đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở cần thơ

Với mục đích khảo sát và đánh giá mức độ an toàn của chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong chả lụa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cần Thơ – Tháng 11/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cần Thơ - Tháng 11/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Ths Huỳnh Xuân Phong Trịnh Thị Ngọc Diệp DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

- -

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô

đã tận tình giảng dạy em trong thời gian học tập vừa qua

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sự hướng dẫn tận tình của Cán bộ hướng dẫn - ThS Huỳnh Xuân Phong

Xin gửi lời biết ơn chân thành đến các thầy cô cố vấn học tập lớp Vi sinh vật học khóa 36, ThS Võ Văn Song Toàn và ThS Nguyễn Thị Pha Sự hỗ trợ nhiệt tình của các thầy cô đã giúp cho chúng em hoàn thành tốt quá trình học tập của mình

Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm và quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này Xin được gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt

Xin trân trọng cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 20 tháng 11 năm 2013

Sinh viên thực hiện

TÓM TẮT - -

Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề hết sức quan trọng và cần thiết, được tiếp cận với những thực phẩm an toàn là nhu cầu cơ bản đối với mỗi con người Với mục đích khảo sát và đánh giá mức độ an toàn của chả lụa được sản xuất tại một

số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the

trong chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” đã được thực hiện Trong nghiên

cứu này, chỉ tiêu hàn the và các chỉ tiêu vi sinh theo quy định của Bộ Y tế đã được tiến hành khảo sát Tổng cộng có 5 mẫu được tiến hành kiểm tra Kết quả cho thấy, chỉ có

1 mẫu đạt yêu cầu về các chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, men mốc, Coliforms, E.coli Cả

5 mẫu đều cho kết quả âm tính với E.coli Có 4 mẫu có chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí, men mốc, Coliforms vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế Đối với chỉ tiêu hàn the thì có một mẫu cho kết quả dương tính

