Phương pháp gây biến tính chọn lọc

6. Đĩng gĩp của khĩa luận

3.2.1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme axit và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70ºC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme khơng bền nhiệt và khơng chịu pH thấp sẽ bị biến tính.

Sau đĩ, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần khơng phải là enzyme mà ta mong muốn.

3.2.2. Phương pháp kết tủa phân đoạn

Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngồi muối (NH4)2SO4 ra, cịn cĩ thể sử dụng một số dung mơi hữu cơ như etanol, axeton để kết tủa protein.

Dựa vào đặc tính phân cực của protein để lựa chọn các phương pháp như:  Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography).

 Sắc ký giấy.

 Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).  Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC).

Dựa vào kính thước protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography).

3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel 3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel

3.3.1.1. Chọn lựa gel

Chủ yếu người ta sử dụng gel trong 2 trường hợp: Loại bỏ phân tử cĩ trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và axit nucleic. Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 m) hay 200 - 400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài.

3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản

Gel dextran và acrylamit thương mại ở dạng bột khơng ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng. Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20ºC đối với loại gel cĩ liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Cĩ thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (cĩ thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy khơng cần cho nở. Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đĩ bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%).

3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu

3.3.2.1. Dựng cột lọc gel

Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm cĩ tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100. Để tách nhĩm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm cĩ pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH 10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo khơng làm mất hoạt tính của chất cần tách.

3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu

Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị lỗng. Để tách nhĩm chất cĩ thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dịng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dịng chảy tự do. Thơng thường đối với gel cĩ kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2

mặt cắt ngang (15-25 ml/h), cịn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h). Dịng chảy cĩ thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dịng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thơng thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng cĩ tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên.

3.4. Phương pháp tinh sạch

3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tơm sú

Xay đầu tơm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung mơi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 - 4ºC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4ºC, tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC).

Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi và loại dung mơi chiết với mẫu. Từ đĩ chọn dung mơi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme.

3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease

Sử dụng các tác nhân gây kết tủa thuận nghịch protein trong dịch chiết nội tạng và đầu tơm là: cồn 96º, axeton và muối amoni sunfat.

Tiến hành tủa dịch chiết bằng các tác nhân trên với tỷ lệ dịch chiết/dung mơi khác nhau ở điều kiện 0 – 4ºC, thời gian tủa 60 phút, ly tâm lạnh ở 4ºC với

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa và tác nhân tủa từ đĩ chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa dịch chiết thu protease.

3.4.3. Bố trí thí nghiệm

Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của protease từ mẫu đầu và nội tạng tơm sú được tiến hành theo sơ đồ bố trí như sau:

Nghiền mịn

Ly tâm dịch chiết enzyme thơ

Ly tâm thu chế phẩm thơ

Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease

Tơm sú (đầu hoặc nội tạng)

Chiết dịch enzyme thơ

Dịch chiết enzyme thơ (DC)

Tủa dịch chiết

Chế phẩm thơ (CPT)

Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme CPT: nhiệt độ, pH, % muối ăn.

Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein

3.4.3.1. Xác định dung mơi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tơm sú thích hợp đầu tơm sú thích hợp

Dung mơi chiết cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành chiết tách protease từ mẫu nội tạng và đầu tơm sú bằng các dung mơi: nước cất, muối sinh lý, đệm photphat 0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/dung mơi (w/v) khác nhau, được giữ ở ≤ 4ºC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên mấy khuấy từ trong 40 phút. Ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết.

Nước cất: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5.

Nước muối sinh lý: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Đệm photphat 0,1M pH 7,0: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.

Đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.

Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng dịch chiết, so sánh, chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung mơi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí TN như sau:

Sơ đồ 3.2

Nội tạng và đầu tơm sú (đã nghiền) Hịa với các dung mơi

Xác định hoạt tính proetease của DC Xác định hàm lượng protein của DC

Chọn ra dung mơi và tỷ lệ chiết thích hợp Nước cất

Tỷ lệ 1/1-5 Tỷ lệ 1/1-10 (w/v)Đệm photphat

Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-10 Muối sinh lý

3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC

Mỗi loại tác nhân tủa thường cĩ khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4ºC. Ly tâm lạnh 4ºC, tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hịa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định (một lượng ít nhất cĩ thể).

Tủa bằng etanol (cồn 96º) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8.

Tủa bằng axeton được làm lạnh, nồng độ tủa theo nồng độ phần trăm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75.

