3.2.3.1. Xử lý mẫu
– Cân 10 g mẫu thử, thêm 90 mL nước muối sinh lý (NaCl 0,9%) ( hoặc đệm peptone). Chuẩn bị thêm 1 mẫu tương tự.
– Nghiền mẫu bằng stomacher (230 vòng/phút trong 1 phút) cho vi sinh vật hoà tan vào dịch huyền phù vi sinh vật.
3.2.3.2. Pha loãng mẫu
Dùng một pipet đã vô trùng lấy 1 mL dung dịch mẫu ban đầu cho vào ống
nghiệm chứa 9 mL dịch pha loãng (nước peptone), tránh chạm pipet vào dịch pha
loãng, được độ pha loãng 10-2, dùng máy vortex đồng nhất mẫu trong ống nghiệm sau đó hút 1 mL mẫu 10-2 cho vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch pha loãng, được độ
pha loãng 10-3.
Hình 5. Các bước pha loãng mẫu
3.2.3.3. Định lượng Coliforms, E. coli
a. Nguyên tắc
Môi trường Endo có natri sulfit và fucshin, có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram dương. Trong quá trình phát triển trên môi trường này Coliforms lên men đường
lactose ở 37oC và E. coli lên men đường ở 44oC tạo aldehyde và acid, aldehyde tác
động đến phức chất fucshin – sulfit và giải phóng fucshin, sau đó fucshin nhuộm các
khuẩn lạc thành màu đặc trưng (Lê Thanh Mai et al., 2004):
Coliforms: khuẩn lạc từ màu hồng đến đỏ cánh sen, tròn, bờ đều, có
thể có ánh kim hoặc không.
Escherichia coli: khuẩn lạc hồng hoặc màu đỏ có ánh kim hoặc
không, tròn bờ đều.
Môi trường Simmons Citrate Agar sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất
có chứa đạm ở dạng muối ammonium, những vi sinh vật có khả năng biến dưỡng
citrate sẽ sử dụng citrate và đạm ammonium và làm tăng giá trị pH của môi trường. Sự gia tăng giá trị pH được chỉ thị bằng sự đổi màu chỉ thị pH trong môi trường. Vì E. coli không có khả năng biến dưỡng citrate nên môi trường sẽ không đổi màu.
E. coli có hoạt tính tryptophanse nên khi phát triển trên môi trường có
tryptophan enzyme này sẽ xúc tác tạo thành indol. Việc phát hiện indol được phát hiện
bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử có chứa p- Dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ
kết hợp với nhân bezene của p-DMABA tạo nên một phức chất dạng quinone có màu
đỏ. 9 mL mL 9 1mL 1 mL 10-2 10-3 10-1
Thử nghiệm Methyl Red nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về
khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bề trong môi trường
trong quá trình lên men glucose. Chỉ thị này giúp phân biệt nồng độ ion H+ hiện diện trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Thử nghiệm MR (+) khi môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử. E. coli cho kết quả dương tính.
Họ Enterobacteriaceae có đặc tính chung là lên men glucose sinh hỗn hợp như
acid formic, acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể chia làm hai nhóm là nhóm không sinh 2,3-butanediol (E. coli) và sinh 2,3-butanediol (Klebsiella,
Enterobacter). Thử nghiệm Voges-Proskauer giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceae dựa trên sự oxy hoá acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxy hoá acetoin được xúc tác bởi α-naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine
trong pepton tạo thành phức có màu đỏ.
b. Phương pháp xác định b.1. Định lượng Coliforms
Hút 1 mL mẫu vào đĩa thạch môi trường Endo và trang đều trên mặt thạch mỗi
nồng độ 2 đĩa, ủ ở 37oC. Đọc kết quả sau 48 giờ - 72 giờ. Chọn những khuẩn lạc điển
hình, có màu từ hồng đến đỏ, tròn bờ đều để đếm.
b.2. Định tính E. coli
Hút 1 mL mẫu vào đĩa thạch môi trường Endo và trang đều trên mặt thạch, mỗi
nồng độ 2 đĩa, ủ ở 44oC. Đọc kết quả sau 48 - 72 giờ. Căn cứ và màu sắc và hình dạng
khuẩn lạc đặc trưng, những khuẩn lạc có màu từ hồng tới đỏ, có thể có ánh kim, tròn bờ đều. Chọn khuẩn lạc nghi ngờ để tiếp tục giám định tính chất sinh hoá.