Từ khoá: chả lụa, hàn the, IMViC, vi sinh vật gây bệnh

MỤC LỤC

- -

Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về chả lụa 3

2.2 Tổng quan về hàn the 5

2.3 Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm 6

2.4 Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm từ thịt 6

2.4.1 Coliforms tổng số 6

2.4.2 Escherichia coli 7

2.4.3 Vi khuẩn hiếu khí 9

2.4.4 Nấm men và nấm mốc 9

2.5 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt 10

3.1 Phương tiện thí nghiệm 11

3.1.1 Mẫu thí nghiệm 11

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 11

3.1.3 Thời gian thực hiện 11

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phương pháp thu mẫu 14

3.2.2 Định tính hàn the 14

3.2.2.1 Nguyên tắc 14

3.2.3 Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh 16

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1 26

4.2 Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 2 31

4.3 Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 3 33

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm

Phụ lục 2 Các tiêu chuẩn sử dụng

DANH SÁCH BẢNG

- -

Bảng 1 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt 10

Bảng 2 Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1 26

Bảng 3 Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1 26

Bảng 4 Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 1 28

Bảng 5 Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 2 31

Bảng 6 Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 2 31

Bảng 7 Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 2 32

Bảng 8 Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 3 33

Bảng 9 Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 3 33

Bảng 10 Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 3 34

DANH SÁCH HÌNH

- -

Hình 1 Quy trình chế biến chả lụa tổng quát 3

Hình 2 Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử 7

Hình 3 Hình dạng vi khuẩn E coli 7

Hình 4 Sự đổi màu của giấy nghệ với hàn the đối chứng 16

Hình 5 Các bước pha loãng mẫu 17

Hình 6 Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường Endo 19

Hình 7 Thử nghiệm indole 20

Hình 8 Thử nghiệm citrate 20

Hình 9 Thử nghiệm Methyl Red 21

Hình 10 Thử nghiệm VP 21

Hình 11 Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA 24

Hình 12 Khuẩn lạc men, mốc trên môi trường YDC 24

Hình 13 Mẫu chả lụa có hàn the làm đổi màu giấy nghệ 27

Hình 14 Thử nghiệm IMViC 27

Hình 15 Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí 29

Hình 16 Khuẩn lạc men mốc 29

Hình 17 Khuẩn lạc Coliforms 29

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

- -

VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm

MR-VP Methyl Red – Voges Proskauer

YDC Yeast extract Dextrose – Chloramphenicol

TSVSVHK Tổng số vi sinh vật hiếu khí

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Xã hội càng phát triển, nhu cầu vật chất và tinh thần sẽ cao và đa dạng hơn, trong

đó, các yêu cầu về giá trị dinh dưỡng, vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) được đặc biệt chú trọng Bởi thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh dưỡng cho con người phát triển, duy trì sự sống và lao động, mà cũng chính từ thực phẩm con người có thể bị ngộ độc nếu như không tuân thủ nghiêm nhặt những biện pháp đảm bảo VSATTP hữu hiệu trong sản xuất, chế biến và bảo quản

Gần đây, qua thanh, kiểm tra, các cơ quan chức năng đã phát hiện trong mứt có dòi; chân gà có vi khuẩn mủ xanh hay hàng ngàn tấn thịt (từ trâu, bò, heo, gà, dê, cừu ) đông lạnh đã hết hạn sử dụng, hôi thối nhưng vẫn được tái chế bằng hóa chất rồi bán ra thị trường, điều đó cho thấy chất lượng và VSATTP rất đáng quan ngại Như

đã được phản ánh trên các phương tiện thông tin đại chúng, có rất nhiều thực phẩm chứa hàm lượng chất gây độc hại đang lưu hành trên thị trường như nước mắm, hải sản tươi có urea, nước tương có chất 3-MCPD, da heo có thuốc tẩy, trứng gà và sữa chứa melamine; trái cây khô từ Trung Quốc bị nhiễm độc chì; hạt dưa, bột ớt, bột điều nhuộm phẩm màu công nghiệp có chứa Rhodamin B, xúc xích có chứa chất Polychlorobifenyls gây ung thư; bánh phở chứa formol, rau củ quả có dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật, các loại chả, giò, nem chứa hàn the v.v…

Hiện nay tình trạng ngộ độc thực phẩm xảy ra thường xuyên hơn, nhất là tại các bếp ăn tập thể Theo số liệu báo cáo của Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), trong năm

2009, cả nước có tổng cộng 152 vụ ngộ độc thực phẩm, với 5212 ca ngộ độc và 35 trường hợp tử vong Đến năm 2012, tổng số vụ ngộ độc thực phẩm đã tăng lên tới 168

vụ với 5541 ca ngộ độc và 34 trường hợp tử vong Có rất nhiều nguyên nhân khiến thực phẩm bị nhiễm bẩn và độc, chẳng hạn như việc sử dụng tùy tiện phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông nghiệp, thủy hải sản; thậm chí sử dụng cả các chất bảo quản, phụ gia, phẩm màu công nghiệp, thuốc tẩy v.v… trong sản xuất, chế biến thức ăn đồ uống Thêm vào đó, tại một số cơ sở, việc sản xuất chế biến thực phẩm được đặt cạnh cống rãnh, ao tù; dụng

cụ lưu trữ, chế biến không đảm bảo vệ sinh

Yếu tố gây ngộ độc thực phẩm gồm cả độc tố tự nhiên, chất độc hóa học, vi sinh vật gây bệnh và độc tố của chúng Trong đó, vi sinh vật gây bệnh và độc tố của chúng

thường là những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm tức thời Theo số liệu báo cáo năm

2012 của 48 tỉnh/thành phố, đã giám sát được 12.295 mẫu, kết quả cho thấy thực phẩm