Tủa bằng muối (NH4)2SO4, nồng độ tủa theo nồng độ muối bão hịa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75.

Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng CPT, so sánh, chọn ra nồng độ tủa thích hợp và loại tác nhân tủa thích hợp.

Sơ đồ 3.2:

Kết tủa bằng các tác nhân với nồng độ tủa khác nhau

Xác định hoạt tính protease của CPT Xác định hàm lượng protein của CPT Cồn 96º Tỷ lệ 1/1-8 (v/v) Axeton Nồng độ 50-75% (NH4)2SO4 Nồng độ 50-75% Dịch chiết enzym từ nội tạng

và đầu tơm sú (đã nghiền)

3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel

Tách các protein của protease trong CPT mẫu đầu và mẫu nội tạng của tác nhân tủa cồn, axeton và tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp bằng phương pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp.

 Các thơng số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp sau:

Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5.000 – 100.000 Da). Cột : 30 x 1,5 cm

Flow adaptor (bộ chuyển đổi dịng chạy) : 1,5 cm. Tốc độ dịng : 0,14 ml/phút.

Vmẫu : 1ml.

Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn.

A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sĩng 280 nm.

3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm photphat 0.1M pH 7.0 đựng trong cốc. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, khơng cần phải khuấy, hãy để ổn định 12 giờ và 20ºC trong suốt quá trình hyđrat hĩa.

Sau khi quá trình hyđrat xảy ra hồn tồn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân khơng cĩ gắn với vịi hút chân khơng. Khử khí của dung dịch trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình.

Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại cơng việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.

Gắn phễu đổ gel vào cột, đĩng lỗ thốt của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rĩt đều dung dịch gel vào cột thành một dịng di chuyển nhẹ tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khĩa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khĩa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở khĩa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với

thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đĩng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách dùng xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.

Chuẩn bị mẫu: mẫu chạy sắc ký phải sạch (khơng bị nhiễm bẩn và khơng cĩ các hạt rắn); hịa tan hồn tồn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột.

Dùng xylanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký, dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sĩng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính.

Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Thu các fraction chứa dịch protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 và hàm lượng protein theo phương pháp Bradford.

3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di

Khuơn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di phải được rửa sạch và lau khơ bằng cồn. Sau đĩ ráp thành khuơn để chuẩn bị đổ gel.

 Đổ gel phân tích :

Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10%

Dung dịch được trộn bằng máy khuấy từ, sau đĩ cho 4 μl TEMED vào dung dịch, khuấy đều và nhanh chĩng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel. Gel sẽ được bơm đến vạch cách lược là 0,5 cm. Chú ý khơng bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ đơng lại trong 20-30 phút.

 Đổ gel tập trung

Gel tập trung thường được pha ở nồng độ 4%. Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nước phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm.

Tương tự gel phân tích, sau khi cho 4 μl TEMED vào, dung dịch phải được đưa nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nước trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược được đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ đơng tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng.

3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein

Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein và 100 μl dung dịch chuẩn bị mẫu như trên. Trong thí nghiệm này các mẫu protein lấy từ dịch protein sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Lắc đều và đun cách thủy ở 95ºC, 5 phút, để nguội.

3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng

Sau khi gel tập trung đơng, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ điện di, cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng. Lượng mẫu là 10 μl đưa vào các lỗ giếng.

Chú ý khơng để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng.

- Chạy điện di: Sau khi hồn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dịng điện đi qua. Dịng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V. Thơng thường, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta cĩ thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250.

- Nhuộm gel: Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên máy lắc. Thơng thường thời gian nhuộm khoảng 1 giờ.

- Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ trên gel.

KẾT LUẬN

Hiện nay việc tách chiết và tinh sạch protit đang gặp nhiều khĩ khăn, do đĩ con người đang hướng tới những phương pháp tách chiết đơn giản và hiệu quả hơn.

Vì thế việc nghiên cứu tìm hiểu các phương pháp tách chiết protit để phục vụ cho con người là một việc làm hữu ích đối với các ngành cơng nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi ích và gĩp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.

Sau một thời gian tìm tịi và nghiên cứu về đề tài “Nghiên cứu lí thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit” thì em đã thu được một số kết quả sau:

Khái quát sơ lược về protit: khái niệm, phân loại, cấu trúc và tính chất. Tìm hiểu và đưa ra một số phương pháp tách chiết hợp chất protit.