6. Đĩng gĩp của khĩa luận
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC
Mỗi loại tác nhân tủa thường cĩ khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4ºC. Ly tâm lạnh 4ºC, tốc độ 6.000 vịng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hịa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định (một lượng ít nhất cĩ thể).
Tủa bằng etanol (cồn 96º) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8.
Tủa bằng axeton được làm lạnh, nồng độ tủa theo nồng độ phần trăm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75.
Tủa bằng muối (NH4)2SO4, nồng độ tủa theo nồng độ muối bão hịa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75.
Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng CPT, so sánh, chọn ra nồng độ tủa thích hợp và loại tác nhân tủa thích hợp.
Sơ đồ 3.2:
Kết tủa bằng các tác nhân với nồng độ tủa khác nhau
Xác định hoạt tính protease của CPT Xác định hàm lượng protein của CPT Cồn 96º Tỷ lệ 1/1-8 (v/v) Axeton Nồng độ 50-75% (NH4)2SO4 Nồng độ 50-75% Dịch chiết enzym từ nội tạng
và đầu tơm sú (đã nghiền)
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel
Tách các protein của protease trong CPT mẫu đầu và mẫu nội tạng của tác nhân tủa cồn, axeton và tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp bằng phương pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp.
Các thơng số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp sau:
Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5.000 – 100.000 Da). Cột : 30 x 1,5 cm
Flow adaptor (bộ chuyển đổi dịng chạy) : 1,5 cm. Tốc độ dịng : 0,14 ml/phút.
Vmẫu : 1ml.
Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn.
A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sĩng 280 nm.
3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel
Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm photphat 0.1M pH 7.0 đựng trong cốc. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, khơng cần phải khuấy, hãy để ổn định 12 giờ và 20ºC trong suốt quá trình hyđrat hĩa.
Sau khi quá trình hyđrat xảy ra hồn tồn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân khơng cĩ gắn với vịi hút chân khơng. Khử khí của dung dịch trong khoảng 10-15 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ (xoay) bình.
Để gel ổn định cho đến khi 90-95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại cơng việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phễu đổ gel vào cột, đĩng lỗ thốt của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rĩt đều dung dịch gel vào cột thành một dịng di chuyển nhẹ tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 đến 5 cm, mở khĩa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khĩa đầu ra (outlet) của cột và gắn flow adaptor. Mở khĩa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với
thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy. Đĩng đầu ra của cột và điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách dùng xylanh bơm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.
Chuẩn bị mẫu: mẫu chạy sắc ký phải sạch (khơng bị nhiễm bẩn và khơng cĩ các hạt rắn); hịa tan hồn tồn trong dung dịch đệm. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng của cột.
Dùng xylanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký, dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sĩng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mền LP-Data View trên máy tính.
Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Thu các fraction chứa dịch protease đã tinh sạch qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano, pH 7.0 và hàm lượng protein theo phương pháp Bradford.
3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di
Khuơn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di phải được rửa sạch và lau khơ bằng cồn. Sau đĩ ráp thành khuơn để chuẩn bị đổ gel.
Đổ gel phân tích :
Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10%
Dung dịch được trộn bằng máy khuấy từ, sau đĩ cho 4 μl TEMED vào dung dịch, khuấy đều và nhanh chĩng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel. Gel sẽ được bơm đến vạch cách lược là 0,5 cm. Chú ý khơng bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ đơng lại trong 20-30 phút.
Đổ gel tập trung
Gel tập trung thường được pha ở nồng độ 4%. Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nước phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm.
Tương tự gel phân tích, sau khi cho 4 μl TEMED vào, dung dịch phải được đưa nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nước trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược được đưa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ đơng tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng.
3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein
Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein và 100 μl dung dịch chuẩn bị mẫu như trên. Trong thí nghiệm này các mẫu protein lấy từ dịch protein sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Lắc đều và đun cách thủy ở 95ºC, 5 phút, để nguội.
3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng
Sau khi gel tập trung đơng, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ điện di, cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng. Lượng mẫu là 10 μl đưa vào các lỗ giếng.
Chú ý khơng để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng.