ô nhiễm vi sinh vật chủ yếu là tổng số bào tử nấm mốc men (40%), Coliforms

(30,8%), E.Coli (20,2%) Về ô nhiễm hóa học, ngoài các mẫu phát hiện có hàn the, độ

ôi khét, vẫn còn có mẫu dương tính với DEHP Những số liệu trên cho thấy tình hình VSATTP ở nước ta vẫn còn nhiều vấn đề, do vậy việc kiểm soát chất lượng VSATTP

là thực sự cần thiết

Xuất phát từ tình hình trên, đề tài: “Đánh giá chỉ tiêu vi sinh và hàn the trong

chả lụa tại một số cơ sở sản xuất ở Cần Thơ” được thực hiện nhằm cung cấp thông

tin về tình trạng vệ sinh an toàn trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá sự tồn tại của các vi sinh vật gây ngộ độc trong thực phẩm cũng như hàn the có trong chả lụa được sản xuất tại một số cơ sở trên địa bàn thành phố Cần Thơ

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về chả lụa

Giò lụa, giò chả hay chả lụa (phương ngữ Nam bộ) là tên gọi của món ăn được làm từ hai nguyên liệu cơ bản là thịt nạc thăn lợn giã nhuyễn kết hợp với nước mắm ngon, gói trong lá chuối và luộc chín Chả lụa là một sản phẩm truyền thống rất được yêu thích ở nước ta, được chế biến công phu và có hương vị đặc biệt, chả lụa giòn và thơmđậm mùi thịt tươi luộc cộng với mùi đặc trưng của lá chuối tươi được luộc chín

Vì đây là một món ăn được dùng ngay mà không qua xử lý nhiệt nên vấn đề vệ sinh rất được quan tâm Hơn nữa, để chả lụa giòn, dai và giữ được lâu người sản xuất thường sử dụng hàn the - một chất bị cấm sử dụng trong thực phẩm - trong quá trình sản xuất, chế biến và điều này làm tăng sự lo ngại khi sử dụng chả lụa

2.1.1 Quy trình chế biến chả lụa

Hình 1 Quy trình chế biến chả lụa tổng quát

Muốn cho chả ngon, béo, người ta cho vào xay chung với thịt một lượng mỡ heo tới 40%, rồi trộn đường, bột năng, bột ngọt, hàn the, bột nở, hương nước mắm và hương thịt, muối đỏ (để tạo màu hồng tự nhiên cho chả) Thiếu một trong những hóa

chất này, chả lụa sẽ không ngon, không dai, không giòn và không đẹp Trong đó, hương thịt và hàn the chiếm một vị trí quan trọng bởi nếu thiếu hoặc ít, chả

sẽ kém ngon hơn rất nhiều và nhanh hư

2.1.2 Các hình thức hư hỏng thường gặp

a Sự thối rữa thịt

Phân huỷ thối rữa là do sự biến đổi phức tạp, đặc trưng nhất xảy ra trong thịt Trong đó sự phân huỷ protein đóng vai trò quan trọng trong sự phân huỷ thối rữa do hoạt động của các vi sinh vật trên bề mặt thịt gây ra được chia làm 3 giai đoạn:

– Quá trình thuỷ phân protein dưới tác dụng của enzim protease do vi sinh vật tiết ra tạo sản phẩm cuối cùng là acid amin

– Quá trình khử acid amin thành amoniac, rượu, H2S,…

– Các chất hữu cơ được tạo thành do sự phân huỷ sơ bộ acid amin lại tiếp tục chuyển hoá Tuỳ theo điều kiện thích hợp các chất đó có thể bị oxi hoá hoàn toàn cho các hợp chất vô cơ, các chất độc, hoặc có mùi hôi thối

Quá trình thối rữa càng sâu thì vi khuẩn yếm khí càng nhiều, khi đó mô thịt có màu xám hoặc xám xanh, mềm nhũn, mất tính đàn hồi, pH chuyển từ môi trường acid đến môi trường kiềm Các chất khí có mùi khó chịu cũng thoát ra và tăng dần lên

c Sự lên men chua

Thịt có thể bị chua do vi khuẩn lactic và nấm men nhất là đối với thịt có nhiều glycogen

