao phân tử khác như polysaccharid, axit nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng,

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex

Để loại bỏ các tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký, điện di

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân

tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh

Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động

Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử, sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử, sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất

Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein Phương pháp chiết tách và tinh sạch protein phổ biến nhất là sắc ký cột Trong trường hợp này, các phân đoạn protein được cho chạy qua cột nhồi bằng các hạt agarose hoặc polyacrylamit nhỏ được cải biến cho phù hợp Có một số phương án khác nhau trong việc sử dụng cột tách chiết và tinh sạch protein Các quy trình khác nhau được thiết lập có thể

khác nhau do đặc tính khác nhau của các loại protein Ở đây mô tả một số phương pháp, trong các phương pháp này, protein được phân lập dựa vào kích thước và tính tích điện của chúng

2.4.4.1 Sắc ký trao đổi ion

Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân lập dựa trên điện tích ion hóa bề mặt của chúng bằng việc sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hoặc dương (đây còn được gọi là pha tĩnh) Các phân tử protein tương tác yếu với các hạt (chẳng hạn như một phân tử protein tích điện dương được cho chạy qua cột mang các hạt tích điện âm) sẽ được hồi lưu khi sử dụng một dung dịch muối loãng chảy qua cột sau đó (dung dịch chạy mẫu được gọi là pha động) Các phân tử tương tác với pha động càng mạnh, càng cần dung dịch hàm lượng muối cao để hồi lưu mẫu (bởi muối làm

"trung hòa" các vùng mang điện tích) và vì vậy cho phép các phân tử protein được giải phóng khỏi cột

Bằng việc tăng dần nồng độ muối trong các dung dịch đệm thu hồi mẫu, các phân tử protein khác nhau, kể cả các phân tử có đặc tính tích điện gần giống nhau cũng được phân tách thành các phân đoạn khác nhau khi chúng được hồi lưu từ cột

+

+ +

+ + +

+ + + + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + + + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + + + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + + + + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

2.4.4.1.1 Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion

 Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột

- Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột

- Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa

và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những bọt khí nằm giữa các hạt nhựa

- Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống

- Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng cách cho dung dịch đệm chảy qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột

 Nạp mẫu chất lên đầu cột

- Dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cột, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite

- Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu

- Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại, dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột

- Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa

2.4.4.2 Sắc ký lọc gel

Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cơ sở đặc điểm khác nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước Khác với trong kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹ thuật này không mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác nhau Các phân tử protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất

cả các lỗ; vì vậy, thời gian chạy qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn Ngược lại, các phân tử protein kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn