Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel

6. Đĩng gĩp của khĩa luận

2.4.4.2.2. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel

 Loại muối.

 Tinh sạch phân tử sinh học.  Xác định trọng lượng phân tử.

Như đã trình bày ở trên, gel chỉ thích hợp để tách các chất sinh học cĩ tính ưa nước trong dung dịch nước. Tuy nhiên đơi khi cũng sử dụng phương pháp này để tách các chất kỵ nước trong dung mơi hữu cơ (etanol, axeton, dimetyl sulfoxide, dimetyl forenemide, axetonitrile,v.v…).

2.4.4.2.3. Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel

 Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện mơi trường khắc nghiệt.

Sự phân tách cĩ thể được thực hiện khi cĩ sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehyđroclorit, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 37ºC hay trong phịng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm.

Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử cĩ cùng pI và dễ dàng khử muối.

 Nhược điểm

- Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài)

- Yêu cầu các cột cĩ kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu.

- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khĩ đạt được sản phẩm tinh khiết hồn tồn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.

2.4.4.3. Sắc ký ái lực hỡ trợ quá trình tinh chế protein

Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhĩm hĩa học chuyên biệt.

Các đặc tính đặc trưng của từng loại protein cĩ thể được tận dụng để giúp tinh sạch loại protein tương ứng được thuận tiện và hiệu quả hơn. Giả sử, nếu chúng ta biết một loại protein khi hoạt động liên kết đặc hiệu với ATP, thì cĩ thể dùng cột sắc ký mang vật liệu gắn kết ATP để phân tách protein đĩ. Chỉ cĩ protein liên kết với ATP mới được cột giữ lại, và cho phép hầu hết các loại protein khơng liên kết với ATP được chảy trơi qua cột. Kỹ thuật tinh sạch này được gọi là sắc ký ái lực. Cĩ nhiều hợp chất khác nhau cĩ thể được sử dụng để gắn kết với cột và giúp quá trình tinh sạch protein dễ dàng và hiệu quả hơn. Các hợp chất này bao gồm cả các trình tự ADN (để tinh sạch protein liên kết ADN) hoặc thậm chí là một loại protein để tinh sạch một loại protein khác được biết hoặc được mong đợi cĩ tương tác phân tử với loại protein trên. Như vậy, để bắt đầu tinh sạch một loại protein nào đĩ, cần phải cĩ những hiểu biết cơ bản về loại protein đĩ và tìm cách khai thác, ứng dụng các đặc tính cĩ nĩ cho quá trình tách chiết và tinh sạch.

Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch. Trong phương pháp này, người ta gắn kháng thể đặc hiệu với protein đích lên vật liệu làm cột sắc ký. Trong trường hợp lý tưởng, loại kháng thể này chỉ liên kết đúng với loại protein cần quan tâm cịn cho phép tất cả các loại protein khác chảy trơi qua cột. Loại protein liên kết sau đĩ sẽ được thu hồi (hồi lưu) bằng cách sử dụng dung dịch muối hoặc đơi khi là các dung dịch chất tẩy nhẹ chảy qua cột. Khĩ khăn cơ bản gặp phải đối với phương pháp này là đơi khi liên kết giữa kháng thể và protein khá bền vững đến mức phải gây biến tính protein mới thu hồi được sản phẩm. Khác với ADN, protein sau khi biến tính thường khơng cĩ khả năng hồi tính, vì vậy protein thu được theo cách này nhiều khi ở dạng khơng hoạt động chức năng và mất đi giá trị sử dụng trong nghiên cứu.

2.4.4.4. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE

Để đánh giá quá trình tinh sạch protein cĩ hiệu quả hay khơng, ngồi cách xác định hoạt tính đặc trưng của protein cĩ tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, cịn một cách là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực hiện nhờ kỹ thuật điện di.

Điện di là một kĩ thuật để phân tích các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện tích. Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel đĩng vai trị là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau để phát hiện vị trí các phân tử trên gel sau khi điện di.

Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamit) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau) kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỌC GEL

3.1. Phương pháp trích ly enzyme

Emzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, để phá vỡ tế bào enzyme thường sử dụng các phương pháp như:

Phương pháp cơ học: Nghiền bi, nghiền cĩ chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hĩa bằng thiết bị đồng hĩa…

Phương pháp vật lý trong tế bào: Các enzyme này thường khơng cĩ khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp vật lý như dùng sĩng siêu âm.

Phương pháp hĩa học: dùng các loại dung mơi, butylic, axeton, glyxerol, etylaxetat.

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protease

- Tỷ lệ dung mơi với mẫu: mẫu mơ động vật cĩ nhiều thành phần khác nhau, ngồi protein của enzyme cịn cĩ các thành phần enzyme khác, đặc biệt là hàm lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, sử dụng dung mơi ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly được những protein - protease ra ngồi mơ nhiều hơn.

- Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biến tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay bị phân hủy. Thường nhiệt độ trích ly protease từ mơ động vật ở nhiệt độ khơng quá 5ºC.

- Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và cĩ sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác cĩ trong mơ mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hịa tan của enzyme từ mơ tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mơ mẫu cần phụ thuộc loại mơ mẫu và dung mơi.

- pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình trích ly, cĩ những enzyme axit cần phải trích ly ở mơi trường axit và ngược lại các enzyme kiềm thì phải trích ly trong mơi trường bazơ.

3.2. Phương pháp làm sạch enzyme

Để loại bỏ những thành phần khơng phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp sau:

3.2.1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc

Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme axit và bền nhiệt. Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70ºC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme khơng bền nhiệt và khơng chịu pH thấp sẽ bị biến tính.

Sau đĩ, bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần khơng phải là enzyme mà ta mong muốn.

3.2.2. Phương pháp kết tủa phân đoạn

Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thường sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngồi muối (NH4)2SO4 ra, cịn cĩ thể sử dụng một số dung mơi hữu cơ như etanol, axeton để kết tủa protein.

Dựa vào đặc tính phân cực của protein để lựa chọn các phương pháp như:  Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography).

 Sắc ký giấy.

 Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography).  Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC).

Dựa vào kính thước protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography)

Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography).

3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel 3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel

3.3.1.1. Chọn lựa gel

Chủ yếu người ta sử dụng gel trong 2 trường hợp: Loại bỏ phân tử cĩ trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và axit nucleic. Cỡ hạt hay sử dụng 100-200 mesh (10-40 m) hay 200 - 400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài.

3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản

Gel dextran và acrylamit thương mại ở dạng bột khơng ngậm nước do vậy phải cho chúng ngậm nước (cho nở) trước khi sử dụng. Quá trình này thường khoảng 3-4 giờ ở 20ºC đối với loại gel cĩ liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Cĩ thể rút ngắn thời gian nở trong nước ở nhiệt độ cao (cĩ thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thương mại ở dạng ngậm nước, do vậy khơng cần cho nở. Trước khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nước) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đĩ bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%).

3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu

3.3.2.1. Dựng cột lọc gel

Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm cĩ tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100. Để tách nhĩm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm cĩ pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH 10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo khơng làm mất hoạt tính của chất cần tách.

3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu

Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị lỗng. Để tách nhĩm chất cĩ thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa một lượng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dịng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dịng chảy tự do. Thơng thường đối với gel cĩ kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm2

mặt cắt ngang (15-25 ml/h), cịn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h). Dịng chảy cĩ thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dịng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thơng thường là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng cĩ tác giả sử dụng cách nén ngược từ dưới lên.

3.4. Phương pháp tinh sạch

3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tơm sú

Xay đầu tơm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung mơi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 - 4ºC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4ºC, tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC).

Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi và loại dung mơi chiết với mẫu. Từ đĩ chọn dung mơi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme.

3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease

Sử dụng các tác nhân gây kết tủa thuận nghịch protein trong dịch chiết nội tạng và đầu tơm là: cồn 96º, axeton và muối amoni sunfat.

Tiến hành tủa dịch chiết bằng các tác nhân trên với tỷ lệ dịch chiết/dung mơi khác nhau ở điều kiện 0 – 4ºC, thời gian tủa 60 phút, ly tâm lạnh ở 4ºC với

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa và tác nhân tủa từ đĩ chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa dịch chiết thu protease.

3.4.3. Bố trí thí nghiệm

Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của protease từ mẫu đầu và nội tạng tơm sú được tiến hành theo sơ đồ bố trí như sau:

Nghiền mịn

Ly tâm dịch chiết enzyme thơ

Ly tâm thu chế phẩm thơ

Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease

Tơm sú (đầu hoặc nội tạng)

Chiết dịch enzyme thơ

Dịch chiết enzyme thơ (DC)

Tủa dịch chiết

Chế phẩm thơ (CPT)

Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Xác định trọng lượng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme CPT: nhiệt độ, pH, % muối ăn.

Xác định hoạt tính protease Xác định hàm lượng protein

3.4.3.1. Xác định dung mơi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tơm sú thích hợp đầu tơm sú thích hợp

Dung mơi chiết cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành chiết tách protease từ mẫu nội tạng và đầu tơm sú bằng các dung mơi: nước cất, muối sinh lý, đệm photphat 0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/dung mơi (w/v) khác nhau, được giữ ở ≤ 4ºC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên mấy khuấy từ trong 40 phút. Ly tâm lạnh ở 4ºC với tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết.

Nước cất: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5.

Nước muối sinh lý: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Đệm photphat 0,1M pH 7,0: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.

Đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5: tỷ lệ mẫu/dung mơi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10.

Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng dịch chiết, so sánh, chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung mơi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí TN như sau:

Sơ đồ 3.2

Nội tạng và đầu tơm sú (đã nghiền) Hịa với các dung mơi

Xác định hoạt tính proetease của DC Xác định hàm lượng protein của DC

Chọn ra dung mơi và tỷ lệ chiết thích hợp Nước cất

Tỷ lệ 1/1-5 Tỷ lệ 1/1-10 (w/v)Đệm photphat

Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-10 Muối sinh lý

3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC

Mỗi loại tác nhân tủa thường cĩ khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4ºC. Ly tâm lạnh 4ºC, tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hịa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định (một lượng ít nhất cĩ thể).

Tủa bằng etanol (cồn 96º) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn