đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --- --- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC ĐÁNH GIÁ CHỈ TIÊU VI SINH VÀ HÀN THE TRONG CHẢ LỤA TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ SẢN XUẤT Ở CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. HUỲNH XUÂN PHONG SINH VIÊN THỰC HIỆN TRỊNH THỊ NGỌC DIỆP MSSV: 3108482 LỚP: VSV K36 Cần Thơ – Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC ĐÁNH GIÁ CHỈ TIÊU VI SINH VÀ HÀN THE TRONG CHẢ LỤA TẠI MỘT SỐ CƠ SỞ SẢN XUẤT Ở CẦN THƠ CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. HUỲNH XUÂN PHONG SINH VIÊN THỰC HIỆN TRỊNH THỊ NGỌC DIỆP MSSV: 3108482 LỚP: VSV K36 Cần Thơ - Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. Huỳnh Xuân Phong SINH VIÊN THỰC HIỆN Trịnh Thị Ngọc Diệp DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ ---------------------Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua. Xin được bày tỏ lòng biết ơn sự hướng dẫn tận tình của Cán bộ hướng dẫn - ThS. Huỳnh Xuân Phong. Xin gửi lời biết ơn chân thành đến các thầy cô cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học khóa 36, ThS Võ Văn Song Toàn và ThS Nguyễn Thị Pha. Sự hỗ trợ nhiệt tình của các thầy cô đã giúp cho chúng em hoàn thành tốt quá trình học tập của mình. Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm và quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013 Sinh viên thực hiện Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT TÓM TẮT ---------Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết, được tiếp cận với những thực phẩm an toàn là nhu cầu cơ bản đối với mỗi con người. Với mục đích khảo sát và đánh giá mức độ an toàn của chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” đã được thực hiện. Trong nghiên cứu này, chỉ tiêu hàn the và các chỉ tiêu vi sinh theo quy định của Bộ Y tế đã được tiến hành khảo sát. Tổng cộng có 5 mẫu được tiến hành kiểm tra. Kết quả cho thấy, chỉ có 1 mẫu đạt yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, men mốc, Coliforms, E.coli. Cả 5 mẫu đều cho kết quả âm tính với E.coli. Có 4 mẫu có chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, men mốc, Coliforms vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đối với chỉ tiêu hàn the thì có một mẫu cho kết quả dương tính. Từ khoá: chả lụa, hàn the, IMViC, vi sinh vật gây bệnh. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học i Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC ---------Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT .................................................................................................................. i MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................... iv DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................... 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3 2.1. Giới thiệu về chả lụa ................................................................................. 3 2.2. Tổng quan về hàn the ................................................................................ 5 2.3. Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm ....................................... 6 2.4. Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm từ thịt .............................................................................................................. 6 2.4.1. Coliforms tổng số ................................................................................ 6 2.4.2. Escherichia coli ................................................................................... 7 2.4.3. Vi khuẩn hiếu khí ................................................................................ 9 2.4.4. Nấm men và nấm mốc ......................................................................... 9 2.5. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt ....... 10 3.1. Phương tiện thí nghiệm ........................................................................... 11 3.1.1. Mẫu thí nghiệm ................................................................................. 11 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 11 3.1.3. Thời gian thực hiện ............................................................................ 11 3.1.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT 3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 14 3.2.1. Phương pháp thu mẫu ........................................................................ 14 3.2.2. Định tính hàn the ................................................................................ 14 3.2.2.1. Nguyên tắc.............................................................................. 14 3.2.3. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh .............................................................. 16 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 26 4.1. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1 ................................... 26 4.2. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 2 ................................... 31 4.3. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 3 ................................... 33 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 36 5.1. Kết luận................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ................................................................................................... 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 37 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... Phụ lục 1. Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm Phụ lục 2. Các tiêu chuẩn sử dụng Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG ---------Bảng 1. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt ............. 10 Bảng 2. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1 ....................................... 26 Bảng 3. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1 .................................. 26 Bảng 4. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 1 ......................... 28 Bảng 5. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 2 ....................................... 31 Bảng 6. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 2 .................................. 31 Bảng 7. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 2 ......................... 32 Bảng 8. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 3 ....................................... 33 Bảng 9. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 3 .................................. 33 Bảng 10. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 3 ....................... 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH ---------Hình 1. Quy trình chế biến chả lụa tổng quát ............................................................... 3 Hình 2. Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử ............................................... 7 Hình 3. Hình dạng vi khuẩn E. coli ............................................................................. 7 Hình 4. Sự đổi màu của giấy nghệ với hàn the đối chứng........................................... 16 Hình 5. Các bước pha loãng mẫu ............................................................................... 17 Hình 6. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường Endo ................................................... 19 Hình 7. Thử nghiệm indole ........................................................................................ 20 Hình 8. Thử nghiệm citrate ........................................................................................ 20 Hình 9. Thử nghiệm Methyl Red ............................................................................... 21 Hình 10. Thử nghiệm VP ........................................................................................... 21 Hình 11. Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA ............................. 24 Hình 12. Khuẩn lạc men, mốc trên môi trường YDC ................................................. 24 Hình 13. Mẫu chả lụa có hàn the làm đổi màu giấy nghệ ........................................... 27 Hình 14. Thử nghiệm IMViC .................................................................................... 27 Hình 15. Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí .................................................................... 29 Hình 16. Khuẩn lạc men mốc .................................................................................... 29 Hình 17. Khuẩn lạc Coliforms ................................................................................... 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học v Đề cương Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ---------VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm SCA Simmons citrate agar MR-VP Methyl Red – Voges Proskauer MR Methyl Red VP Voges Proskauer PCA Plate Count Agar YDC Yeast extract Dextrose – Chloramphenicol TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TSVSVHK Tổng số vi sinh vật hiếu khí CFU Colony forming unit Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Xã hội càng phát triển, nhu cầu vật chất và tinh thần sẽ cao và đa dạng hơn, trong đó, các yêu cầu về giá trị dinh dưỡng, vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) được đặc biệt chú trọng. Bởi thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh dưỡng cho con người phát triển, duy trì sự sống và lao động, mà cũng chính từ thực phẩm con người có thể bị ngộ độc nếu như không tuân thủ nghiêm nhặt những biện pháp đảm bảo VSATTP hữu hiệu trong sản xuất, chế biến và bảo quản. Gần đây, qua thanh, kiểm tra, các cơ quan chức năng đã phát hiện trong mứt có dòi; chân gà có vi khuẩn mủ xanh hay hàng ngàn tấn thịt (từ trâu, bò, heo, gà, dê, cừu...) đông lạnh đã hết hạn sử dụng, hôi thối nhưng vẫn được tái chế bằng hóa chất rồi bán ra thị trường, điều đó cho thấy chất lượng và VSATTP rất đáng quan ngại. Như đã được phản ánh trên các phương tiện thông tin đại chúng, có rất nhiều thực phẩm chứa hàm lượng chất gây độc hại đang lưu hành trên thị trường như nước mắm, hải sản tươi có urea, nước tương có chất 3-MCPD, da heo có thuốc tẩy, trứng gà và sữa chứa melamine; trái cây khô từ Trung Quốc bị nhiễm độc chì; hạt dưa, bột ớt, bột điều nhuộm phẩm màu công nghiệp có chứa Rhodamin B, xúc xích có chứa chất Polychlorobifenyls gây ung thư; bánh phở chứa formol, rau củ quả có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật, các loại chả, giò, nem chứa hàn the v.v… Hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên hơn, nhất là tại các bếp ăn tập thể. Theo số liệu báo cáo của Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), trong năm 2009, cả nước có tổng cộng 152 vụ ngộ độc thực phẩm, với 5212 ca ngộ độc và 35 trường hợp tử vong. Đến năm 2012, tổng số vụ ngộ độc thực phẩm đã tăng lên tới 168 vụ với 5541 ca ngộ độc và 34 trường hợp tử vong. Có rất nhiều nguyên nhân khiến thực phẩm bị nhiễm bẩn và độc, chẳng hạn như việc sử dụng tùy tiện phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông nghiệp, thủy hải sản; thậm chí sử dụng cả các chất bảo quản, phụ gia, phẩm màu công nghiệp, thuốc tẩy v.v… trong sản xuất, chế biến thức ăn đồ uống. Thêm vào đó, tại một số cơ sở, việc sản xuất chế biến thực phẩm được đặt cạnh cống rãnh, ao tù; dụng cụ lưu trữ, chế biến không đảm bảo vệ sinh. Yếu tố gây ngộ độc thực phẩm gồm cả độc tố tự nhiên, chất độc hóa học, vi sinh vật gây bệnh và độc tố của chúng. Trong đó, vi sinh vật gây bệnh và độc tố của chúng Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 1 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT thường là những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm tức thời. Theo số liệu báo cáo năm 2012 của 48 tỉnh/thành phố, đã giám sát được 12.295 mẫu, kết quả cho thấy thực phẩm ô nhiễm vi sinh vật chủ yếu là tổng số bào tử nấm mốc men (40%), Coliforms (30,8%), E.Coli (20,2%). Về ô nhiễm hóa học, ngoài các mẫu phát hiện có hàn the, độ ôi khét, vẫn còn có mẫu dương tính với DEHP. Những số liệu trên cho thấy tình hình VSATTP ở nước ta vẫn còn nhiều vấn đề, do vậy việc kiểm soát chất lượng VSATTP là thực sự cần thiết. Xuất phát từ tình hình trên, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” được thực hiện nhằm cung cấp thông tin về tình trạng vệ sinh an toàn trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ. 1.2. Mục tiêu của đề tài Đánh giá sự tồn tại của các vi sinh vật gây ngộ độc trong thực phẩm cũng như hàn the có trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về chả lụa Giò lụa, giò chả hay chả lụa (phương ngữ Nam bộ) là tên gọi của món ăn được làm từ hai nguyên liệu cơ bản là thịt nạc thăn lợn giã nhuyễn kết hợp với nước mắm ngon, gói trong lá chuối và luộc chín. Chả lụa là một sản phẩm truyền thống rất được yêu thích ở nước ta, được chế biến công phu và có hương vị đặc biệt, chả lụa giòn và thơm đậm mùi thịt tươi luộc cộng với mùi đặc trưng của lá chuối tươi được luộc chín. Vì đây là một món ăn được dùng ngay mà không qua xử lý nhiệt nên vấn đề vệ sinh rất được quan tâm. Hơn nữa, để chả lụa giòn, dai và giữ được lâu người sản xuất thường sử dụng hàn the - một chất bị cấm sử dụng trong thực phẩm - trong quá trình sản xuất, chế biến và điều này làm tăng sự lo ngại khi sử dụng chả lụa. 2.1.1. Quy trình chế biến chả lụa Nguyên liệu Xử lý Xay Phối trộn Vào khuôn Làm chín Bao gói Chả lụa Hình 1. Quy trình chế biến chả lụa tổng quát Muốn cho chả ngon, béo, người ta cho vào xay chung với thịt một lượng mỡ heo tới 40%, rồi trộn đường, bột năng, bột ngọt, hàn the, bột nở, hương nước mắm và hương thịt, muối đỏ (để tạo màu hồng tự nhiên cho chả). Thiếu một trong những hóa Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT chất này, chả lụa sẽ không ngon, không dai, không giòn và không đẹp. Trong đó, hương thịt và hàn the chiếm một vị trí quan trọng bởi nếu thiếu hoặc ít, chả sẽ kém ngon hơn rất nhiều và nhanh hư. 2.1.2. Các hình thức hư hỏng thường gặp a. Sự thối rữa thịt Phân huỷ thối rữa là do sự biến đổi phức tạp, đặc trưng nhất xảy ra trong thịt. Trong đó sự phân huỷ protein đóng vai trò quan trọng trong sự phân huỷ thối rữa do hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra được chia làm 3 giai đoạn: – Quá trình thuỷ phân protein dưới tác dụng của enzim protease do vi sinh vật tiết ra tạo sản phẩm cuối cùng là acid amin. – Quá trình khử acid amin thành amoniac, rượu, H2S,… – Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân huỷ sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hoá. Tuỳ theo điều kiện thích hợp các chất đó có thể bị oxi hoá hoàn toàn cho các hợp chất vô cơ, các chất độc, hoặc có mùi hôi thối. Quá trình thối rữa càng sâu thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều, khi đó mô thịt có màu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, pH chuyển từ môi trường acid đến môi trường kiềm. Các chất khí có mùi khó chịu cũng thoát ra và tăng dần lên. b. Sự hoá nhầy bề mặt Đây là dạng hư hỏng thường gặp ở điều kiện bảo quản lạnh, nhất là đô ẩm của không khí cao, sự hoá nhầy gây ra bởi các giống trực khuẩn chịu lạnh, hiếu khí. Nhiệt độ tối ưu cho sự hoá nhầy là khoảng 2 – 10 oC, ẩm độ thấp thì thịt chóng mất nước. c. Sự lên men chua Thịt có thể bị chua do vi khuẩn lactic và nấm men nhất là đối với thịt có nhiều glycogen. Ban đầu các acid hữu cơ ức chế các vi khuẩn thối rữa phát triển, nhưng môi trường acid nấm mốc dễ phát triển. Nấm mốc hoạt động tạo thành amoniac và kiềm nitrua, những chất này là chất trung hoà môi trường acid tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây thối phát triển: Bacillus subtilis, Bacillus mesenterieus, Bacterium proteus. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT d. Thịt bị ôi Do sự biến đổi mỡ có trong thịt. Vi khuẩn phân giải mỡ thúc đây quá trình oxi hoá của mỡ, do tác dụng đồng thời của ánh sáng và không khí. Một số chất béo bị ôi sau khi bị thuỷ phân. Do các vi khuẩn: Pseudomonas, Achromobacter và một số nấm men. e. Sự mốc thịt Sự mốc thịt gây ra do sự phát triển của các loài nấm mốc trên bề mặt thịt. Quá trình mốc thường bắt đầu bằng sự xuất hiện trên bề mặt thịt những vết chấm hoặc những mạng tơ có màu trắng, về sau những vết đó lây lan dần và có màu sậm hơn. Nấm mốc phát triển trên bề mặt thịt không làm thịt bị biến đổi sâu sắc tức thời, nhưng nó chuẩn bị cho các vi khuẩn gây thối rữa hoạt động sau này. Khi nhiễm loại mốc đen dạng chùm Cladosporium gerbarum một loài nấm mốc bất toàn có khả năng mọc sâu vào những lớp bên trong. Khi ăn chúng có thể bị ngộ độc. 2.2. Tổng quan về hàn the Hàn the còn được gọi là borate sodium, có tên khoa học là sodium tetraborate, tên thương mại là borax, với công thức hóa học là Na2B4O7.10H2O, có trọng lượng phân tử 201,22; bột kết tinh thể màu trắng đục, vị hơi nồng, có mùi bốc mạnh. Hàn the không tan trong acid, tan ít trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, khi tan trong nước hoặc trong không khí ẩm, hàn the cũng có thể bị thuỷ phân tạo ra acid boric theo phản ứng: Na2B4O7 + 7H2O 4H3BO3 + 2NaOH. Khi sử dụng trong chế biến thực phẩm, hàn the có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc nên thực phẩm lâu bị hỏng. Với sản phẩm được chế biến từ thịt (protein), hàn the có tác dụng làm giảm tốc độ khử oxy của sắc tố myoglobine trong các sợi cơ của thịt nạc nên nó giữ và duy trì được màu sắc tươi nguyên thủy của thịt; bên cạnh đó hàn the còn có tác dụng giữ và làm tăng tính ổn định của các phân tử protein nên sản phẩm sẽ cứng, dai, giòn, đàn hồi (Trần Đáng, 2007). Các nghiên cứu độc học đã chỉ ra rằng hàn the có khả năng tích tụ trong các mô mỡ, thần kinh gây tác hại trên nguyên sinh chất và sự đồng hóa các chất albuminoit. Mặt khác, do hàn the kết hợp với mạch peptide của protein, cũng như liên kết cấu trúc mạng của glucid, hình thành các dẫn chất mà các men tiêu hóa protein và glucid khó Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT phân hủy được chúng, làm cản trở quá trình hấp thụ các protein, glucid gây hiện tượng khó tiêu, chán ăn, mệt mỏi cho người sử dụng. Hàn the còn có thể gây nhiễm độc mãn tính (do chúng tích luỹ trong cơ thể) gây ảnh hưởng tới tiêu hóa, hấp thu, chuyển hoá, ảnh hưởng không tốt tới chức năng thận với biểu hiện ăn mất ngon, giảm cân, tiêu chảy, động kinh, suy thận . Nguy cơ với sức khỏe cộng đồng và cá nhân của hàn the là rất cao. Do đó, Bộ Y tế đã ban hành Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001, không cho phép sử dụng hàn the làm phụ gia trong chế biến thực phẩm tại Việt Nam. 2.3. Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm theo các con đường (Đặng Kim Thoại, 2007): + Do môi trường không đảm bảo vệ sinh, vi sinh vật từ đất, nước bẩn, không khí, dụng cụ và các vật dụng khác nhiễm vào thực phẩm. + Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, thực phẩm không được nấu chín kỹ, ăn thức ăn sống. + Do bảo quản thực phẩm không hợp vệ sinh, không che đậy để côn trùng vật nuôi,… tiếp xúc vào thực phẩm mang theo vi khuẩn gây bệnh. + Do bản thân thực phẩm, gia súc, gia cầm bị bệnh từ trước khi giết mổ vì vậy thịt của chúng mang các vi trùng gây bệnh hoặc trong quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản chế biến, thực phẩm đã bị nhiễm vi khuẩn và các hoá chất độc hại khác. 2.4. Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm từ thịt 2.4.1. Coliforms tổng số Coliforms là những trực khuẩn đường ruột, Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, không có nha bào, có khả năng lên men đường lactose sinh hơi, sinh acid ở nhiệt độ 35 - 37 oC trong 24 - 48 giờ (Lê Thanh Mai et al., 2004). Hình dạng vi khuẩn Coliforms được thể hiện trong Hình 2. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 2. Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử (Nguồn: http://altered-states.net/barry/newsletter539/Ecoli.jpg&w=200&h=199&ei/, ngày 23/5/2013) Những vi khuẩn này có thể tồn tại ở trong ruột người, súc vật và cả ngoại cảnh gồm các loài sau (Lê Thanh Mai et al., 2004): - Escherichia coli - Klebsiela - Enterobacter - Citrobacter Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác (Trần Linh Thước, 2010). 2.4.2. Escherichia coli Hình 3. Hình dạng vi khuẩn E. coli (Nguồn: http://www.khoahoc.com.vn/timkiem/shewanella/index.aspx, ngày 23/5/20130) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Escherichia coli là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, hình que chiều dài khoảng 2.0 μm, không sinh bào tử, di động, Gram âm, vô hại, là một vi khuẩn bình thường của đường ruột ở người, động vật máu nóng và chim. Vì rằng, nó thường có mặt ở nồng độ rất cao (hàng triệu/g nội chất của ruột già) nên từ lâu nó đã được sử dụng như một vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân tiềm tàng và sự có mặt của các tác nhân gây bệnh đường ruột trong thực phẩm và nước. Hình dạng E. coli được thể hiện trong Hình 3. E. coli có khả năng thủy phân tryptophane trong môi trường sinh indol, không sinh acetoin (acetyl methylcarbinol), không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất (TCVN 5287:1994). Hầu hết các dòng E. coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hoá, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường tiêu hoá. Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và một số loài động vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007): - Enterobathogenic E. coli (EPEC) - Enterotocigenic E. coli (ETEC) - Enteroinvasive E. coli (EIEC) - Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC)/ verocytocin E. coli (VTEC) hay E. coli O157:H7 E. coli gây bệnh bằng cách phá hỏng các chức năng bình thường của hệ tiêu hoá. Các dòng E. coli khác nhau có thể tiết các chất độc. Những chất độc này xâm nhập và làm tổn thương các tế bào tiêu hoá. Vi khuẩn E. coli chỉ có thể gây bệnh khi chúng có khả năng vào trong đường ruột, có khả năng chống chịu được các điều kiện trong hệ tiêu hoá và có khả năng gây độc lên tế bào tiêu hoá. E. coli không cần có các gene đặc hiệu để vào trong đường ruột. E.coli vô hại thường có khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ ở đường ruột. Thức ăn và nước uống là con đường lý tường giúp E. coli xâm nhập vào trong đường ruột. Khi vào được bên trong, E. coli phải có khả năng gắn chặt vào tế bào của hệ tiêu hoá để gây bệnh. Một số tạo ra pili, một số tạo ra phức hợp intimin giúp chúng bám chặt vào thành tiêu hoá. Các dòng E. coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, các biểu hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ thuộc vào Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người (Nguyễn Tiến Dũng, 2007). Dòng ETEC bám vào hệ tiêu hoá và tiết độc tố. Chúng gây tiêu chảy không kèm theo sốt. Gây bệnh phổ biến trên trẻ sơ sinh chứa plasmid mã hóa một enterotoxin. Có 2 loại enterotoxin khác nhau được tìm thấy trong các dòng ETEC, cả 2 loại enterotoxin đều gây bệnh viêm ruột. Dòng EHEC bám vào tế bào nhờ một loại protein tên là intimin, chứa plasmid mã hóa một verotoxin tiết chất độc có tên là Shiga toxin gây triệu chứng bệnh lỵ, đôi khi gây bệnh thận. Độc chất của EHEC là một cytotoxin, nó phá huỷ tế bào ruột kết, có thể gây bệnh và ảnh hưởng đến chức năng thận. Điển hình nhất là dòng E.coli O157:H7. Một số dòng gây bệnh khác hiếm gặp khác của E. coli là: EIEC (Enteroinvasive E. coli) thường gây tổn thương đối với tế bào ruột già, thường gây tiêu chảy kèm sốt. EPEC (Enteropathogenic E. coli) thường gây tiêu chảy, tiêu chảy ra máu. Đây là nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại các nước kém phát triển.. 2.4.3. Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm (Trần Linh Thước, 2010). Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đáng giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm (Trần Linh Thước, 2010). 2.4.4. Nấm men và nấm mốc Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào và lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường được phân lập từ thực phẩm hoặc các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT bào tử hoặc khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. (Trần Linh Thước, 2010). Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. 2.5. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt Bảng 1. Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt (Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”) SẢN PHẨM LOẠI VI SINH VẬT GIỚI HẠN VI SINH VẬT (trong 1g hoặc 1mL sản phẩm) Thịt và sản phẩm thịt đóng gói TSVSVHK Coliforms 10 50 E. coli Không có S. aureus Cl. perfringens 10 10 Cl. botuliniums Không có Salmonella Không có Listeria monocytogenes Không có TSVSVHK Coliforms 10 50 E. coli Không có S. aureus 10 Cl. perfringens Salmonella 10 Không có Listeria monocytogenes Không có Thịt và sản phẩm thịt không đóng gói 4 2 5 2 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện thí nghiệm 3.1.1. Mẫu thí nghiệm Gồm 5 loại mẫu chả lụa mua từ 5 cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn thành phố Cần Thơ. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.3. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013. 3.1.4. Vật liệu nghiên cứu a. Môi trường và thuốc thử Dung dịch pha loãng: - NaCl 9g - Nước cất 1000mL Môi trường Endo (Lê Thanh Mai et al., 2004) - Peptone 10g - Fucshin kiềm (C20H20CIN3) 0.3g - Lactose (C12H22O11) 10g - K2HPO4 2.5g - Na2SO3 3.3g - Agar 15g - Nước cất 1000mL Pha chế: Hòa tan các chất và môi trường, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút. Simmons Citrate Agar (SCA) (Trần Linh Thước, 2010) - Sodium citrate 2g - NaCl 5g - K2HPO4 1g Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT - NH4H2PO4 1g - MgSO4 0.2g - Bromothymol blue 0.08g - Agar 15g - Nước cất 1000mL Đun nóng nhẹ và thỉnh thoảng lắc. Đun sôi 1-2 phút cho đến khi hoà tan. Phân phối vào 1/3 ống nghiệm. pH cuối 6.8±0.2. Môi trường peptone d’indol: - Tryptone 10g - NaCl 5g - Nước cất 1000mL Hòa tan 15g bột khan trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn. Chỉnh pH = 7.3. Phân 5 - 10ml môi trường vào các ống nghiệm 16mm x 160mm. Khử trùng nhiệt ướt ở 1210C/20 phút. Môi trường MR - VP (Methyl Red Voges Prokauer) (TCVN 5287:1994) - Peptone 5g - Glucose 5g - K2HPO4 5g - Nước cất 1000mL Pha chế: Đun để hòa tan thành phần trên trong nước cất, rót vào các ống nghiệm có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Điều chỉnh pH là 7,5  0,1 ở 25oC. Thuốc thử Kovas’s - P.méthyl amino bezandéhyde 5g - Alcool amylique 75mL - HCl 25mL Hòa tan P.méthyl amino bezandéhyde trong Alcool amylique, đun cách thủy nhẹ ở 50 – 550C cho đến khi tan hoàn toàn. Thêm HCl vào, vừa cho vào vừa làm lạnh với nước đá. Bảo quản ở 4 0C trong chai màu nâu. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Thuốc thử Methyl Red (MR): - Methyl red 0,1g - Ethanol 95% 300mL - Nước cất 200mL Thuốc thử Barritt (Trần Linh Thước, 2010) Dung dịch A chứa 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối. Dung dịch B chứa 40% KOH hoặc NaOH. Khi sử dụng, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút. Môi trường PCA (Plate Count Agar): - Tryptone 0.5% - Yeast extract 0.25% - Glucose 0.1% - Agar 1.2-1.8% - Nước Vừa đủ 100% Hòa tan 26.5g bột khan môi trường PCA trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH=7.0  0.2. Phân vào chai 100ml môi trường . Khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong 20 phút. Môi trường YDC (TCVN 5750:1993) - Beef extract 5g - Glucose 20g - Oxytetracyline 0.1g - Agar 15g - Nước cất 1000mL Pha chế: đun sôi hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng 45ºC trong nồi cách thủy, điều chỉnh pH là 6.6 ± 0.1 ở 25ºC, chứa từng lượng có dung tích 100ml vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121ºC trong 15 phút. Trong trường hợp không có oxytetracyline có thể thay thề bằng chloramphenicol (C11H12C12N2O5) và được chuẩn bị như sau: từ các lọ đã chứa 100mL môi trường không có Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT oxytetracyline, làm chảy môi trường và duy trì ở 45ºC trong nồi chưng cách thủy. Chuẩn bị dung dịch 0.1% oxytetracyline bằng cách hòa tan 0.1g oxytetrcyline trong 100mL nước cất, lọc thanh trùng. Cho 10mL dung dịch 0.1% oxytetrcyline vào 100mL môi trường đã nóng chảy, lắc để trộn đều. b. Hoá chất khác – Acid clodidric – Cồn 900 – Giấy quì xanh – Nghệ c. Thiết bị dụng cụ – Máy đồng hóa mẫu. – Tủ sấy dùng để khử trùng nhiệt khô ở 180oC. – Bếp đun cách thuỷ 45oC, 50oC  1oC. – Ống hút khắc vạch 1mL, 2mL, 5mL, 10mL. – Máy vortex (HEIPOLPH, Đức). – Tủ cấy (Totelstar Bio-II-A, Tây Ban Nha). – Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan). – Tủ ủ (Herich, Đức). – Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ). – Các dụng cụ thông dụng như: đĩa petri, ống nghiệm, pipet, bình tam giác 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp thu mẫu Kiểm tra mẫu 3 lần lặp lại, mỗi lần cách nhau 1 tháng. Cách lấy mẫu, bảo quản mẫu và chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật – Lấy vài lát cắt trên một cây chả cho vào túi nilon – Bảo quản ở tủ lạnh 4 oC. 3.2.2. Định tính hàn the 3.2.2.1. Nguyên tắc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Mẫu thực phẩm được acid hóa bằng acid hydrocloric (PA 36%), sau đó đun nóng trên nồi cách thủy, acid boric (H3BO3) hoặc natri borat (Na2B4O7) được phát hiện bằng giấy nghệ. Sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 sẽ chuyển màu của giấy nghệ sang màu đỏ cam. (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012) 3.2.2.2. Chuẩn bị thuốc thử Chuẩn bị giấy nghệ từ bột nghệ: Cân 1,5 - 2 g bột nghệ cho vào bình nón dung tích 250 mL, thêm 100 mL cồn 80% lắc mạnh cho tan hỗn hợp rồi lọc qua giấy lọc. Cho dịch ra một khay thủy tinh nhúng giấy lọc vào dịch lọc, chờ thấm đều lấy ra phơi khô ở nhiệt độ phòng sau đó cắt thành những dải giấy có kích thước 1x6cm. Giấy nghệ được bảo quản trong lọ kín tránh ánh sáng, ẩm và hơi CO2, SO2, NH3, NO… 3.2.2.3. Xử lý mẫu thử Cho vào cốc có mỏ dung tích 200 mL: Gồm: 25g mẫu thực phẩm đã nghiền nhỏ trong cối sứ + 50 mL nước cất. Dùng đũa thủy tinh trộn mẫu. Acid hóa bằng 1,7 mL HCl. Kiểm tra bằng giấy quỳ xanh (giấy qùy phải chuyển sang màu đỏ). Đun cách thủy trong 30 phút, để lắng hoặc ly tâm. Sau đó chắt lấy phần dịch trong để phân tích. + Nếu mẫu có chất béo thì làm lạnh bằng nước đá hoặc để trong tủ lạnh rồi vớt bỏ lớp chất béo đã đông lại. + Nếu mẫu có màu thì loại màu bằng cách cho sợi len nguyên chất vào mẫu để hấp thụ hết màu rồi lấy dịch trong không màu đem phân tích. 3.2.2.4. Định tính acid boric hoặc natri borat trong mẫu thử Nhúng dải giấy nghệ vào dịch thử cho thấm đều, lấy giấy ra để khô tự nhiên rồi đọc kết quả sau 1 giờ, nhưng không quá 2 giờ. Tiến hành đồng thời một mẫu trắng để so sánh (thay 25 g mẫu thử bằng 25 mL nước cất và làm theo quy trình trên). Nếu màu của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam thì trong mẫu có H3BO3 hoặc Na2B4O7. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 1 2 Hình 4. Sự đổi màu của giấy nghệ với hàn the đối chứng 3.2.3. Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh 3.2.3.1. Xử lý mẫu – Cân 10 g mẫu thử, thêm 90 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) ( hoặc đệm peptone). Chuẩn bị thêm 1 mẫu tương tự. – Nghiền mẫu bằng stomacher (230 vòng/phút trong 1 phút) cho vi sinh vật hoà tan vào dịch huyền phù vi sinh vật. 3.2.3.2. Pha loãng mẫu Dùng một pipet đã vô trùng lấy 1 mL dung dịch mẫu ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (nước peptone), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, được độ pha loãng 10-2, dùng máy vortex đồng nhất mẫu trong ống nghiệm sau đó hút 1 mL mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng, được độ pha loãng 10-3. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 1mL 1 mL 10-2 9 mL 10-1 10 -3 9 mL Hình 5. Các bước pha loãng mẫu 3.2.3.3. Định lượng Coliforms, E. coli a. Nguyên tắc Môi trường Endo có natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram dương. Trong quá trình phát triển trên môi trường này Coliforms lên men đường lactose ở 37oC và E. coli lên men đường ở 44oC tạo aldehyde và acid, aldehyde tác động đến phức chất fucshin – sulfit và giải phóng fucshin, sau đó fucshin nhuộm các khuẩn lạc thành màu đặc trưng (Lê Thanh Mai et al., 2004):  Coliforms: khuẩn lạc từ màu hồng đến đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không.  Escherichia coli: khuẩn lạc hồng hoặc màu đỏ có ánh kim hoặc không, tròn bờ đều. Môi trường Simmons Citrate Agar sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium, những vi sinh vật có khả năng biến dưỡng citrate sẽ sử dụng citrate và đạm ammonium và làm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu chỉ thị pH trong môi trường. Vì E. coli không có khả năng biến dưỡng citrate nên môi trường sẽ không đổi màu. E. coli có hoạt tính tryptophanse nên khi phát triển trên môi trường có tryptophan enzyme này sẽ xúc tác tạo thành indol. Việc phát hiện indol được phát hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử có chứa p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân bezene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Thử nghiệm Methyl Red nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bề trong môi trường trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị này giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Thử nghiệm MR (+) khi môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử. E. coli cho kết quả dương tính. Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung là lên men glucose sinh hỗn hợp như acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể chia làm hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (E. coli) và sinh 2,3-butanediol (Klebsiella, Enterobacter). Thử nghiệm Voges-Proskauer giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceae dựa trên sự oxy hoá acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxy hoá acetoin được xúc tác bởi α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine trong pepton tạo thành phức có màu đỏ. b. Phương pháp xác định b.1. Định lượng Coliforms Hút 1 mL mẫu vào đĩa thạch môi trường Endo và trang đều trên mặt thạch mỗi nồng độ 2 đĩa, ủ ở 37oC. Đọc kết quả sau 48 giờ - 72 giờ. Chọn những khuẩn lạc điển hình, có màu từ hồng đến đỏ, tròn bờ đều để đếm. b.2. Định tính E. coli Hút 1 mL mẫu vào đĩa thạch môi trường Endo và trang đều trên mặt thạch, mỗi nồng độ 2 đĩa, ủ ở 44 oC. Đọc kết quả sau 48 - 72 giờ. Căn cứ và màu sắc và hình dạng khuẩn lạc đặc trưng, những khuẩn lạc có màu từ hồng tới đỏ, có thể có ánh kim, tròn bờ đều. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ để tiếp tục giám định tính chất sinh hoá. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 6. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường Endo  Thử nghiệm IMViC – Thử nghiệm khả năng sinh indol: Chuyển mẫu vào môi trường Peptone d’indol. Ủ ở 44oC trong tủ ủ, tiến hành thử với thuốc thử Kovas’s. Nếu thuốc thử Kovas’s làm dung dịch chuyển sang màu hồng thì kết luận thử nghiệm dương tính. Thử nghiệm là (+) khi có sự tạo lớp màu hồng. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2 1 Hình 7. Thử nghiệm indole 1: Thử nghiệm citrate dương tính. 2: Thử nghiệm citrate âm tính. – Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate Cấy ria trên môi trường Simmons Citrate Agar rắn trong ống thạch nghiêng. Ủ ở 35oC trong 24 - 48 giờ. Đọc kết quả. Thử nghiệm là (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển màu xanh lam 1 2 Hình 8. Thử nghiệm citrate 1: Thử nghiệm citrate dương tính. 2: Thử nghiệm citrate âm tính. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT – Thử nghiệm MR (Methyl Red) Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa vào số ống tương ứng chứa 5mL môi trường MR - VP để ở 37 oC từ 48 - 96 giờ. Cho vào mỗi ống nghiệm vài giọt MR sau đó lắc đều, quan sát và ghi nhận kết quả. Môi trường chuyển màu đỏ: MR (+). Môi trường chuyển màu vàng: MR (-) 1 2 Hình 9. Thử nghiệm Methyl Red 1: Thử nghiệm Methyl Red dương tính. 2: Thử nghiệm Methyl Red âm tính. – Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa vào số ống tương ứng chứa 5ml môi trường MR - VP để ở 37oC từ 24 - 48 giờ. Cho vào mỗi ống nghiệm vài giọt thuốc thử Barritt sau đó lắc đều, quan sát và ghi nhận kết quả sau 20 phút. Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường. 1 2 Hình 10. Thử nghiệm VP 1: Thử nghiệm VP dương tính. 2: Thử nghiệm VP âm tính. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT c. Cách tính kết quả và kết luận c.1. Định lượng Coliforms  Chú ý: chọn tất cả các hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 - 250. Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 250 (tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên) N= Công thức: C1  C 2 2d Trong đó: – N : số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu – C1,C2 : số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn – D : hệ số pha loãng mẫu Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 - 250 (tất cả các hộp petri khác có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên) Công thức tính: tương tự như trên Trường hợp 3: ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri có số khuẩn lạc dao động từ 25 - 250. Khi đó, ta phải tính kết quả cho từng độ pha loãng.  Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, ta tính như sau: N= C (n1  0.1n2 )d Trong đó: – N : số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu – C : số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn – n1,n 2 : số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn – d : hệ số pha loãng mẫu  Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau lớn hơn 2 lần: sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả. Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng thấp nhất để tính kết quả. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả. Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đó, 1 d ta sẽ ghi kết quả là có ít hơn (1x ) khuẩn lạc. Trong đó, d là hệ số pha loãng thấp nhất. c.2. Định tính E. coli Thử nghiệm IMViC nếu cho kết quả khả năng sinh indol (+), khả năng biến dưỡng citrate (-), thử nghiệm MR (+), thử nghiệm VP (-) thì kết luận E. coli (+). 3.2.3.4. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxy phân tử ở 30oC (TCVN 5165:1990). a. Nguyên tắc – Cấy một lượng xác định mẫu thử nghiệm vào đĩa petri. – Đổ thạch dinh dưỡng vào, lắc đề và ủ ở 30oC / 24 - 48 giờ trong điều kiện hiếu khí. – Sau 24 giờ đem tất cả những khuẩn lạc hiện diện trên đĩa petri. b. Phương pháp xác định Hút 1mL mẫu ở các nồng độ cho vào đĩa petri. Sau đó đổ 15 mL môi trường PCA (nhiệt độ 45oC) vào đĩa. Mỗi nồng độ 2 lần lặp lại. Trộn đều dịch mẫu với, môi trường bằng cách xoay đĩa petri theo hình số 8. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ủ ấm ở nhiệt độ 30 - 37 oC trong 24 giờ. Đếm khuẩn lạc. Tiếp tục ủ 24 giờ. Đếm khuẩn lạc tiếp tục. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 11. Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA c. Cách tính kết quả và kết luận Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết quả theo công thức như trong phần trên. 3.2.3.5. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc a. Nguyên tắc Hình 12. Khuẩn lạc men, mốc trên môi trường YDC Nấm men, nấm mốc là các vi sinh vật đơn bào hoặc đa bào, hình thành khuẩn lạc trên môi trường lựa chọn ở 25 ± 1ºC trong 48 đến 72giờ (TCVN 5750:1993). Môi trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn (chất kháng sinh như oxytetracyline hoặc chloramphenicol) (Lê Thanh Mai et al., 2004). Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT b. Phương pháp xác định Hút 1ml mẫu ở các nồng độ trải lên môi trường thạch và trang đều. Ủ ở 25 ± 1ºC trong 48 - 72giờ. Đếm số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men. c. Cách tính kết quả Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết quả theo công thức như trong phần trên. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1 Khảo sát thực hiện trên 5 mẫu chả lụa được sản xuất trên 5 địa chỉ sản xuất khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Mẫu ở cơ sở sản xuất được ký hiệu lần lượt là M1, M2, M3, M4 và M5. Tất cả 5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của Coliforms, E. coli, men mốc, tổng số vi sinh vật hiếu khí và hàn the. Kết quả được thể hiện ở Bảng 2, 3 và 4. Bảng 2. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1 Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 - Bảng 3. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1 VP (Voges- Mẫu Indol Methyl Red M1 - - - - M2 - - - + M3 - - - + M4 - - - + M5 - + - - Proskauer) Citrate Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 1 2 Hình 13. Mẫu chả lụa có hàn the làm đổi màu giấy nghệ 1: Thử nghiệm dương tính. 1 2: Thử nghiệm âm tính. 2 3 4 Hình 14. Thử nghiệm IMViC 1. Thử nghiệm indol 2. Thử nghiệm MR 3. Thử nghiệm VP 4. Thử nghiệm citrate Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 4. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 1 TSVSVHK Coliforms E. coli Men, mốc (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) 1 3,05×102 0 - 1,90×102 2 3,10×102 0 - 1,65×102 1 2,74×104 10 2 - 2,60×102 2 2,78×104 1,05×10 2 - 2,80×102 1 1,11×104 2,65×10 2 - 6,00×103 2 1,08×104 2,55×10 2 - 5,95×103 1 1,71×104 3,50×10 1 - 4,55×102 2 1,72×104 4,00×10 1 - 4,55×102 1 2,24×104 2,85×10 3 - 3,35×103 2 2,25×104 2,90×10 3 - 3,45×103 ≤ 104 ≤ 50 0 Lặp lại Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 TC (CFU/g) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình 15. Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí Hình 16. Khuẩn lạc men, mốc Hình 17. Khuẩn lạc Coliforms Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Kết quả khảo sát lần 1 cho thấy, mẫu thứ nhất (M1) cho kết quả âm tính với hàn the, nhiễm men mốc với mật số là 1,90×102 CFU/g, TSVSVHK 3,05×102 CFU/g, Coliforms 0 CFU/g không vượt quá quy định của Bộ Y tế, mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 2 và thứ 3, kết quả thử hàn the là âm tính, nhiễm men mốc với mật số lần lượt là 2,60×102 và 6,00×103CFU/g, TSVSVHK 2,74×10 4 và 1,11×104 CFU/g, Coliforms 102 và 2,65×102 CFU/g đều vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Ở mẫu thứ 4, kết quả thử hàn the là dương tính, mốc men có mật số là 4,55×102 CFU/g, TSVSVHK 1,71×104 CFU/g nhiễm vượt quá quy định cho phép nhưng nhiễm Coliforms với mật số là 3,50×101 CFU/g lại không vượt quá giới hạn. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Ở mẫu thứ 5, kết quả thử hàn the là âm tính, mốc men có mật số là 3,35×103 CFU/g, Coliforms 2,85×103 CFU/g, TSVSVHK 2,24×10 4 CFU/g nhiễm với mật số cao vượt quá giới hạn của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, VP, citrate và dương tính với thử nghiệm methyl red chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.2. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 2 Kiểm tra lặp lại 5 mẫu chả lụa ở 5 cơ sở sản xuất đã được kiểm tra lần 1. Tất cả 5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của Coliforms, E. coli, men mốc, tổng số vi sinh vật hiếu khí và hàn the. Kết quả được thể hiện ở Bảng 5, 6 và 7. Bảng 5. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 2 Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 - Bảng 6. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 2 VP (Voges- Mẫu Indol Methyl Red M1 - - - - M2 - - - + M3 - - - + M4 - - - + M5 - + - - Proskauer) Citrate Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 7. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 2 TSVSVHK Coliforms E.coli Men, mốc (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) 1 3,55×102 0 - 1,80×102 2 3,50×102 0 - 1,80×102 1 2,75×104 1,15×10 2 - 3,20×102 2 3,15×104 1,20×10 2 - 3,45×102 1 1,04×104 3,55×10 2 - 5,85×103 2 1,06×104 3,60×10 2 - 6,00×103 1 2,02×104 3,50×10 1 - 5,60×102 2 2,03×104 4,50×10 1 - 5,95×102 1 2,67×104 2,50×10 3 - 4,55×103 2 2,70×104 2,60×10 3 - 4,50×103 ≤ 104 ≤ 50 0 Lặp lại Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 TC (CFU/g) Kết quả khảo sát lần 2 cho thấy, mẫu thứ nhất cho kết quả âm tính với hàn the, nhiễm men mốc với mật số là 1,80×102 CFU/g, TSVSVHK 3,55×102 CFU/g, Coliforms 0 CFU/g không vượt quá quy định của Bộ Y tế, mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 2 và thứ 3, kết quả thử hàn the là âm tính, nhiễm men mốc với mật số lần lượt là 3,20×102 và 5,85×103 CFU/g, TSVSVHK 2,75×104 và 1,04×104 CFU/g, Coliforms 1,15×102 và 3,55×102CFU/g đều vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Trong thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, cả hai mẫu đều cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 4, kết quả thử hàn the là dương tính, mốc men có mật số 5,60×102 CFU/g, TSVSVHK 2,02×104 CFU/g nhiễm vượt quá quy định cho phép nhưng nhiễm Coliforms 3,50×101 CFU/g lại không vượt quá giới hạn. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu không bị nhiễm E. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT coli. Ở mẫu thứ 5, kết quả thử hàn the là âm tính, mốc men có mật số 4,55×103 CFU/g, Coliforms 2,50×103 CFU/g, TSVSVHK 2,67×10 4 CFU/g nhiễm với tỷ lệ cao vượt quá giới hạn của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E.coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, VP, citrate và dương tính với thử nghiệm methyl red chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. 4.3. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 3 Kiểm tra lặp lại 5 mẫu chả lụa ở 5 cơ sở sản xuất đã được kiểm tra lần 1 và 2. Tất cả 5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của Coliforms, E. coli, men mốc, tổng số vi sinh vật hiếu khí và hàn the. Kết quả được thể hiện ở Bảng 8, 9 và 10. Bảng 8. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 3 Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 - Bảng 9. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 3 VP (Voges- Mẫu Indol Methyl Red M1 - - - - M2 - - - + M3 - - - + M4 - - - + M5 - - - + Proskauer) Citrate Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 10. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 3 TSVSVHK Coliforms E.coli Men, mốc (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) 1 3,35×102 0 - 2,05×102 2 3,40×102 0 - 1,95×102 1 3,13×104 1,05×10 2 - 4,05×102 2 3,10×104 1,15×10 2 - 4,25×102 1 1,10×104 3,00×10 2 - 5,7×10 3 2 1,13×104 3,50×10 2 - 5,8×10 3 1 1,91×104 1,50×10 1 - 6,90×102 2 1,81×104 1,00×10 1 - 6,85×102 1 1,92×104 1,15×10 3 - 4,00×103 2 1,99×104 0,80×10 3 - 4,10×103 ≤ 104 ≤ 50 0 Lặp lại Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 TC (CFU/g) Kết quả khảo sát lần 3 cho thấy, mẫu thứ nhất cho kết quả âm tính với hàn the, nhiễm men mốc có mật số là 2,05×10 2 CFU/g, TSVSVHK 3,35×102 CFU/g, Coliforms 0 CFU/g không vượt quá quy định của Bộ Y tế, mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 2 và thứ 3, kết quả thử hàn the là âm tính, mật số nhiễm men mốc lần lượt là 4,05×102 và 5,7×103 CFU/g, TSVSVHK 3,13×104 và 1,10×104 CFU/g, Coliforms là 1,05×102 và 3,00×102 CFU/g đều vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Ở mẫu thứ 4, kết quả thử hàn the là dương tính, mốc men có mật số là 6,90×102 CFU/g, TSVSVHK 1,91×10 4 CFU/g nhiễm vượt quá quy định cho phép nhưng nhiễm Coliforms với mật số 1,50×10 1 CFU/g lại không vượt quá giới hạn. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ở mẫu thứ 5, kết quả thử hàn the là âm tính, mốc men có mật số là 4,00×103 CFU/g, Coliforms 1,15×103 CFU/g, TSVSVHK 1,92×10 4 CFU/g nhiễm với tỷ lệ cao vượt quá giới hạn của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, VP, methyl red và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với E. coli. Chả lụa là một sản phẩm thịt đã qua xử lý nhiệt vì vậy sự nhiễm các vi sinh vật gây bệnh vượt qua ngưỡng cho phép như trong mẫu 2, 3, 4, 5 có thể là do vệ sinh kém sau xử lý nhiệt. Chúng có thể bị nhiễm từ các thiết bị, nơi bảo quản, từ người chế biến, người bán: dùng tay trần để cắt chả, dụng cụ như dao, thớt không hợp vệ sinh, nơi bày bán có nhiều côn trùng, dụng cụ che đậy không đảm bảo. Hoặc có thể nhiễm do chả lụa bày bán để lâu ngày mà biện pháp bảo quản không đảm bảo. Ở mẫu số 4 còn cho kết quả dương tính với hàn the cho thấy người sản xuất đã sử dụng chất này để làm cho chả lụa dai giòn, bảo quản lâu hơn nhưng điều này rất nguy hiểm cho người sử dụng. Kết quả này tuy chưa đánh giá được hết thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm trên địa bàn, nhưng cũng góp phần phản ánh được thực trạng về một số cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn để mọi người ý thức hơn trong việc chọn lựa sử dụng cũng như kinh doanh như thế nào để đảm bảo an toàn và vệ sinh. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua 3 lần kiểm tra các mẫu chả lụa tại 5 địa điểm sản xuất khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ cho thấy chỉ có 1 mẫu đạt chỉ tiêu về tổng số vi sinh vật hiếu khí (3,35×10 2 CFU/g), men mốc (2,05×10 2 CFU/g), Coliforms (0 CFU/g). Bốn mẫu 2, 3, 4, 5 còn lại đều không đạt chỉ tiêu theo quy định từ, 1,10×10 4 đến 3,13×104CFU/g đối với chỉ tiêu TSVSVHK, 4,05×102 đến 5,7×103 CFU/g đối với chỉ tiêu men mốc. Mẫu 2, 3 và 5 có chỉ tiêu về Coliforms lần lượt là 1,05×102 đến 1,15×103 CFU/g vượt ngưỡng cho phép chỉ còn mẫu 4 với 1,50×10 1 CFU/g thì đạt yêu cầu. Cả 5 mẫu được kiểm tra đề cho kết quả âm tính với E. coli được khẳng định bằng các thử nghiệm Indol, Methyl Red, VP và citrate. Đối với chỉ tiêu hàn the được sử dụng trong chả lụa, qua kiểm tra cho thấy mẫu 4 có kết quả dương tính với hàn the. 5.2. Đề nghị Khảo sát thêm nhiều cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn thành phố để có thêm thông tin khuyến cáo cho người tiêu dùng. Xác định các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn thực phẩm để kịp thời đưa ra biện pháp khắc phục. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Kim Thoại. 2007. Khảo sát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong các loại thực phẩm tại khu vực Thành phố Phan Thiết. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. Kiều Hữu Ảnh. 2010. Giáo trình Vi sinh vật học thực phẩm, Nxb Giáo dục Việt Nam, Hà Nội, tr.15-20. Lê Thanh Mai. 2008. Phân tích vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Lê Thanh Mai. Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng và Lê Thị Lan Chi. 2004. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm. 2000. Vệ sinh và an toàn thực phẩm, Trường Đại học Kỹ thuật Tp. Hồ Chí Minh. Nguyễn Thị Thanh Hương. 2012. Thực trạng và giải pháp nâng cao năng lực quản lý việc sử dụng một số phụ gia trong chế biến thực phẩm tại Quảng Bình. Luận án Tiến sĩ Dinh dưỡng. Nguyễn Tiến Dũng. 2007. Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. HCM. Nguyễn Văn Thành. 2012. Bài giảng Vi sinh trong an toàn thực phẩm. Đại học Cần Thơ. Phan Nguyễn Trang. 2008. Khảo sát hàn the & chất lượng thực tế của chả lụa trên địa bàn tỉnh Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ thực phẩm. Trần Đáng. 2007. An toàn thực phẩm, Nxb Hà Nội, tr 509- 21. Trần Linh Thước. 2010. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, Nxb Giáo dục Việt Nam. Tài liệu tập huấn của Viện vệ sinh – Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh, 2009. Kỹ thuật xét nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (Kỹ thuật vi sinh). TCVN 5165:1990. 1990. Phương pháp xác định Tổng số vi khuẩn hiếu khí. Bộ Y tế. TCVN 4833:2002. 2002. Thịt và các sản phẩm từ thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử. Bộ Y tế. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TCVN 5750:1993. 1993. Thịt và sản phẩm thịt – Định lượng nấm men và nấm mốc – Kỹ thuật đếm khuẩn lạ. Bộ Y tế. Võ Thị Kiều Ngân. 2012. Khảo sát và đánh giá an toàn vệ sinh nước uống khu vực Trường Đại học Cần Thơ. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Công Nghệ sinh học. Tiếng Anh Cliver, O. Dean and Hans P. Riemann. Foodborn Diseases, 2nd Edition. Elsevier Science Ltd. London, UK. Cowan M. K, Talaro K. P. 2006. Microbiology a systems approach. McGraw Hill, pp.61-71. Pollack R. A, Findlay L., Walter Monschein, Modesto R.. 2005. Laboratory excercises in microbiology. Jonh Whiley & sons inc, pp.179-186. Brown A.E. 2005. Benson’s microbiological applications. McGraw Hill, pp.429-432. Roberts T.A, Baird-Parker A.C, Tompkin R.B. 1996. Microbiological specifications of food pathogens. Blackie Academic & Professional, pp.217-220. Website http://www.medwelljournals.com/fulltext/?doi=rjbsci.2009.656.661, ngày 25/5/2013. http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Fluka/.../mibi_focus_1_3.pdf, ngày 25/5/2013. http://www.foodsafety.gov/poisoning/causes/bacteriaviruses/salmonella/, ngày 25/5/2013. http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/printthread.php?tid=522, ngày 25/5/2013. http://www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han--tap-huan-412312272/511/Dac-tinhmot-so-moi-truong-phan-lap-va-chan-doan-vi-khuan-gay-benh.vhtm, ngày 25/5/2013. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, ngày 25/5/2013. http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung/14183_Thu-nhanh-han-the.aspx, ngày 30/5/2013. http://vietbao.vn/Khoa-hoc/5-phut-de-biet-han-the-co-hay-khong-trong-thucpham/20440329/189/, ngày 30/5/2013. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT http://vfa.gov.vn/so-lieu-bao-cao/ngo-doc-thuc-pham/23.vfa, ngày 2/11/2013. http://www.bacteriainphotos.com/agar%20cultivation%20media.html, ngày 2/11/2013. http://antoanvesinhthucpham.vn/tintuc/130-thuc-trang-dang-lo-ngai-ve-an-toan-vesinh-thuc-pham.html, ngày 2/11/2013. http://luanvan.co/luan-van/de-tai-khao-sat-han-the-va-chat-luong-thuc-te-cua-cha-luatren-dia-ban-tinh-tra-vinh-2716/, ngày 22/11/2013. http://www.lonrung.com/thi-truong-thuc-pham/gio-cha-ngay-tet-lai-van-de-vesinh.html, ngày 10/12/2013. http://www.zbook.vn/ebook/khao-sat-mot-so-yeu-to-anh-huong-den-chat-luong-chalua-36111/, ngày 10/12/2013. Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 39 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm Tủ cấy Máy vortex Tủ ủ Chuyên ngành Vi sinh vật học Water bath Nồi khử trùng Cân phân tích Stomacher Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2. Các tiêu chuẩn sử dụng 1. Thịt và sản phẩm thịt – Định lượng nấm men và nấm mốc – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc (TCVN 5750:1993) Nấm men và nấm mốc (yeasts and moulds): Các vi sinh vật tạo khuẩn lạc trong vòng 5 ngày ở nhiệt độ từ 20 oC đến 25 oC trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này. Nguyên tắc Cấy sâu trong các đĩa thạch, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc chứa trong các đĩa petri, với mẫu cấy là một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phẩm ban đầu dạng lỏng, hoặc một lượng dung dịch huyền phù ban đầu, nếu sản phẩm ở dạng khác. Cấy trên các đĩa khác trong cùng một điều kiện, sử dụng các độ pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu. Chú thích 1 – Nếu cần, để phân biệt giữa nấm men và nấm mốc, thì nên sử dụng cách nuôi cấy bề mặt đĩa thạch. Cũng nên sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt khi dự kiến là có các nấm men hoặc nấm mốc mẫn cảm với nhiệt. Ủ các đĩa chứa các mẫu cấy trên trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ từ 20 oC đến 25oC trong 3 ngày, 4 ngày hoặc 5 ngày. Tính số lượng nấm men và nấm mốc có trong 1 g hoặc 1 mL mẫu từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng cho kết quả có ý nghĩa. Môi trường nuôi cấy - Beef extract 5g - Glucose 20g - Oxytetracyline 0.1g - Agar 15g - Nước cất 1000mL Pha chế: đun sôi hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng 45ºC trong nồi cách thủy, điều chỉnh pH là 6.6 ± 0.1 ở 25ºC, chứa từng lượng có dung tích 100ml vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121ºC trong 15 phút. Trong Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT trường hợp không có oxytetracyline có thể thay thề bằng chloramphenicol (C11H12C12N2O5) và được chuẩn bị như sau: từ các lọ đã chứa 100mL môi trường không có oxytetracyline, làm chảy môi trường và duy trì ở 45ºC trong nồi chưng cách thủy. Chuẩn bị dung dịch 0.1% oxytetracyline bằng cách hòa tan 0.1g oxytetrcyline trong 100mL nước cất, lọc thanh trùng. Cho 10mL dung dịch 0.1% oxytetrcyline vào 100mL môi trường đã nóng chảy, lắc để trộn đều. Cách tiến hành  Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng Chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng  Cấy và ủ Lấy hai đĩa petri vô trùng. Dùng pipet vô trùng chuyển vào mỗi đĩa môi trường 1 mL mẫu thử nếu dạng lỏng hoặc 1 mL huyền phù ban đầu nếu mẫu ở dạng khác. Ủ ở nhiệt độ từ 20 oC đến 25 oC. Đếm và chọn các khuẩn lạc Sau 48 đến 72 giờ chọn đếm những đĩa có số khuẩn lạc không vượt quá 300. 2. Phương pháp xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TCV 5165 – 1990) Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí trong các loại sản phẩm thực phẩm. Nguyên tắc Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± 1oC trong thời gian 24 giờ. Số lượng vi sinh vật hiếu khí trong 1 g hoặc 1 mL mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu Lượng mẫu cân tối thiểu để pha loãng không ít hơn 1 mL đối với các sản phẩm lỏng và 10 ± 0,1 g đối với các sản phẩm khác. Thiết bị, dụng cụ – Đĩa petri thuỷ tinh Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT – Pipet – Nồi cách thuỷ điều chỉnh được nhiệt độ 45 ± 1oC – Tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 30 ± 1oC – Tủ sấy khô – Nồi hấp áp lực – Bình thuỷ tinh dung tích 250 – 500 mL – Ống nghiệm loại – pH kế hoặc giấy đo pH Môi trường - Tryptone 0.5% - Yeast extract 0.25% - Glucose 0.1% - Agar 1.2-1.8% - Nước Vừa đủ 100% Hòa tan 26.5g bột khan môi trường PCA trong 1 lít nước, đun và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, chỉnh pH=7.0  0.2. Phân vào chai 100ml môi trường . Khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong 20 phút. Các bước pha loãng mẫu  Pha loãng mẫu Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm độ pha loãng cần thiết đủ đếm được số khuẩn lạc trên đĩa theo dự tính.  Đổ đĩa Lấy 1 mL sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri. Rót vào từng đĩa 12 – 15 mL môi trường trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần. Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút. Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4 mL thạch màng lên trên mặt.  Ủ ấm Khi thạch đã đông, lật sắp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 1oC từ 24 giờ. Sau 24 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy. Tính kết quả Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả. Sự phân bố của các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôi cấy (5). Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... tài: Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ được thực hiện nhằm cung cấp thông tin về tình trạng vệ sinh an toàn trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ 1.2 Mục tiêu của đề tài Đánh giá sự tồn tại của các vi sinh vật gây ngộ độc trong thực phẩm cũng như hàn the có trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên... địa bàn thành phố Cần Thơ Mẫu ở cơ sở sản xuất được ký hiệu lần lượt là M1, M2, M3, M4 và M5 Tất cả 5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của Coliforms, E coli, men mốc, tổng số vi sinh vật hiếu khí và hàn the Kết quả được thể hiện ở Bảng 2, 3 và 4 Bảng 2 Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1 Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 - Bảng 3 Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1 VP (Voges-... đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết quả theo công thức như trong phần trên Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1 Khảo sát thực hiện trên 5 mẫu chả lụa được sản xuất trên 5 địa chỉ sản xuất khác nhau trên địa bàn thành... hiếu khí Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm (Trần Linh Thước, 2010) Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đáng giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá... sử dụng trong thực phẩm - trong quá trình sản xuất, chế biến và điều này làm tăng sự lo ngại khi sử dụng chả lụa 2.1.1 Quy trình chế biến chả lụa Nguyên liệu Xử lý Xay Phối trộn Vào khuôn Làm chín Bao gói Chả lụa Hình 1 Quy trình chế biến chả lụa tổng quát Muốn cho chả ngon, béo, người ta cho vào xay chung với thịt một lượng mỡ heo tới 40%, rồi trộn đường, bột năng, bột ngọt, hàn the, bột nở, hương... chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt Bảng 1 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt (Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”) SẢN PHẨM LOẠI VI SINH VẬT GIỚI HẠN VI SINH VẬT (trong 1g hoặc 1mL sản phẩm) Thịt và sản phẩm thịt đóng gói TSVSVHK Coliforms 10 50 E coli Không có S aureus Cl perfringens... monocytogenes Không có Thịt và sản phẩm thịt không đóng gói 4 2 5 2 2 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Mẫu thí nghiệm Gồm 5 loại mẫu chả lụa mua từ 5 cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn thành phố Cần Thơ 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu... nước mắm và hương thịt, muối đỏ (để tạo màu hồng tự nhiên cho chả) Thiếu một trong những hóa Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT chất này, chả lụa sẽ không ngon, không dai, không giòn và không đẹp Trong đó, hương thịt và hàn the chiếm một vị trí quan trọng bởi nếu thiếu hoặc ít, chả sẽ kém ngon hơn rất nhiều và nhanh... tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi (Trần Linh Thước, 2010) Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm 2.5 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt Bảng 1 Giới hạn chỉ. .. thành phố Cần Thơ Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Đề cương luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chả lụa Giò lụa, giò chả hay chả lụa (phương ngữ Nam bộ) là tên gọi của món ăn được làm từ hai nguyên liệu cơ bản là thịt nạc thăn lợn giã nhuyễn kết hợp với nước mắm ngon, gói trong lá chuối và luộc chín Chả lụa