Ban đầu các acid hữu cơ ức chế các vi khuẩn thối rữa phát triển, nhưng môi trường acid nấm mốc dễ phát triển

Nấm mốc hoạt động tạo thành amoniac và kiềm nitrua, những chất này là chất

trung hoà môi trường acid tạo điều kiện cho các vi khuẩn gây thối phát triển: Bacillus

subtilis, Bacillus mesenterieus, Bacterium proteus

Nấm mốc phát triển trên bề mặt thịt không làm thịt bị biến đổi sâu sắc tức thời, nhưng nó chuẩn bị cho các vi khuẩn gây thối rữa hoạt động sau này Khi nhiễm loại

mốc đen dạng chùm Cladosporium gerbarum một loài nấm mốc bất toàn có khả năng

mọc sâu vào những lớp bên trong Khi ăn chúng có thể bị ngộ độc

2.2 Tổng quan về hàn the

Hàn the còn được gọi là borate sodium, có tên khoa học là sodium tetraborate, tên thương mại là borax, với công thức hóa học là Na2B4O7.10H2O, có trọng lượng phân tử 201,22; bột kết tinh thể màu trắng đục, vị hơi nồng, có mùi bốc mạnh Hàn the không tan trong acid, tan ít trong nước lạnh, tan nhiều trong nước nóng, khi tan trong nước hoặc trong không khí ẩm, hàn the cũng có thể bị thuỷ phân tạo ra acid boric theo phản ứng:

Các nghiên cứu độc học đã chỉ ra rằng hàn the có khả năng tích tụ trong các mô

mỡ, thần kinh gây tác hại trên nguyên sinh chất và sự đồng hóa các chất albuminoit Mặt khác, do hàn the kết hợp với mạch peptide của protein, cũng như liên kết cấu trúc mạng của glucid, hình thành các dẫn chất mà các men tiêu hóa protein và glucid khó

phân hủy được chúng, làm cản trở quá trình hấp thụ các protein, glucid gây hiện tượng khó tiêu, chán ăn, mệt mỏi cho người sử dụng Hàn the còn có thể gây nhiễm độc mãn tính (do chúng tích luỹ trong cơ thể) gây ảnh hưởng tới tiêu hóa, hấp thu, chuyển hoá, ảnh hưởng không tốt tới chức năng thận với biểu hiện ăn mất ngon, giảm cân, tiêu chảy, động kinh, suy thận

Nguy cơ với sức khỏe cộng đồng và cá nhân của hàn the là rất cao Do đó, Bộ Y

tế đã ban hành Quyết định số 3742/2001/QĐ-BYT ngày 31/8/2001, không cho phép sử dụng hàn the làm phụ gia trong chế biến thực phẩm tại Việt Nam

2.3 Các con đường vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm

Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm theo các con đường (Đặng Kim Thoại, 2007): + Do môi trường không đảm bảo vệ sinh, vi sinh vật từ đất, nước bẩn, không khí, dụng cụ và các vật dụng khác nhiễm vào thực phẩm

+ Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, thực phẩm không được nấu chín

2.4 Giới thiệu các vi sinh vật thường gây ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm

Hình 2 Hình dạng Coliforms dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: http://altered-states.net/barry/newsletter539/Ecoli.jpg&w=200&h=199&ei/, ngày 23/5/2013)

Những vi khuẩn này có thể tồn tại ở trong ruột người, súc vật và cả ngoại cảnh gồm các loài sau (Lê Thanh Mai et al., 2004):

- Escherichia coli

- Klebsiela

- Enterobacter

- Citrobacter Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác (Trần Linh Thước, 2010)

