6. Đĩng gĩp của khĩa luận
3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng
Sau khi gel tập trung đơng, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ điện di, cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng. Lượng mẫu là 10 μl đưa vào các lỗ giếng.
Chú ý khơng để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng.
- Chạy điện di: Sau khi hồn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dịng điện đi qua. Dịng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V. Thơng thường, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta cĩ thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250.
- Nhuộm gel: Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên máy lắc. Thơng thường thời gian nhuộm khoảng 1 giờ.
- Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ trên gel.
KẾT LUẬN
Hiện nay việc tách chiết và tinh sạch protit đang gặp nhiều khĩ khăn, do đĩ con người đang hướng tới những phương pháp tách chiết đơn giản và hiệu quả hơn.
Vì thế việc nghiên cứu tìm hiểu các phương pháp tách chiết protit để phục vụ cho con người là một việc làm hữu ích đối với các ngành cơng nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi ích và gĩp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
Sau một thời gian tìm tịi và nghiên cứu về đề tài “Nghiên cứu lí thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit” thì em đã thu được một số kết quả sau:
Khái quát sơ lược về protit: khái niệm, phân loại, cấu trúc và tính chất. Tìm hiểu và đưa ra một số phương pháp tách chiết hợp chất protit.
Đưa ra được phương pháp và sơ đồ tách chiết enzym protease từ nội tạng và đầu tơm sú.
Do điều kiện về thời gian cũng như năng lực nghiên cứu của bản thân cịn hạn chế nên em chỉ tìm hiểu và đưa ra được một số phương pháp tách chiết protit, nếu cĩ điều kiện thì em sẽ phát triển đề tài của mình hơn ở phần thực nghiệm.
Chính vì vậy trong bài khĩa luận của em khơng thể tránh khỏi những thiếu sĩt. Bản thân em rất mong nhận được sự gĩp ý của các thầy cơ và các bạn sinh viên để đề tài của em được hồn thiện hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trịnh Đình Chính- Nguyễn thị Bích Tuyết, 2008. Giáo trình Hợp chất tự nhiên, ĐH Sư phạm.
2. GS. Nguyễn Văn Đàn, DS. Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hĩa học cây thuốc, NXB Y học TPHCM.
3. Lê Văn Đăng, 2005. Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.
4. Nguyễn Văn Nam, 2007. Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tơm sú, Luận văn tốt nghiệp ngành cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cơ lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP HCM.
6. Kurt Ranredath, 1974. Sắc ký lớp mỏng, NXB Y học.
7. PGS. TS. Đỗ Đình Rãng, 2012. Hĩa học hữu cơ 3, NXB Giáo dục Hà Nội.
8. Phạm Trương Thị Thọ, 1997. Giáo trình Hĩa học các hợp chất tự nhiên. 9. PGS. TS. Thái Dỗn Tĩnh, 2008. Cơ sở Hĩa học hữu cơ 3, NXB Khoa
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ... 1
1. Lý do chọn đề tài ... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ... 2
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ... 2
5. Phương pháp nghiên cứu ... 2
6. Đĩng gĩp của khĩa luận ... 3
NỘI DUNG ... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT ... 4
1.1. Giới thiệu về protit ... 4
1.2. Phân loại protit ... 4
1.2.1. Protein ... 4
1.2.1.1. Protein tan trong nước ... 4
1.2.1.2. Protein khơng tan trong nước ... 5
1.2.2. Proteit ... 7
1.3. Cấu trúc của protit ... 7
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất ... 8 1.3.2. Cấu trúc bậc hai ... 9 1.3.2.1.Cấu trúc vịng xoắn α ... 10 1.2.3.2.Cấu trúc nếp gấp β ... 10 1.3.3. Cấu trúc bậc ba ... 11 1.3.4. Cấu trúc bậc bốn ... 12 1.4. Tính chất của protit ... 13 1.4.1. Tính chất lưỡng tính ... 13 1.4.2. Phản ứng màu ... 13 1.4.3. Tính tan ... 14
1.4.4. Sự biến tính của protit ... 14
1.4.5. Sự kết tủa protit ... 15
CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH TINH SẠCH
PROTEIN... 17
2.1. Chuẩn bị dịch protein thơ ... 17
2.2. Ổn định protein trong dịch chiết thơ ... 17
2.3. Các phương pháp tủa protein ... 18
2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau. ... 18
2.3.2. Tủa bằng dung mơi hữu cơ ... 18
2.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện ... 19
2.3.4. Tủa bằng các loại polyme ... 19
2.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân ... 19
2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein ... 19
2.4.1. Mục tiêu ... 19
2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein ... 20
2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein. .... 21
2.4.3. Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein ... 21
2.4.4. Tinh sạch protein ... 22
2.4.4.1. Sắc ký trao đổi ion ... 23
2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion ... 24
2.4.4.2. Sắc ký lọc gel ... 24
2.4.4.2.1. Kỹ thuật tách chiết bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 25
2.4.4.2.2. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel ... 27
2.4.4.2.3. Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel ... 27
2.4.4.3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chế protein ... 28
2.4.4.4. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE ... 29
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ ... 30
3.1. Phương pháp trích ly enzyme ... 30
3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ... 31
3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 32
3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel ... 32
3.3.1.1. Chọn lựa gel ... 32
3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản ... 32
3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ... 32
3.3.2.1. Dựng cột lọc gel ... 32
3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu ... 33
3.4. Phương pháp tinh sạch... 33
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tơm sú ... 33
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease... 33
3.4.3. Bố trí thí nghiệm... 34
3.4.3.1. Xác định dung mơi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tơm sú thích hợp ... 36
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC ... 37
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ... 38
3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 38
3.4.5. Thí nghiệm điện di enzyme protease sau tinh sạch ... 39
3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di ... 40
3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein ... 40
3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng ... 40
KẾT LUẬN ... 42
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EDTA : Etilen Điamin TetraAxetic
ATP: Adenosin TriPhotphat
ADN: Axit Deoxyribonucleic
ARN: Axit Ribonucleic
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis.
HIC: Hyđrophobic Interaction Chromatography
DC: dịch chiết
CPT: chế phẩm thơ
TN: thí nghiêm
DCT: dịch chiết thơ
DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Hình Trang
Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Cấu trúc bậc 2 của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Cấu trúc vịng xoắn α ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.5. Cấu trúc bậc ba của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.6. Cấu trúc bậc bốn của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.1. Thiết bị điện di đứng SDS-PAGE ... Error! Bookmark not defined. Bảng
Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch proteinError! Bookmark not defined. Sơ đồ
Sơ đồ 2.1. Quá trình tinh sạch protein ... Error! Bookmark not defined.
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ionError! Bookmark not defined.
Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease Error! Bookmark not defined.
Sơ đồ 3.2. Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng DCError! Bookmark not defined.