Hình 6. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường Endo
Thử nghiệm IMViC
– Thử nghiệm khả năng sinh indol:
Chuyển mẫu vào môi trường Peptone d’indol. Ủ ở 44oC trong tủ ủ, tiến hành thử với thuốc thử Kovas’s. Nếu thuốc thử Kovas’s làm dung dịch chuyển sang màu hồng thì kết luận thử nghiệm dương tính.
Hình 7. Thử nghiệm indole
1: Thử nghiệm citrate dương tính. 2: Thử nghiệm citrate âm tính.
– Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Cấy ria trên môi trường Simmons Citrate Agar rắn trong ống thạch nghiêng. Ủ ở 35oC trong 24 - 48 giờ. Đọc kết quả.
Thử nghiệm là (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển màu xanh lam
Hình 8. Thử nghiệm citrate
1: Thử nghiệm citrate dương tính. 2: Thử nghiệm citrate âm tính.
1 2
1 2
– Thử nghiệm MR (Methyl Red)
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa vào số ống tương ứng chứa 5mL môi trường MR - VP để ở 37oC từ 48 - 96 giờ. Cho vào mỗi ống nghiệm vài giọt MR sau đó lắc đều, quan sát và ghi nhận kết quả.
Môi trường chuyển màu đỏ: MR (+). Môi trường chuyển màu vàng: MR (-)
Hình 9. Thử nghiệm Methyl Red
1: Thử nghiệm Methyl Reddương tính. 2: Thử nghiệm Methyl Red âm tính.
– Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên mỗi đĩa vào số ống tương ứng chứa 5ml môi trường MR - VP để ở 37oC từ 24 - 48 giờ. Cho vào mỗi ống nghiệm vài giọt thuốc thử Barritt sau đó lắc đều, quan sát và ghi nhận kết quả sau 20 phút.
Thử nghiệm VP là (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Hình 10. Thử nghiệm VP
1: Thử nghiệm VPdương tính. 2: Thử nghiệm VP âm tính.
1 2
c. Cách tính kết quả và kết luận c.1. Định lượng Coliforms
Chú ý: chọn tất cả các hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 - 250.
Trường hợp 1: chỉ có 1 hộp petri có số khuẩn lạc dao động trong khoảng 25 -
250 (tất cả các hộp petri còn lại có số khuẩn lạc dao động nằm ngoài khoảng trên) Công thức: N = d C C 2 2 1 Trong đó:
– N : số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu
– C1,C2 : số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp petri ở độ pha loãng đã chọn
– D : hệ số pha loãng mẫu
Trường hợp 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp petri có số khuẩn lạc dao động
từ 25 - 250 (tất cả các hộp petri khác có số khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên) Công thức tính: tương tự như trên
Trường hợp 3:ở hai độ pha loãng liên tiếp, các hộp petri có số khuẩn lạc dao
động từ 25 - 250. Khi đó, ta phải tính kết quả cho từng độ pha loãng.
Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ hơn, ta tính như sau:
N= d n n C ) 1 . 0 ( 1 2 Trong đó:
– N : số khuẩn lạc có trong 1mL mẫu huyền phù ban đầu
– C : số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn
– n1,n2 : số hộp petri ở hai độ pha loãng liên tiếp đã chọn
– d : hệ số pha loãng mẫu
Nếu kết quả thu được ở 2 độ pha loãng liên tiếp chênh lệch nhau lớn hơn 2 lần:
sử dụng độ pha loãng nhỏ hơn để tính kết quả.
Trường hợp 4: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25. Khi đó, ta
Trường hợp 5: tất cả các hộp petri đều có số khuẩn lạc lớn hơn 250. Khi đó, ta sẽ chọn hệ số pha loãng cao nhất để tính kết quả.
Trường hợp 6: không có khuẩn lạc nào mọc trên tất cả các hộp petri. Khi đó,
ta sẽ ghi kết quả là có ít hơn (1x
d
1
) khuẩn lạc. Trong đó, d là hệ số pha loãng thấp
nhất.
c.2. Định tính E. coli
Thử nghiệm IMViC nếu cho kết quả khả năng sinh indol (+), khả năng biến dưỡng citrate (-), thử nghiệm MR (+), thử nghiệm VP (-) thì kết luận E. coli (+).
3.2.3.4. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm
trên đĩa thạch
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxy phân tử ở 30oC (TCVN 5165:1990).
a. Nguyên tắc
– Cấy một lượng xác định mẫu thử nghiệm vào đĩa petri.