2.4.2 Escherichia coli

Hình 3 Hình dạng vi khuẩn E coli

(Nguồn: http://www.khoahoc.com.vn/timkiem/shewanella/index.aspx, ngày 23/5/20130)

Escherichia coli là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, hình que chiều dài khoảng

2.0 μm, không sinh bào tử, di động, Gram âm, vô hại, là một vi khuẩn bình thường của đường ruột ở người, động vật máu nóng và chim Vì rằng, nó thường có mặt ở nồng độ rất cao (hàng triệu/g nội chất của ruột già) nên từ lâu nó đã được sử dụng như một vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân tiềm tàng và sự có mặt của các tác nhân gây bệnh

đường ruột trong thực phẩm và nước Hình dạng E coli được thể hiện trong Hình 3

E coli có khả năng thủy phân tryptophane trong môi trường sinh indol, không

sinh acetoin (acetyl methylcarbinol), không sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất (TCVN 5287:1994)

Hầu hết các dòng E coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong

đường tiêu hoá, ngược lại chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường tiêu hoá Tuy nhiên có ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và một

số loài động vật (Nguyễn Tiến Dũng, 2007):

- Enterobathogenic E coli (EPEC)

- Enterotocigenic E coli (ETEC)

- Enteroinvasive E coli (EIEC)

- Enterohaemorrhagic E coli (EHEC)/ verocytocin E coli (VTEC) hay E

coli O157:H7

E coli gây bệnh bằng cách phá hỏng các chức năng bình thường của hệ tiêu

hoá Các dòng E coli khác nhau có thể tiết các chất độc Những chất độc này xâm

nhập và làm tổn thương các tế bào tiêu hoá Vi khuẩn E coli chỉ có thể gây bệnh khi chúng có khả năng vào trong đường ruột, có khả năng chống chịu được các điều kiện

trong hệ tiêu hoá và có khả năng gây độc lên tế bào tiêu hoá E coli không cần có các gene đặc hiệu để vào trong đường ruột E.coli vô hại thường có khả năng vượt qua hàng rào bảo vệ ở đường ruột Thức ăn và nước uống là con đường lý tường giúp E

coli xâm nhập vào trong đường ruột Khi vào được bên trong, E coli phải có khả năng

gắn chặt vào tế bào của hệ tiêu hoá để gây bệnh Một số tạo ra pili, một số tạo ra phức hợp intimin giúp chúng bám chặt vào thành tiêu hoá

Các dòng E coli gây bệnh khi chúng xâm nhiễm vào người qua con đường thực

phẩm có thể gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, các biểu hiện lâm sàng biến động có thể từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người phụ thuộc vào

liều lượng, dòng gây nhiễm và khả năng đáp ứng của từng người (Nguyễn Tiến Dũng, 2007)

Dòng ETEC bám vào hệ tiêu hoá và tiết độc tố Chúng gây tiêu chảy không kèm theo sốt Gây bệnh phổ biến trên trẻ sơ sinh chứa plasmid mã hóa một enterotoxin Có 2 loại enterotoxin khác nhau được tìm thấy trong các dòng ETEC, cả 2 loại enterotoxin đều gây bệnh viêm ruột

Dòng EHEC bám vào tế bào nhờ một loại protein tên là intimin, chứa plasmid

mã hóa một verotoxin tiết chất độc có tên là Shiga toxin gây triệu chứng bệnh lỵ, đôi khi gây bệnh thận Độc chất của EHEC là một cytotoxin, nó phá huỷ tế bào ruột kết,

có thể gây bệnh và ảnh hưởng đến chức năng thận Điển hình nhất là dòng E.coli

O157:H7

Một số dòng gây bệnh khác hiếm gặp khác của E coli là:

EIEC (Enteroinvasive E coli) thường gây tổn thương đối với tế bào ruột già,

thường gây tiêu chảy kèm sốt

EPEC (Enteropathogenic E coli) thường gây tiêu chảy, tiêu chảy ra máu Đây

là nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại các nước kém phát triển

