... nấm men lên men rƣợu vang, định nghiên cứu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng nitơ đến trình lên men rượu vang nho cabernet sauvignon’’ Mục tiêu đề tài Nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng nitơ đến trình lên. .. định suốt trình lên men nhiệt độ ảnh hƣởng đến 11 trình lên men chất hình thành 1.5.4 Ảnh hưởng thời gian lên men Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang Trong... chủng nấm men S.cerevisiae M1 môi trƣờng nhân giống môi trƣờng lên men 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng nguồnnitơ nồng độ khác đếnquá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon 3.4 Lên men vang nho
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 ---------- MAI THỊ THU THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƢƠNG CỬA NITƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƢỢU VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Phạm Quang Thảo HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô giáo, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phạm Quang Thảo ngƣời đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu đề này. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơnBan Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trƣờngĐại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những ngƣời luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài. Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Mai Thị Thu Thảo LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là kết quả của riêng Em. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử ly thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung. Trong đề tài, Em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, em xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình. Nếu sai Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng Sinh viên Mai Thị Thu Thảo năm 2015 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CHỮ VIẾT TẮT 1. CNS : Chất nguyên sinh 2. ĐHSP : Đại học sƣ phạm 3. HL : Hàm lƣợng 4. Nxb :Nhà xuất bản 5. S.cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae 6. SLTB : Số lƣợng tế bào 7. TĐC : Trao đổi chất 8. TG : Thời gian 10. VSV : Vi sinh vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài...................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2 3.Nội dung của đề tài................................................................................... 3 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài ..................................................... 3 5.Điểm mới của đề tài ................................................................................. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4 1.1. Tổng quan về đối tƣợng. ....................................................................... 4 1.1.1.Thành phần của rƣợu nho ................................................................ 4 1.1.2. Phân loại vang ................................................................................ 4 1.1.3. Tình hình sản xuất rƣợu vang ......................................................... 5 1.2. Tổng quan về cây nho........................................................................... 5 1.2.1. Sơ lƣợc về cây nho ......................................................................... 5 1.2.2. Thành phần cấu tạo quả nho ........................................................... 6 1.3. Các hệ sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang...... 6 1.3.1. Nấm men ........................................................................................ 6 1.3.2. Vi khuẩn ......................................................................................... 7 1.3.3. Nấm mốc ........................................................................................ 7 1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang .............................................................. 7 1.3.5. Bệnh vang ...................................................................................... 7 1.4.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men ............................................................................................... 8 1.4.1. Nguồn nitơ ..................................................................................... 8 1.4.2. Nguồn Photpho............................................................................... 9 1.4.3. Nguồn nguyên tố khoáng ................................................................ 9 1.4.4. Nguồn oxi....................................................................................... 9 1.4.5. Nguồn cacbon............................................................................... 10 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ...................................... 10 1.5.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng và men giống .......................... 10 1.5.2. Ảnh hƣởng của độ pH và nồng độ cồn .......................................... 10 1.5.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................... 11 1.5.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên men ................................................. 12 1.6. Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rƣợu vang ........................................................................................... 12 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 14 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất ........................................................ 14 2.1.1. Nguyên liệu chính ........................................................................ 14 2.1.2. Hóa chất và thiết bị....................................................................... 14 2.1.3. Các loại môi trƣờng ...................................................................... 