- Chạy điện di: Sau khi hồn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dịng điện đi qua. Dịng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V. Thơng thường, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta cĩ thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250.
- Nhuộm gel: Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên máy lắc. Thơng thường thời gian nhuộm khoảng 1 giờ.
- Tẩy màu: Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ trên gel.
KẾT LUẬN
Hiện nay việc tách chiết và tinh sạch protit đang gặp nhiều khĩ khăn, do đĩ con người đang hướng tới những phương pháp tách chiết đơn giản và hiệu quả hơn.
Vì thế việc nghiên cứu tìm hiểu các phương pháp tách chiết protit để phục vụ cho con người là một việc làm hữu ích đối với các ngành cơng nghệ sản xuất enzyme đem lại lợi ích và gĩp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người.
Sau một thời gian tìm tịi và nghiên cứu về đề tài “Nghiên cứu lí thuyết về phương pháp tách chiết hợp chất protit” thì em đã thu được một số kết quả sau:
Khái quát sơ lược về protit: khái niệm, phân loại, cấu trúc và tính chất. Tìm hiểu và đưa ra một số phương pháp tách chiết hợp chất protit.
Đưa ra được phương pháp và sơ đồ tách chiết enzym protease từ nội tạng và đầu tơm sú.
Do điều kiện về thời gian cũng như năng lực nghiên cứu của bản thân cịn hạn chế nên em chỉ tìm hiểu và đưa ra được một số phương pháp tách chiết protit, nếu cĩ điều kiện thì em sẽ phát triển đề tài của mình hơn ở phần thực nghiệm.
Chính vì vậy trong bài khĩa luận của em khơng thể tránh khỏi những thiếu sĩt. Bản thân em rất mong nhận được sự gĩp ý của các thầy cơ và các bạn sinh viên để đề tài của em được hồn thiện hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trịnh Đình Chính- Nguyễn thị Bích Tuyết, 2008. Giáo trình Hợp chất tự nhiên, ĐH Sư phạm.
2. GS. Nguyễn Văn Đàn, DS. Nguyễn Viết Tựu, 1985. Phương pháp nghiên cứu hĩa học cây thuốc, NXB Y học TPHCM.
3. Lê Văn Đăng, 2005. Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TPHCM.
4. Nguyễn Văn Nam, 2007. Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tơm sú, Luận văn tốt nghiệp ngành cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007. Phương pháp cơ lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP HCM.
6. Kurt Ranredath, 1974. Sắc ký lớp mỏng, NXB Y học.
7. PGS. TS. Đỗ Đình Rãng, 2012. Hĩa học hữu cơ 3, NXB Giáo dục Hà Nội.
8. Phạm Trương Thị Thọ, 1997. Giáo trình Hĩa học các hợp chất tự nhiên. 9. PGS. TS. Thái Dỗn Tĩnh, 2008. Cơ sở Hĩa học hữu cơ 3, NXB Khoa
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ... 1
1. Lý do chọn đề tài ... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ... 2
3. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu ... 2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu ... 2
5. Phương pháp nghiên cứu ... 2
6. Đĩng gĩp của khĩa luận ... 3
NỘI DUNG ... 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN SƠ LƯỢC VỀ PROTIT ... 4
1.1. Giới thiệu về protit ... 4
1.2. Phân loại protit ... 4
1.2.1. Protein ... 4
1.2.1.1. Protein tan trong nước ... 4
1.2.1.2. Protein khơng tan trong nước ... 5
1.2.2. Proteit ... 7
1.3. Cấu trúc của protit ... 7
1.3.1. Cấu trúc bậc nhất ... 8 1.3.2. Cấu trúc bậc hai ... 9 1.3.2.1.Cấu trúc vịng xoắn α ... 10 1.2.3.2.Cấu trúc nếp gấp β ... 10 1.3.3. Cấu trúc bậc ba ... 11 1.3.4. Cấu trúc bậc bốn ... 12 1.4. Tính chất của protit ... 13 1.4.1. Tính chất lưỡng tính ... 13 1.4.2. Phản ứng màu ... 13 1.4.3. Tính tan ... 14
1.4.4. Sự biến tính của protit ... 14
1.4.5. Sự kết tủa protit ... 15
CHƯƠNG 2: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG QUÁ TRÌNH TINH SẠCH
PROTEIN... 17
2.1. Chuẩn bị dịch protein thơ ... 17
2.2. Ổn định protein trong dịch chiết thơ ... 17
2.3. Các phương pháp tủa protein ... 18
2.3.1. Tủa bằng muối Sunfat ở các nồng độ khác nhau. ... 18
2.3.2. Tủa bằng dung mơi hữu cơ ... 18
2.3.3. Tủa bằng điểm đẳng điện ... 19
2.3.4. Tủa bằng các loại polyme ... 19
2.3.5. Tủa bằng chất đa điện phân ... 19
2.4. Phương pháp tách chiết, tinh sạch protein ... 19
2.4.1. Mục tiêu ... 19
2.4.2. Sơ đồ tinh sạch protein ... 20
2.4.2. Giới thiệu các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch protein. .... 21
2.4.3. Sự lựa chọn phương pháp chiết tách và tinh sạch protein ... 21
2.4.4. Tinh sạch protein ... 22
2.4.4.1. Sắc ký trao đổi ion ... 23
2.4.4.1.1. Kỹ thuật trong sắc ký trao đổi ion ... 24
2.4.4.2. Sắc ký lọc gel ... 24
2.4.4.2.1. Kỹ thuật tách chiết bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 25
2.4.4.2.2. Một số ứng dụng của phương pháp lọc gel ... 27
2.4.4.2.3. Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel ... 27
2.4.4.3. Sắc ký ái lực hỗ trợ quá trình tinh chế protein ... 28
2.4.4.4. Phương pháp điện di trên Gel SDS-PAGE ... 29
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ ... 30
3.1. Phương pháp trích ly enzyme ... 30
3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ... 31
3.3. Phương pháp tách chiết enzyme protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 32
3.3.1. Chọn lựa và chuẩn bị gel ... 32
3.3.1.1. Chọn lựa gel ... 32
3.3.1.2. Chuẩn bị gel và bảo quản ... 32
3.3.2. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ... 32
3.3.2.1. Dựng cột lọc gel ... 32
3.3.2.2. Chuẩn bị mẫu ... 33
3.4. Phương pháp tinh sạch... 33
3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tơm sú ... 33
3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease... 33
3.4.3. Bố trí thí nghiệm... 34
3.4.3.1. Xác định dung mơi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tơm sú thích hợp ... 36
3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC ... 37
3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ... 38
3.4.4.1. Kỹ thuật tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel ... 38
3.4.5. Thí nghiệm điện di enzyme protease sau tinh sạch ... 39
3.4.5.1. Chuẩn bị hộp điện di ... 40
3.4.5.2. Chuẩn bị mẫu protein ... 40
3.4.5.3. Đưa mẫu vào các giếng ... 40
KẾT LUẬN ... 42
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
EDTA : Etilen Điamin TetraAxetic
ATP: Adenosin TriPhotphat
ADN: Axit Deoxyribonucleic
ARN: Axit Ribonucleic
SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis.
HIC: Hyđrophobic Interaction Chromatography
DC: dịch chiết
CPT: chế phẩm thơ
TN: thí nghiêm
DCT: dịch chiết thơ
DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Hình Trang
Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Cấu trúc bậc 2 của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Cấu trúc vịng xoắn α ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.4. Cấu trúc nếp gấp β ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.5. Cấu trúc bậc ba của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.6. Cấu trúc bậc bốn của protein ... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.1. Thiết bị điện di đứng SDS-PAGE ... Error! Bookmark not defined. Bảng
Bảng 2.1. Các phương pháp phân tách cơ bản trong tinh sạch proteinError! Bookmark not defined. Sơ đồ
Sơ đồ 2.1. Quá trình tinh sạch protein ... Error! Bookmark not defined.
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết bằng phương pháp sắc ký trao đổi ionError! Bookmark not defined.
Sơ đồ 3.1. Quy trình tách chiết enzyme protease Error! Bookmark not defined.
Sơ đồ 3.2. Xác định hoạt tính protease và hàm lượng protein của từng DCError! Bookmark not defined.