– Đổ thạch dinh dưỡng vào, lắc đề và ủ ở 30oC / 24 - 48 giờ trong điều kiện hiếu
khí.
– Sau 24 giờ đem tất cả những khuẩn lạc hiện diện trên đĩa petri.
b. Phương pháp xác định
Hút 1mL mẫu ở các nồng độ cho vào đĩa petri. Sau đó đổ 15 mL môi trường
PCA (nhiệt độ 45oC) vào đĩa. Mỗi nồng độ 2 lần lặp lại. Trộn đều dịch mẫu với, môi
trường bằng cách xoay đĩa petri theo hình số 8. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho
thạch đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ủ ấm ở nhiệt độ 30 - 37oC trong 24 giờ. Đếm khuẩn lạc. Tiếp tục ủ 24 giờ. Đếm khuẩn lạc tiếp tục.
Hình 11. Khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA
c. Cách tính kết quả và kết luận
Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết quả
theo công thức như trong phần trên.
3.2.3.5. Xác định tổng số nấm men, nấm mốc
a. Nguyên tắc
Hình 12. Khuẩn lạc men, mốc trên môi trường YDC
Nấm men, nấm mốc là các vi sinh vật đơn bào hoặc đa bào, hình thành khuẩn
lạc trên môi trường lựa chọn ở 25 ± 1ºC trong 48 đến 72giờ (TCVN 5750:1993). Môi
trường dinh dưỡng phải chứa chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn (chất kháng sinh như oxytetracyline hoặc chloramphenicol) (Lê Thanh Mai et al., 2004).
b. Phương pháp xác định
Hút 1ml mẫu ở các nồng độ trải lên môi trường thạch và trang đều. Ủ ở 25 ±
1ºC trong 48 - 72giờ. Đếm số khuẩn lạc nấm mốc và nấm men.
c. Cách tính kết quả
Sau khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa và tính kết quả
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 1
Khảo sát thực hiện trên 5 mẫu chả lụa được sản xuất trên 5 địa chỉ sản xuất khác nhau trên địa bàn thành phố Cần Thơ. Mẫu ở cơ sở sản xuất được ký hiệu lần lượt là M1, M2, M3, M4 và M5. Tất cả 5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của
Coliforms, E. coli, men mốc, tổng số vi sinh vật hiếu khí và hàn the. Kết quả được thể
hiện ở Bảng 2, 3 và 4.
Bảng 2. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 1
Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 -
Bảng 3. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 1
Mẫu Indol Methyl Red VP (Voges-
Proskauer) Citrate M1 - - - - M2 - - - + M3 - - - + M4 - - - + M5 - + - -
Hình 13. Mẫu chả lụa có hàn the làm đổi màu giấy nghệ
1: Thử nghiệm dương tính. 2: Thử nghiệm âm tính.
Hình 14. Thử nghiệm IMViC
1. Thử nghiệm indol 2. Thử nghiệm MR 3. Thử nghiệm VP 4. Thử nghiệm citrate
1 2 3 4
Bảng 4. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 1 Mẫu Lặp lại TSVSVHK (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E. coli (CFU/g) Men, mốc (CFU/g) M1 1 3,05×102 0 - 1,90×102 2 3,10×102 0 - 1,65×102 M2 1 2,74×104 102 - 2,60×102 2 2,78×104 1,05×102 - 2,80×102 M3 1 1,11×104 2,65×102 - 6,00×103 2 1,08×104 2,55×102 - 5,95×103 M4 1 1,71×104 3,50×101 - 4,55×102 2 1,72×104 4,00×101 - 4,55×102 M5 1 2,24×104 2,85×103 - 3,35×103 2 2,25×104 2,90×103 - 3,45×103 TC (CFU/g) ≤ 104 ≤ 50 0
Hình 15. Khuẩn lạc vi sinh vật hiếu khí
Hình 16. Khuẩn lạc men, mốc
Kết quả khảo sát lần 1 cho thấy, mẫu thứ nhất (M1) cho kết quả âm tính với hàn the, nhiễm men mốc với mật số là 1,90×102 CFU/g, TSVSVHK 3,05×102 CFU/g, Coliforms 0 CFU/g không vượt quá quy định của Bộ Y tế, mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 2 và thứ 3, kết quả thử hàn the là âm tính, nhiễm men mốc với mật số