14 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 16 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh ...................................................................... 16 2.3. Địa điểm thực hiện đề tài .................................................................... 18 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 19 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men S.cerevisiae ............................. 19 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho ........ 22 3.2.1. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S. ceresvisiae M1 trong quá trình nhân giống ..................................................................... 24 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ở các hàm lƣợng khác nhau đến quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon ............................................... 28 3.3.1. Ảnh hƣởng của ni tơ hữu cơ ......................................................... 28 3.3.2. Ảnh hƣởng của ni tơ vô cơ ........................................................... 29 3.4.3. Nghiên cứu sự ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến sự phát triển của nấm men .......................................................................... 31 3.5. Lên men vang nho cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm ...... 32 3.5.1. Lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm ............................... 32 3.5.2. Quy trình công nghệ lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm 34 3.5.3. Thuyết minh công nghệ ................................................................ 35 KÊT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 39 DANH MỤC BẢNG – HÌNH BẢNG Bảng 3.1. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men................................. 22 Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men .................................. 23 Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng, phát triển của chủng M trong môi trƣờng nhân giống .................................................................................... 24 Bảng 3.4. Sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và hàm lƣợng cồn trong quá trình lên men vang nho cabernet sauvignon .......................................... 26 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng pepton trong quá trình phát triển của nấm men ................................................................................ 28 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của các nguồn ni tơ vô cơ đến sự sinh trƣởng, phát triển của nấm men. ................................................................ 30 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp với sự phát triền của nấm men ................................................................................ 31 Bảng 3.8. Kết quả phân tích quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon ....................................................................... 33 HÌNH Hình 3.1. Nấm men S.cerevisiae M1 phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa ..... 20 Hình 3.2 Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 thu đƣợc từ môi trƣờng thạch nghiêng ............................................................. 21 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào của chủng nấm men S.cerevisiae M1 độ phóng đại 1000 lần ................................................................................. 21 Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn HL đƣờng sót và HL cồn Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh trƣởng phát triển của nấm men trên môi trƣờng nhân giống. ......................................................... 25 Hình3.6. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lƣợng đƣờng và hàm lƣợng cồn trong quá trình lên men vang nho ......................................... 27 Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hƣởng của pepton ở hàm lƣợng 4-5g/l các tế bào nấm men sinh trƣởng và phát triển tốt ........................ 29 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng của ni tơ vô cơ đến sự sinh trƣởng, phát triển của nấm men ............................................................... 30 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp với sự phát triền của nấm men .................................................... 32 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đềtài Khác với các loại rƣợu trắng hay các loại rƣợu đƣợc pha chế khác, rƣợu vang là loại rƣợu có độ cồn nhẹ đƣợc lên men trực tiếp từ dịch ép trái cây mà không cần qua quá trình trƣng cất, là một đồ uống có giá trị dinh dƣỡng cao, có hƣơng vị thơm ngon và rất có lợi cho sức khỏe khi dùngmộtcách điều độ, rƣợu vang có thể giúp giảm béo, kích thích ăn ngon miệng, có lợi cho tiêu hóa, tuần hoàn và timmạch. Đặc biệt rƣợu vang có thể ngăn ngừa ung thƣ vú [4]. Trên thế giới đặc biệt là các nƣớc châu Âu rƣợu vang đã có từ lâu đời. 5000 năm về trƣớc ngƣời Ai Cập và Babilon đã sử dụng đồ uống lên men từ dịch trái nho, nhƣng công nghệ sản xuất rƣợu vang chỉ thực sự đƣợc thế giới biết đến khi nhà khoa học ngƣời Pháp Luispasteur công bố kết quả nghiên cứu về quá trình lên men rƣợu vào năm 1857 và chỉ ra vai trò của nấm men trong sản xuất rƣợu. Hiện nay quy trình và mô hình sản xuất rƣợu vang ngày càng hiện đại bởi nhu cầu của ngƣời tiêu dùng ngày càng lớn, không chỉ đƣợc ngƣờiÂu -Mỹ ƣa chuộng mà ngƣời châu Á cũng đã làm quen với rƣợu vang trong mỗi bữa ăn. Ở Việt Nam ngành sản xuất rƣợu vang mới thực sự bắt đầu vào những năm 80 của thế kỷ 20 với một số nhãn hiệu nhƣ vang Thăng Long, vang Đà