2.4.3 Vi khuẩn hiếu khí

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm (Trần Linh Thước, 2010)

Chỉ tiêu tổng vi sinh vật hiếu khí được dùng để đáng giá chất lượng của mẫu về

vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm (Trần Linh Thước, 2010)

từ thực phẩm hoặc các nguồn giàu dinh dưỡng khác Có thể phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng

bào tử hoặc khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi (Trần Linh Thước, 2010)

Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm

2.5 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt Bảng 1 Giới hạn chỉ tiêu vi sinh cho phép trong thịt và các sản phẩm từ thịt

(Theo Quyết định 46/2007/QĐ-BYT “Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm”)

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Mẫu thí nghiệm

Gồm 5 loại mẫu chả lụa mua từ 5 cơ sở sản xuất chả lụa trên địa bàn thành phố Cần Thơ

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.3 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 08 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

3.1.4 Vật liệu nghiên cứu

a Môi trường và thuốc thử

Dung dịch pha loãng:

Môi trường MR - VP (Methyl Red Voges Prokauer) (TCVN 5287:1994)

Pha chế: Đun để hòa tan thành phần trên trong nước cất, rót vào các ống nghiệm có

dung tích phù hợp, hấp thanh trùng ở 121oC trong 15 phút Điều chỉnh pH là 7,5  0,1

Thuốc thử Methyl Red (MR):

Thuốc thử Barritt (Trần Linh Thước, 2010)

Dung dịch A chứa 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối

Dung dịch B chứa 40% KOH hoặc NaOH

Khi sử dụng, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B Đọc kết quả sau 20 phút

Môi trường PCA (Plate Count Agar):

Môi trường YDC (TCVN 5750:1993)

Pha chế: đun sôi hòa tan thành phần trên trong nước cất, để nguội khoảng 45ºC trong

nồi cách thủy, điều chỉnh pH là 6.6 ± 0.1 ở 25ºC, chứa từng lượng có dung tích 100ml vào bình có dung tích phù hợp, hấp thanh trùng 121ºC trong 15 phút Trong trường hợp không có oxytetracyline có thể thay thề bằng chloramphenicol (C11H12C12N2O5)

và được chuẩn bị như sau: từ các lọ đã chứa 100mL môi trường không có

oxytetracyline, làm chảy môi trường và duy trì ở 45ºC trong nồi chưng cách thủy Chuẩn bị dung dịch 0.1% oxytetracyline bằng cách hòa tan 0.1g oxytetrcyline trong 100mL nước cất, lọc thanh trùng Cho 10mL dung dịch 0.1% oxytetrcyline vào 100mL môi trường đã nóng chảy, lắc để trộn đều

– Máy đồng hóa mẫu

– Tủ sấy dùng để khử trùng nhiệt khô ở 180oC

– Bếp đun cách thuỷ 45oC, 50oC  1oC

– Ống hút khắc vạch 1mL, 2mL, 5mL, 10mL

– Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)

– Tủ cấy (Totelstar Bio-II-A, Tây Ban Nha)

– Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan)

– Tủ ủ (Herich, Đức)

– Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)

– Các dụng cụ thông dụng như: đĩa petri, ống nghiệm, pipet, bình tam giác

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp thu mẫu

Kiểm tra mẫu 3 lần lặp lại, mỗi lần cách nhau 1 tháng

Cách lấy mẫu, bảo quản mẫu và chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật

– Lấy vài lát cắt trên một cây chả cho vào túi nilon

– Bảo quản ở tủ lạnh 4oC

3.2.2 Định tính hàn the 3.2.2.1 Nguyên tắc

Mẫu thực phẩm được acid hóa bằng acid hydrocloric (PA 36%), sau đó đun nóng trên nồi cách thủy, acid boric (H3BO3) hoặc natri borat (Na2B4O7) được phát hiện bằng giấy nghệ Sự có mặt của H3BO3 hoặc Na2B4O7 sẽ chuyển màu của giấy nghệ sang màu đỏ cam (Nguyễn Thị Thanh Hương, 2012)