lần lượt là 2,60×102 và 6,00×103CFU/g, TSVSVHK 2,74×104 và 1,11×104 CFU/g, Coliforms 102 và 2,65×102 CFU/g đều vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đối
với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm
indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm tính với
E. coli. Ở mẫu thứ 4, kết quả thử hàn the là dương tính, mốc men có mật số là 4,55×102 CFU/g, TSVSVHK 1,71×104 CFU/g nhiễm vượt quá quy định cho phép nhưng nhiễm Coliforms với mật số là 3,50×101 CFU/g lại không vượt quá giới hạn. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử
nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu âm
tính với E. coli. Ở mẫu thứ 5, kết quả thử hàn the là âm tính, mốc men có mật số là 3,35×103 CFU/g, Coliforms 2,85×103 CFU/g, TSVSVHK 2,24×104 CFU/g nhiễm với
mật sốcao vượt quá giới hạn của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, mẫu cho kết quả âm tính với thử nghiệm indol, VP, citrate và dương tính với thử
4.2. Kết quả kiểm tra hàn the và vi sinh các mẫu lần 2
Kiểm tra lặp lại 5 mẫu chả lụa ở 5 cơ sở sản xuất đã được kiểm tra lần 1. Tất cả
5 mẫu trên được kiểm tra sự có mặt của Coliforms, E. coli, men mốc, tổng số vi sinh
vật hiếu khí và hàn the. Kết quả được thể hiện ở Bảng 5, 6 và 7.
Bảng 5. Kết quả kiểm tra hàn the trong 5 mẫu chả lụa lần 2
Mẫu Hàn the M1 - M2 - M3 - M4 + M5 -
Bảng 6. Kết quả thử nghiệm IMViC trong 5 mẫu chả lụa lần 2
Mẫu Indol Methyl Red VP (Voges-
Proskauer) Citrate M1 - - - - M2 - - - + M3 - - - + M4 - - - + M5 - + - -
Bảng 7. Kết quả kiểm tra vi sinh gây bệnh trong 5 mẫu chả lụa lần 2 Mẫu Lặp lại TSVSVHK (CFU/g) Coliforms (CFU/g) E.coli (CFU/g) Men, mốc (CFU/g) M1 1 3,55×102 0 - 1,80×102 2 3,50×102 0 - 1,80×102 M2 1 2,75×104 1,15×102 - 3,20×102 2 3,15×104 1,20×102 - 3,45×102 M3 1 1,04×104 3,55×102 - 5,85×103 2 1,06×104 3,60×102 - 6,00×103 M4 1 2,02×104 3,50×101 - 5,60×102 2 2,03×104 4,50×101 - 5,95×102 M5 1 2,67×104 2,50×103 - 4,55×103 2 2,70×104 2,60×103 - 4,50×103 TC (CFU/g) ≤ 104 ≤ 50 0
Kết quả khảo sát lần 2 cho thấy, mẫu thứ nhất cho kết quả âm tính với hàn the, nhiễm men mốc với mật số là 1,80×102 CFU/g, TSVSVHK 3,55×102 CFU/g, Coliforms 0 CFU/g không vượt quá quy định của Bộ Y tế, mẫu không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 2 và thứ 3, kết quả thử hàn the là âm tính, nhiễm men mốc với mật số
lần lượt là 3,20×102 và 5,85×103 CFU/g, TSVSVHK 2,75×104 và 1,04×104 CFU/g, Coliforms 1,15×102 và 3,55×102CFU/g đều vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế.
Trong thử nghiệm IMViC để định tính E. coli, cả hai mẫu đều cho kết quả âm tính với
thử nghiệm indol, methyl red, VP và dương tính với thử nghiệm citrate chứng tỏ mẫu
không bị nhiễm E. coli. Ở mẫu thứ 4, kết quả thử hàn the là dương tính, mốc men có mật số 5,60×102 CFU/g, TSVSVHK 2,02×104 CFU/g nhiễm vượt quá quy định cho
phép nhưng nhiễm Coliforms 3,50×101 CFU/g lại không vượt quá giới hạn. Đối với
coli. Ở mẫu thứ 5, kết quả thử hàn the là âm tính, mốc men có mật số 4,55×103 CFU/g, Coliforms 2,50×103 CFU/g, TSVSVHK 2,67×104 CFU/g nhiễm với tỷ lệ cao vượt quá
giới hạn của Bộ Y tế. Đối với thử nghiệm IMViC để định tính E.coli, mẫu cho kết quả
âm tính với thử nghiệm indol, VP, citrate và dương tính với thử nghiệm methyl red