Lạt… Nguồn sản xuất rƣợu vang rất phong phú và đa dạng, rƣợu vang không chỉ đƣợc làm từ nho mà còn đƣợc làm từ nhiều loại quả khác nhƣ dâu, mơ, táo mèo, vải, mận vv… các loại quả này đều chứađƣờng, axitamin, vitamin, khoáng, tại nƣớc ta những loại quả này đƣợc trồng rất phổ biến, cho sản lƣợng lớn. Tuy nhiên trong số đó nho là loại quả thích hợp nhất, nho vốn là 1 nguồn nguyên liệu phổ biến, rộng rãi nhất trong lên men rƣợu vang. Bởi trong trái nho chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao từ 15% - 20% ở dạng dễ lên men. Nho còn chứa nhiều muối khoáng nhƣ K, P, Mg… thích hợp cho quá trình lên men dễ dàng tạo độ rƣợu cao, ức chế hoạt động của vi sinh vật có hại, rƣợu bảo quản đƣợc lâu. Nho đƣợc phân bố ở các vùng cận nhiệt và nhiệt đới. Ở Việt Nam nho đƣợc trồng nhiều với diện tích lớn chủ yếu ở các tỉnh Ninh Thuận và Bình Thuận với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt. Giống nho Cabernet sauvignon là một trong những giống nho làm rƣợu vang đỏ nổi tiếng, có nguồn gốc từ vùng thung lũng sông Rhôme, đƣợc lai tạo từ hai dòng nho là Dumit (đỏ) và Mondeuse Blanche (trắng) cây sinh trƣởng khỏe, năng suất cao, cho chất lƣợng rƣơụ tốt, phù hợp với khí hậu của những vùng có diện tích trông nho lớn của nƣớc ta, nho Cabernet sauvignon là hƣớng đi mới cho nghành trồng nho và sản xuất rƣợu vang khi nhu cầu tiêu thụ rƣợu vang ngày càng lớn. Nitơ là một nguyên tố quan trọng tham gia vào cấu trúc protein, axitamin. Nấm men sử dụng nitơ tổng hợp tế bào mới và các enzim proteaza trong quá trình sinh trƣởng và sinh sản. Trong quá trình lên men việc cung cấp đủ lƣợng nitơ để nấm men có thể đồng hóa là rất cần thiết. Nó ảnh hƣởng tới tốc độ chuyển hóa đƣờng thành rƣợu và khả năng chịu cồn của nấm men. Vì vậy nitơ đóng một vai trò quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men trong lên men rƣợu vang, do đó chúng tôi quyết định nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ đến quá trình lên men rượu vang nho cabernet sauvignon’’ 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ đến quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon. 2 3. Nội dung của đề tài 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp để lên men rƣợu vang nho carbernet sauvignon. 3.2. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M1 trong môi trƣờng nhân giống và môi trƣờng lên men 3.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồnnitơ ở nồng độ khác nhau đếnquá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon. 3.4. Lên men vang nho cabernet sauvignon quy trình lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm. 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 4.1.Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho cabernet sauvignon. Kết quả nghiên cứu này là giữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của nấm men trong đời sống. 4.2.Ý nghĩa thực tiễn Nhằm sản xuất một loại vang từ nho cabernet sauvignon đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời tiêu dùng góp phần phát triển ngành công nghiệp sản xuất rƣợu vang, đem lại giá trị kinh tế cho nông nghiệp và công nghiệp, mang lại nguồn lợi nhuận nông sản cho bà con nông dân. 4. Điểm mới của đề tài Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men S.cerevisiae M1 có khả năng lên men vang nho cabernet sauvignon. Tìm đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của chủng nấm men M1cerevisiaelên men vang nho cabernet sauvignon. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về đối tƣợng. 1.1.1.Thành phần của rượu nho Cồn etanol: do lên men tƣn nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn andehit, este. Độ cồn trong rƣợu vang từ 10-12 nên nhiều ngƣời uống đƣợc. Đƣờng: đƣờng đơn, đƣờng kép lànguyên liệu để tạo nên các loại rƣợu trong quá trình lên men rƣợu vang, đƣờng trong vangkhoảng 62- 132 (g/l). Axit hữu cơ, axit vô cơ: axit malic, axit xi tric… rƣợu vang là loại đồ uống có độ chua cao. Hl axit tổng số từ 4-7 (g/l). Độ pH của vangtừ 3-4.Các axitamin và vitamin: có vai trò quan trọng đối với sự sản và phát triển của nấm men đồng thời làm cho vang có vị đặc trƣng. 1.1.2. Phân loại vang Có nhiều cách phân loại rƣợu vang khác nhau dựa vào màu sắc, đặc điểm chủng trái cây, nhà sản xuất, công nghệ sản xuất. Theo màu sắc: Vang trắng ( Aliwen trắng) Vang đỏ (Aliwen đỏ) Vang hồng (Aliwen hồng) Vang xám Theo hàm lƣợng đƣờng trong rƣợu: Vangchát hay vang khô ( hết đƣờng) Vang ngọt ( còn đƣờng) Vang bán khô Vang mềm Theo xu hƣớng chung vang đƣợc chia thành hai nhóm chính: 4 Vang không có gas: tức là trong vang thành phần không có co2. Vang có gas: trong vang thành phẩm có co2 vang bọt, sâm banh[10]. 1.1.3. Tình hình sản xuất rượu vang 1.1.3.1. Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới Rƣợu vang có một lịch sử phát triển rất lâu đời, trong đó châu Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80% tổng sản lƣợng rƣợu vang trên toàn thế giới, châu Mỹ 14%, châu Phi 5%, châu Á - Úc 0.5%[13], [14]. Nho cabernet sauvignon là một trong sáu dòng nho đƣợc trồng phổ biến trên thế giới, là nguyên liệu đƣợc nhiều nhà sản xuất sử dụng,tạo nên nhiều thƣơng hiệu rƣợu nổi tiếng nhƣ Trinity Gold Cabernet sauvignon, Chateau Reynella Cabernet sauvignon. 1.1.3.2. Tình hình sản xuất rượu vang trong nước Tại Việt Nam rƣợu vang đã trở thành thức uống phổ biến. Theo thống kê của hiệp hội rƣợu bia và nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng tăng hàng chục triệu lít mỗi năm, các sản phẩm buắt đầu đƣợc xuất khẩu đến một số nƣớc trên thế giới, vang Đà Lạt, Anh Đào, Sao Lala là những sản phẩm đƣợc yêu thích ở Việt Nam bởi mùi vị và chất [4]. 