3.2.2.2 Chuẩn bị thuốc thử

Chuẩn bị giấy nghệ từ bột nghệ: Cân 1,5 - 2 g bột nghệ cho vào bình nón dung tích

250 mL, thêm 100 mL cồn 80% lắc mạnh cho tan hỗn hợp rồi lọc qua giấy lọc Cho dịch ra một khay thủy tinh nhúng giấy lọc vào dịch lọc, chờ thấm đều lấy ra phơi khô ở nhiệt độ phòng sau đó cắt thành những dải giấy có kích thước 1x6cm Giấy nghệ được bảo quản trong lọ kín tránh ánh sáng, ẩm và hơi CO2, SO2, NH3, NO…

hoặc ly tâm Sau đó chắt lấy phần dịch trong để phân tích

+ Nếu mẫu có chất béo thì làm lạnh bằng nước đá hoặc để trong tủ lạnh rồi vớt bỏ lớp chất béo đã đông lại

+ Nếu mẫu có màu thì loại màu bằng cách cho sợi len nguyên chất vào mẫu để hấp thụ hết màu rồi lấy dịch trong không màu đem phân tích

3.2.2.4 Định tính acid boric hoặc natri borat trong mẫu thử

Nhúng dải giấy nghệ vào dịch thử cho thấm đều, lấy giấy ra để khô tự nhiên rồi đọc kết quả sau 1 giờ, nhưng không quá 2 giờ

Tiến hành đồng thời một mẫu trắng để so sánh (thay 25 g mẫu thử bằng 25 mL nước cất và làm theo quy trình trên)

Nếu màu của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam thì trong mẫu có H3BO3 hoặc Na2B4O7

Hình 4 Sự đổi màu của giấy nghệ với hàn the đối chứng 3.2.3 Đánh giá các chỉ tiêu vi sinh

3.2.3.2 Pha loãng mẫu

Dùng một pipet đã vô trùng lấy 1 mL dung dịch mẫu ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (nước peptone), tránh chạm pipet vào dịch pha loãng, được độ pha loãng 10-2, dùng máy vortex đồng nhất mẫu trong ống nghiệm sau

đó hút 1 mL mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng, được độ pha loãng 10-3

Hình 5 Các bước pha loãng mẫu 3.2.3.3 Định lượng Coliforms, E coli

a Nguyên tắc

Môi trường Endo có natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram dương Trong quá trình phát triển trên môi trường này Coliforms lên men đường lactose ở 37oC và E coli lên men đường ở 44oC tạo aldehyde và acid, aldehyde tác động đến phức chất fucshin – sulfit và giải phóng fucshin, sau đó fucshin nhuộm các khuẩn lạc thành màu đặc trưng (Lê Thanh Mai et al., 2004):

 Coliforms: khuẩn lạc từ màu hồng đến đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có thể có ánh kim hoặc không

 Escherichia coli: khuẩn lạc hồng hoặc màu đỏ có ánh kim hoặc

không, tròn bờ đều

Môi trường Simmons Citrate Agar sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất

có chứa đạm ở dạng muối ammonium, những vi sinh vật có khả năng biến dưỡng citrate sẽ sử dụng citrate và đạm ammonium và làm tăng giá trị pH của môi trường Sự

gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu chỉ thị pH trong môi trường Vì E

coli không có khả năng biến dưỡng citrate nên môi trường sẽ không đổi màu

E coli có hoạt tính tryptophanse nên khi phát triển trên môi trường có

tryptophan enzyme này sẽ xúc tác tạo thành indol Việc phát hiện indol được phát hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử có chứa p-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân bezene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quinone có màu