1.2. Tổng quan về cây nho 1.2.1. Sơ lược về cây nho Nho là một từ chỉ các loại quả mọc trên các cây dạng dây leo thân gỗ hoặc để chỉ chính các loại cây này. Các loại cây này thuộc về họ Vintaceae. Vitis Vinifera là thuật ngữ la tinhcổ cho những cây nho giống, chúng có nguồn gốc từ vùng Cận Đông, khi con ngƣời thuần hóa những cây nho dại, nhƣng rất nhiều chủng và dòng vô tính của nó đƣợc tồng rộng rãi ở châu Âu nơi sản xuất vang nhiều nhất thế giới. Nho Cabernet sauvignon lá có màu xanh, phân thùy sâu, cuống lá, cành 5 non có màu xanh, quả hơi tròn, khi chín có màu đỏ tím, thời gian từ khi cắt cành đến khi ra hoa khoảng 25 ngày, từ cắt cành đến thu hoạch khoảng 90 ngày, số quả/chùm khoảng 100 quả, khối lƣợng của một quả/1,5g. Kháng sâu bệnh rất tốt, thích hợp cắt cành 3 vụ/ năm. 1.2.2. Thành phần cấu tạoquả nho Quả nho mọc thanh chùm, quả nho có nhiều màu sắc nhƣ lam, tím, vàng, lục, đỏ tía hay trắng, khi chín nho đƣợc ủ rƣợu, sấy khô, hạt ép thành dầu. 1.3. Các hệ sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang và bệnh vang 1.3.1. Nấm men Nấm men (yeast) là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản chủ yếu bằng phƣơng pháp nảy chồi, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhƣ trong đất, nƣớc, vỏ các loại quả. Nấm men có hình trứng, hình ovan, hình dạng có thể thay đổi điều kiện nuôi cấy và tuổi tế bào, nấm men có hình trắng đục, vàng nhạt bề mặt khô và căng. Thành phần tế bào của nấm men:Thành tế bào của nấm men đƣợc cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit, và glucozamin. Glucan là hợp chất cao phân tử của Dglucoza, mannan là hợp chất cao phân tử của D-Manoza. Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dƣỡng đƣợc hấp thu và các quá trình trao đổi chất đƣợc thải ra. Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8nm có cấu tạo tƣơng tự nhƣ màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Tế bào chất: nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân. Cũng nhƣ nhân tế bào của vi sinh vật bậc cao, nhân tế bào có ADN còn có protein và nhiều loại men. Ty thể: khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống tế bào bậc cao, đó là cơ quan sinh trƣởng của tế bào, ty thể nấm men có hình bầu dục, đƣợc 6 bao bọc bởi hai lớp màng. Riboxom: Tế bào nấm men có hai loại là loại 80s Sinh sản của nấm men Nấm men sinh sản bằng hai hình thức sinh sản vô tính và hữu tính. Các tế bào nấm men nói chung và nấm men thuộc chi S,cerevisiae nói riêng sinh sản chủ yếu theo lối nảy chồi. Khi tế bào phát triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể nó xuất hiện mầm hay chồi. Khi một chồi xuất hiện thì enzim thủy phân phân giải một phần polysacarit của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Ở mỗi chồi nhận đƣợc phần CNS và chất nhân của tế bào mẹ. Sau khi nảy chồi tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ mà lại tiếp tục nảy mầm tạo ra một tập hợp tế bào nấm men có hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một chồi nấm men trở thành một tế bào con và tách khỏi tế bào mẹ khoảng 20-30 phút. Ngoài ra chúng còn một hình thức sinh sản khá phổ biến đó là sinh sản bằng bào tử túi [4], [7]. 1.3.2. Vi khuẩn Trong dịch nho cũng nhƣ trong rƣợu vang có rất nhiều vi khuẩn. Những loại này có thể làm cho rƣợu vang ngon hơn hoặc cũng có thể làm xấu đi hƣơng vị hoặc làm hỏng rƣợu vang. Do đó chúng ta phải tạo điều kiện cho các loài vi khuẩn có lợi phát triển, hạn chế các loài có hại phát triển. 1.3.3. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở vỏ quả, bã của quá trình sản xuất, thùng chứa. 1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang Có khá nhiều vi sinh vật làm vang bị đục, chua, gắt, làm hỏng vang nhƣ acetobactexylium, acetobacter aceti. 1.3.5. Bệnh vang Hiện tƣợng bệnh vang của lên men rƣợu vang đƣợc Pasteur nghiên cứu 7 và khám phá. Đó là hiện tƣợng rƣợu bị chua đi và chất lƣợng rƣợu bị giảm rất nhanh. Hiện tƣợng trên là nguyên nhân rƣợu vang tiếp xúc với không khí và do vi khuẩn axetic phát triển đã biến cồn thành axetic. Ngoài ra bệnh vang cũng có thể do các vsv lên men kỵ khí gây ra Bệnh vang dính Đặc điểm: Vang không chảy đều, lỏng nhƣ nƣớc mà dính lại. Bệnh này thƣờng kéo theo bệnh chua và đắng. Nguyên nhân: do vi khuẩn lactic tiết ra một loại đƣờng riêng là dextran. Bệnh vang đắng Đặc điểm: rƣợu bị chua và có vị đắng Nguyên nhân: do vi khuẩn lac tic phá hủy glixerin tạo thành các acrolin. Vang chua lactic Đặc điểm: rƣợu có vị chua khó chịu. Nguyên nhân: khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đƣờng, kỹ thuật lên men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy men chƣa đủ, nhiệt độ cao, thiếu oxy,... vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đƣờng khử thành đƣờng manit và axit bay hơi. Vang bị đục Đặc điểm: vang có màu đục, không trong. Nguyên nhân: Do xuất hiện những kết tủa trong rƣợu hay sự oxy hóa của thành phần polyphenol có trong nguyên liệu làm rƣợu, hoặc do sự tạo thành kết tủa bông protein của thành phần tanin trong rƣợu và một số dạng kết tủa khác [11]. 1.4.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men 1.4.1. Nguồnnitơ Ni tơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, nó là một 8 trong những nguyên tố cấu thành nên acid nucleic. nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid nên không thể phân cắt abumin của môi trƣờng mà phải cung cấp nito ở dạng hòa tan,có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thƣờng dùng là axitami, pepton, amid, ure,. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sunlfat… 1.4.2. NguồnPhotpho Có vai trò quan trọng đối với tế bào nấm men, là nguyên liệu tổng hợp axit nucleic, các enzim, các hợp chất cao năng ATP. 1.4.3. Nguồn nguyên tố khoáng Trong môi trƣờng dinh dƣỡng cần có một lƣợng khoáng để đảm bảo cho sự phát triểncủa tế bào nấm men. Lƣu huỳnh tham gia vào thành phần của một số acid amin, albumin, vitamin, và enzim. Magie tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men, sắt tham gia vào thành phần của enzim, sự hô hấp và quá trình khác.Kali chứa nhiều trong nấm men, thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào quá trình lên men rƣợu và góp phần phục hồi photphorin hóa của axitpyruvic. Ni tơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, nó là một trong những nguyên tố cấu thành nên acid nucleic. nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid nên không thể phân cắt abumin của môi trƣờng mà phải cung cấp nito ở dạng hòa tan,có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thƣờng dùng là axitami, pepton, amid, ure,. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sunlfat… 1.4.4. Nguồn oxi Hầu hết các chủng nấm men trong lên men trong lên men rƣợu vang thuộc chủnggiống saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong môi trƣờng đủ lƣợng oixi nấm men phân huỷ đƣờng dùng làm 9 nguồn năng lƣợng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối. 1.4.5. Nguồn cacbon Hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim và sản phẩm trao đổi chất. 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 1.5.1. Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống Đƣờng là yếu tố trực tiếp đến hoạt động của nấm men và quá trình lên men. Môi trƣờng có nồng độ đƣờng từ 10 – 25% thuận lợi cho sự lên men, khi nồng độ đƣờngtừ 25% trở lên thì sự lên men khó khăn hoặc chậm.Dung dịch đƣờng có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thƣờng của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài, sự dụng đƣờng không triệt để, hiệu suất tạo thành rƣợu từ một đơn vị đƣờng giảm, lƣợng đƣờng tạo ra không nhiều, đồng thời nồng độ rƣợu tạo thành lớn sẽ ức chế sự hoạt động của nấm men. Ngƣợc lại môi trƣờng lên men có nồng đƣờng quá thấp sẽ không đủ cơ chất cho nấm men hoạt động. Đối với đa số nấm men vang, khi tăng nồng độ đƣờng trong môi trƣờng hơn 30% thì hiệu suất cồn etylic tạo ra giảm dần [9]. Hàm lƣợng men giống đóng vai trò quan trọng đến quá trình sinh trƣởngcũng nhƣ quá trình lên men của nấm men. Hàm lƣợng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì quá trình lên men càng kéo dài hơn, dễ bị nhiễm vi khuẩn. ngƣợc lại hàm lƣợng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men ngắn hơn. Nhƣng hàm lƣợng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trƣờng lên men, sẽ không có lợi cho quá trình lên men, ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu. Nhìn chung hàm lƣợng men giống thích hợp cho quá trình lên men khoảng 10%. 1.5.2.Ảnh hưởng của độ pH và nồng độ cồn pHcủa môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình phát triển của nấm 10 men. Tuy nhiên, pH tối ƣu cho sự phát triển và lên men rƣợu của nấm men không cố định, pH này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng nấm men. Thành phần của môi trƣờng lên men, điều kiện lên men. Đối với các loại nấm men rƣợu vang pH tối ƣu vào khoảng 4 – 5. Tuy nhiên ở pH = 3 – 3.5 nhiều chủng vẫn phát triển tốt, vì vậy khi lên men rƣợu vang ngƣời ta thƣờngchọn những chủng nấm men hoạt động và phát triển tốt ở pH:3.2 – 4, đồng thời ở pH này sẽ hạn chế sự phát triển của vi sinh vật làm hỏng vang[5]. Cồn là sản phẩm quan trọng của quá trình lên men rƣợu vang, thƣờng chứa từ 10- 14%. Tuy nhiên nó có thể ức chế hoạt động của nấm men. Khi độ cồn bằng 1.5% thể tích thì bắt đầu ức chế sự phát triển và sinh sản của nấm men. Khi hàm lƣợng cồn tăng đến 5%thể tích thì bắt đầu ức chế sự sinh sản của nấm men. Nồng đọ cồn lên 7-8% thể tích thì quá trình lên men giảm dần. Ảnh hƣởngcủa nồng độ cồn lên các loại nấm men không giống nhau. Đa số các loại nấm men ở điều kiện tối ƣu chịu đƣợc nồng độ cồn khoảng 14 – 16% thể tích [9]. 1.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ của môi trƣờng lên men có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của quá trình lên men và chất lƣợng sản phẩm. mỗi loài vi sinh vật có nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Sacharomyces nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của nấm men là từ 28oC– 32oCNếu nhiệt độ thấp hơn 32oC thì nấm men sinh trƣởng phát triển kém, thời gian lên men kéo dài. Nếu nhiệt độ cao hơn 32oCtốc độ sinh trƣởng phát triển của nấm men mạnh nhƣngdễ bị nhiễm khuẩn vì đây là nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Sự lên men ở nhiệt độ thấp sẽ tốt hơn lên men ở nhiệt độ cao vì rƣợu sẽ trong hơn, giúp quá trình tạo hƣơng, mùi vị hài hòa. Ngoài ra ở nhiệt độ cao nấm men phát triển càng nhanh thì sự chuyển hóa đƣờng thành rƣợu càng kém, đồng thời nấm sẽ tiết nhiều chất phụ.nên giữ nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men do nhiệt độ ảnh hƣởng đến quá 11 trình lên men và các chất hình thành. 1.5.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang. Trong thời gian lên men chính, nếu thời gian lên men quá ngắn, có thể lƣợng cồn tạo ra quá ít. Trong thời gian lên men phụ, nếu thời gian lên men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc trƣng. Đối với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 7-20 ngày.Thời gian lên men phụ và tàng trữ ít nhất phải vài tháng trở lên. 1.6. Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rƣợu vang Nấmmen S.cerevisiae đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất. Chủng nấm men này có khả năng lên men này có khả năng lên men dịch có HL đƣờng cao và tạo đƣợc 20 % - 30 % V cồn. Sự lên men rƣợu đƣợc biểu diễn bằng PTTQ: CHO → 2CH CH OH + 2CO + 33 Kcal Quá trình lên men đƣờng thành rƣợu là một dãy oxy hóa khử nhờ hệ thống enzim trong tế bào nấm men. Tốc độ lên men còn phụ thuốc tùy từng loại nấm men thuộc chủng nấm men sacharomyces, tùy thuộc từng loại đƣờng. Quá trình lên men đƣờng thành rƣợu trải qua một chuỗi phản ứng hóa học, chia 5 giai đoạn: Giai đoạn 1: Biến đổi glucozơ thành fructozơ – 1,6 điphotphat dƣới tác dụng của enzim hexokinaza và isomeraza. Giai đoạn 2: Từ fructozơ – 1,6 diphotphat biến đổi thành 3 – photphoglixeraldehit và photphodiosiaxeton dƣới tác dụng của enzim andolaza. Giai đoạn 3: Trƣớc hết là 3 – photphoglyxerat nhờ xúc tác của của các enzim photphoglyxeratmutaza. Sản phẩm cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2 – photphoglyxerat thành axit piruvic dƣới tác dụng của enzim 12 aldolaza và kinaza. Giai đoạn 4: Axit pyruvic phân cách thành axetaldehit đồng thời giải phóng CO2 dƣới tác dụng enzim decacboxylaza. Giai đoạn 5: Tạo etanol từ axetandehit nhờ tác dụng của enzim alcoldehidrogennaza [2]. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men vì lƣợng đƣờng còn lại ít trong môi trƣờng lên men, nấm men đã sử dụng glycogen đã đƣợc tích lũy trong đó, do đó HL glycogen trong tế bào giảm dần. Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces là khác nhau đối với mỗi loại đƣờng. Tốc độ lên men với đƣờng glucoza và fructoza nhanh hơn đƣờng saccaroza. Tốc độ lên men với đƣợc xác định bằng lƣợng co2 bay ra từ thể tích môi trƣờng nhất định. Kết quả của quá trình lên men rƣợu là một sản phẩm có thành phần phức tạp,những vật chất cơ bản của dịch quả khi lên men đã chịu những biến đổi lớn, ngoài sự biến đổi của đƣờng, đạm cũng chịu nhiều biến đổi hóa học, từ axitamin tƣơng ứng tạo ra các rƣợu bậc cao nhƣ: amylic, propyonic, izobutylic. 13 CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và hóa chất 2.1.1.Nguyên liệu chính Dịch siro nho cabernetsauvignon Chủng nấm mennghiên cứu phân lập từ dịch siro quả nho có vị trí phân loại theo Yelinv N.P ( 1996) sau đây: Lớp: Hemiascomycetes Bộ: Endomycetales Họ: Saccharomycetaceae Chi: Saccharomyces Loài: cerevisiae 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Hóa chất: MgSO4, agar, pepton, các loại muối, các loại đƣờng. 2.1.2.2. dụng cụ va thiết bị Dụng cụ: bình tam giác, ống nghiệm, hộp lồng, que trang, phễu thủy tinh, đèn côn,que cấy. Thiết bị:tủ sấy, nồi hấp, buồng cấy vô trùng, cân phân tích, kính hiển vi, đƣờng kế, cồn kế 2.1.3. Các loại môi trường 14 2.1.3.1. Môi trường Hansen (MT1) Hóa chất g/l Đƣờng glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H2O 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Thạch agar 20ml Nƣớc 1000ml 2.1.3.2. Môi trường nhân giống ( MT2) Hóa chất g/l Đƣờng glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H2O 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Thạch agar 20ml Nƣớc 1000ml 2.1.3.3 Môi trường lên men (MT3) Hóa chất g/l Dịch siro hoa quả 200ml MgSO4.7H2O 0.5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Thạch agar 1000ml 15 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.1.1. Phương pháp tuyển chọn nấm men trên môi trường thạch đĩa Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi trƣờng Hansen 2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống trước khi lên men Để có những tế bào tokhỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 28-30 C trong 24h. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men [8]. 2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt lức lên men của nấm men Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dùng các phƣơng pháp sau: Phƣơng pháp cân trọng lƣợng bình: Dịch lên men trong các bình cùng thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa hai lần là 0,1 thì dừng lại [5]. Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev 2.2.1.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi Tế bào nấm men đƣợc nhuộm đơn bằng cách: lấy một lƣợng nhỏ tế bào từ ống thạch nghiêng, dàn đều trên lam kính có chứa một giọt nƣớc cất rồi cố định trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ 1-2 giọt xanh metylen lên vết bôi, để trong 2-3 phút rồi rủa bằng nƣớc cất. Làm khô tiêu bản rồi quan sát trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 2.2.1.5. Phương pháp phân tích 2.2.5.1. Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế 2.2.5.2. Xác định độ cồn bằng ancol kế và phƣơng pháp hóa học 16 2.2.5.3. Xác định Ph bằng giấy đo pH 2.2.5.4. Xác định hàm lƣợng axit trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N.từ số ml dung dịch NAOH0,1 N dùng đẻ chuẩn độ ta xác định đƣợc hàm lƣợng axit có trong dung dịch [6]. 2.2.1.6. Phương pháp xác định khả năng kết lắng Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định trên tốc độ nắng của sinh khối, cách tiến hành nhƣ sau: hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (Ph= 4.5) trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc bằng nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn tòan bằng nhau. Sau đó đem lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. Khối dịch chia thành 2 lớp bằng, phần đáy là nấm men.Tiến hành đo lớp kết lắng của chủng nấm men trong các ống nghiệm. Ống nghiệm nào cócó chiều cao kết lắng cao nhất tức là có độ kết lắng tốt nhất[8]. 2.2.1.7. Phương pháp cảm quan Sử dụng các giác quan đánh giá về giá trị cảm quan khác nhau (màu sắc, độ trong, mùi vị,…). 2.2.1.8. Phương pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ: Số trung bình cộng: dùng để tính trung bình các lần lặp lại thí nghiệm Trong đó: M: trung bình tổng thể Mi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lân thứ n n: số lần thí nghiệm 17 Độ lệch chuẩn: Trong đó: : độ lệch chuẩn X i: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần n M: trung bình tổng thể Sai số trung bình: Hệ số biến động: Trong đó: CV: Hệ số biến thiên tổng thể 2.3. Địa điểm thực hiện đề tài PTN vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN trƣờng đại học sƣ phạm hà nội 2. 18 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men S.cerevisiae Những chỉ tiêu định hƣớng lựa chọn chủng nấm men: Nấm men đóng vai trò quan trọng với toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng vang. Bên cạnh những chỉ tiêu hình dạng, kích thƣớc khuẩn lạc, độ nhẵn bóng còn phải chú ý đến chỉ tiêu sau: Chịu đƣợc độ cồn và độ aixit cao Có khả năng lên men tốt trong môi trƣờng có HL đƣờng cao. Có hiệu suất lên men cao. Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn. Tạo đƣợc hƣơng thơm và vị đặc trƣng. Dễ lắng trong và dễ lọc. 3.1.1. Phân lập chủng nấm men S.cerevisiae từ dịch nho cabernet sauvignon Trong dịch quả đã có những giống nấm men có sẵn, các giống này có khả năng chịu đƣợc những điều kiện khác nhau nhƣ HL đƣờng cao, độ axit cao,... Chọn nguồn nguyên liệu có chất lƣợng tốt, đảm bảo chất lƣợng và nguồn gốc xuất xứ. Sau đó tiến hành phân lập trên môi trƣờng vô trùng môi trƣờng phân lập thực hiện trên môi trƣờng Hansen. Cách tiến hành: Phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa đã vô trùng, chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dùng pipet hút 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch hoa quả cho vào ống thứ nhất( dịch pha loãng ở 10^-10). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch có nồng độ pha loãng ở 10^-2. Làm tƣơng tự với các ống tiếp theo cho đến ống9 sẽ có độ 19 pha loãng 10^-9. Có thể chọn ở các nồng độ 10^-6 – 10^-9 Phân lập:Dùng pipet hút 1- 2 giọt dịch pha loãng nhỏ vào đĩa petri có sẵn môi trƣờng han sen đã đƣợc khử trùng. Sau đó dùng que trang dàn đều lên mặt thạch. Đặt ngƣợc các hộp petri xuống, dùng giấy báo gói lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300c. Sau 2-3 ngày lấy ra quan sát. Trên bề mặt thạch ta thấy xuất hiện những khuẩn lạc, dựa vào hình thái khuẩn lạc nấm men ta chọn những khuẩn lạc to, tròn, nhẵn, lồi, nhẵn bóng có màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Kết quả phân lập cho ra đƣợc3 mẫu nấm men dùng làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo. Hình 3.1. Nấm men S.cerevisiae M1 phân lập trên môi trường thạch đĩa Sau đó các khuẩn lạc này chúng tôi cấy sang các ống thạch nghiêng đã có sẵn môi trƣờng Hansen vô trùng để giữ giống, sau 2-3 ngày lấy ống thạch nghiêng ra quan sát, làm tiêu bản soi kính để kiểm tra hình thái tế bào nấm men. Kí hiệu cho các chủng nấm men thu đƣợc là M1, M2, M3. 20 Hình 3.2 Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 thu được từ môi trường thạch nghiêng Hình 3.3 Hình ảnh tế bào của chủng nấm men S.cerevisiae M1độ phóng đại 1000 lần 21 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho 3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men bằng hàm lượngCO2 thoát ra Quá trình lên men của 3 chủng nấm men đƣợc biểu thị bằng HL co2 sinh ra. Lƣợng CO2sinh ra và thoát khỏi môi trƣờng càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu bằng cách cho các chủng nấm men vào môi trƣờng dịch quả 100ml có hàm lƣợng đƣờng 250g\l, pH: 4, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 10^ 6, nhiệt độ 25- 300C. Sau 72h mở nắp bình lên men đem cân trọng lƣợng bình ta thấy trọng lƣợng bình giảm đó chính là lƣợng co2 thoát ra. Kết quả đƣợc dẫn ra bảng Hoạt lực lên men của các chủng nấm men(g/100ml)sau 5 ngày Bảng 3.1. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men Khối lƣợng ban đầu(g) Tên chủng Khối lƣợng Khối lƣợng Khối lƣợng sau CO2 thoát sau 48h 48h15‟(mở ra sau 15‟ nắp bình 15‟) mở bình 183.40 M1 183.23 188,19 0.17 188.31 M2 188,20 188.19 0.11 174.82 M3 174.69 174.68 0.13 Từ kết quả trên, chúng tôi thấy rằng chủng M1 có HL CO 2 thoát ra nhiều hơn chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh nhất. Tiếp đó là chủng M2 và M3.chủng M1 cũng cho sản phẩm rƣợu có hƣơng thơm và chất lƣợng tốt nhất theo cảm quan. 3.1.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men các loại đường Xác định khả năng lên men đƣờng của 3 chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch 22 lên men. Các chủng nấm men đƣợc đƣa vào dịch quả 100ml, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, nhiệt độ 25 - 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 10^ 6 tế bào /ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.3 Từ kết quả ở bảng, chúng tôi thấy M1 chủnglên men có HL cồn và hiệu suất lên men cao nhất, sau đó là các chủng M2 vàM3. Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men M1 M2 M3 Đƣờng tổng số(g) 250± 0.32 250± 0.2 250± 0.3 HL đƣờng sót(%) 4 ± 0.02 4.3 ± 0.03 4,1 ± 0.02 HL cồn(%V) 9,9 ± 0.03 8,2 ± 0.02 8.5 ± 0.05 9.9 10 8.5 8.2 9 8 7 6 5 4 HL đường 4.3 4.1 HL cồn 4 3 2 1 0 M1 M2 M3 Hình3.4. Biểu đồ biểu diễn HL đường sót và HL cồn 3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men Tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút.Chúng tôi thu đƣợc kết quả bảng 3.4. 23 Bảng 3.2. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men Tên chủng M1 M2 M3 Chiều cao cột sinh khối 18.5 17.6 18 (mm) Từ kết quả ở bảng trên,chúng tôi thấy rằngmẫu có khả năng kết lắng tốt nhất là chủng M1 sau đó là M2 và M3 3.1.2.4. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm Sau khi lên men đƣợc 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hƣơng thơm, độ trong bằng phƣơng pháp cảm quan và đo chiều cao cột kết lắng. Từ kết quả cho thấy chủng nấm men M1 đạt độ trong và hƣơng thơm tốt hơn 2 chủng còn lại. Tổng hợp kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy chủng nấm men M1 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ƣu điểm vƣợt trộ hơn nhiều so với hai chủng M2 và M3 vì vậy chúng tôi quyết định chọn chủng S.ceresvisiae M1 để tiếp tục nghiên cứu. 3.2.1. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S. ceresvisiae M1 trong quá trình nhân giống Trong quá trình sản xuất rƣợu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn nhƣng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lƣợngtế bào nấm men. Việc nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng S.cerevisiae M1 là một khâu quan trọng của quá trình sản xuất rƣợu vang Để xác định động thái phát triển của chủng nấm mem M tiến hành cấy giống vào môi trƣờng nhân giống với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 x 10^6 tế bào/ml, nuôi trên máy lắc ở 150 vòng/phút ở 310C. Sau 12h lại kiểm tra số lƣợng tế bào một lần 24 Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng M trong môi trường nhân giống Thoi gian SLTB x 10^6TB/ML (giờ) 0 3.5 12 43 24 215 36 180 48 63 250 Số lƣợng tế bào 200 150 SLTBx10^6 215 100 180 50 63 43 0 0 0h 12h 24h 36h 48h Thời gian(h) Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh trưởng phát triển của nấm men trên môi trường nhân giống Qua hình 3.5. Ta thấy số lƣợng tế bào trong 12 h đầu tăng chậm ứng với pha tiềm phát của nấm men. Lƣợng tế bào tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 36h số lƣợng tế bào tăng chậm, và ổn định và đạt giá trị cực đại, ứng với pha logarit, là quá trình nấm men tăng cƣờng trao đổi chất để sinh trƣởng nên số lƣợng tế bào tăng nhanh. Từ 36h đến 48h số lƣợng tế bào giảm ứng với pha cân bằng. Từ48h đến 72h là pha suy vong do nguồn dinh dƣỡng suy giảm nên tế bào nấm men chết dần. 25 Mục đích nghiên cứu nghiên cứu của thí nghiệm này là để xác định thời gian nhân giống thích hợp và cũng là cơ sở để nghiên cứu ảnh hƣởng của một số nhân tố tới quá trình phát triển của chủng nấm men đƣợc tuyển chọn.Kết quả của tôi khi nghiên cứu về thời gian nhân giống đối với chủng S.cerevisiace M1 phù hợp với một số tác giả [8]. Từ kết quả trên tôi xác định thời gian nhân giống cho chủng nấm men S.cerevisiae M1là 24h. 3.2.2. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang nho của chủng S.cerevisiae M1 Để xác định động thái lên men vang nho chúng tôi tiến hành lên men trong các bình có dung tích 250ml.Môi trƣờng lên men là dịch siro nho đƣợc pha loãng với nƣớc cất để đạt hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 250/ml, hàm lƣợng men giống là 10% giống, pH:4, nhiệt độ là 26 – 280C. Tiến hành phân tích mẫu 2 ngày 1 lần trong 8 ngày liên tục. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau Bảng 3.4. Sự biến đổi hàm lượng đường và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang nho cabernet sauvignon Thời gian(ngày) HL đƣờng sót(%) HL cồn 0 25 ± 0.2 0 2 17.3 ± 0.2 3.5 ± 0.2 4 11.5 ± 0.2 7.9 ± 0.2 6 6.3 ± 0.2 9.5 ± 0.2 8 3.5 ± 0.2 13 ± 0.2 26 25 HL đƣờng, cồn 25 20 17.3 15 13 11.5 9.5 10 HL đường HL cồn 7.9 6.3 3.5 5 3.5 0 0 0 2 4 6 8 Thời gian Hình3.6. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lượng đường và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang nho Ta nhận thấy sinh sản và phát triển nhanh nhất ở 2-6 ngày đầu (pha sinh trƣởng), duy trì ổn định ở nhà thứ 6 – 7 – 8 (pha cân bằng). Sau đó giảm dần vào các ngày sau do do hàm lƣợng đƣờng giảm mạnh, hàm lƣợng cồn tăng dần. Đó là do phần lớn đƣờng đƣợc chuyển hóa thành rƣợu dẫn đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Hàm lƣợng axit tổng số cũng tăng dần nhƣng cũng không lớn lắm do trong quá trình lên men rƣợu, ngoài việc tạo ra sản phẩm chính là rƣợu thì còn tạo nên các acid hữu cơ nhƣ lactic, xucxinic....sự tạo thành acid trong quá trình lên men đã làm giảm pH của dịch lên men Chủng S.cerevisiae M1 sinh sản và phát triển nhanh nhất ở 2 - 5 ngày đầu, duy trì ổn định từ ngày thứ 6- 8. Sau đó giảm dần vào các ngày sau do hàm lượng đường giảm mạnh, hàm lượng cồn tăng dần. Từ kết quả trên, xác định được thời gian lên men chính là 7 - 9 ngày 27 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ở các hàm lƣợng khác nhau đến quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon 3.3.1. Ảnh hưởng của ni tơ hữu cơ Có rất nhiều nguồn ni tơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn ni tơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axitamin ( nấm men chỉ sử dụng đƣợc các axitamin ở dạng tự nhiên ), các peptit, các nucleotit,... trong thực tế ngƣời ta thƣờng hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên ( đậu tƣơng, khô dầu lạc...) làm nguồn ni tơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nguyên liệu đƣợc sử dụng phổ biến nhất do thích hợp với sự sinh trƣởng, phát triển của nấm men và giá thành thấp Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nguồn ni tơ hữu cơ nào phù hợp với sự phát triển của chủng nấm mentrong moi trƣờng lên men có hàm lƣợng đƣờng250g/l, pH:4, hàm lƣợng men giống 10%, pepton ở các hàm lƣợng 1-10% g/l, TG 6 - 7 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng pepton trong quá trình phát triển của nấm men HL(g/l) 1 2 3 4 5 SLTB(x10^6) 160 190 320 425 490 28 6 7 8 329 280 150 9 10 128 115 600 Sltb 490 500 425 400 329 320 280 300 200 160 190 150 128 115 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thời gian(ngày) Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của pepton ở hàm lượng 4-5g/l các tế bào nấm men sinh trưởng và phát triển tốt Từ bảng số liệu và biểu đồ ta thấy rằng nguồn ni tơ vô cơ từ pepton ở HL 4 – 5 g/l các tế bào nấm men sinh trƣơng và phát triển tốt, SLTB tạo ra nhiều 425 - 490x10^6tế bào. Ở hàm lƣợng pepton 1- 2 g/l SLTB nấm men thấp dẫn đến sinh trƣởng của nấm men chậm, kéo dài thời gian lên men hoặc lên men khi triệt để, giảm năng suất, giảm chất lƣợng do acid amind và các peptit tạo thành H2 S các este không bình thƣờng. HL pepton6– 10g/lta thấy số lƣợng tế bào nấm men giảm dần do môi trƣờng quá giàu chất dinh dƣỡng. Vì vậy tôi thấy rằng hàm lƣợng pepton từ 5 – 6g/l là thích hợp bổ sung với môi trƣờng lên men. 3.3.2. Ảnh hưởng của ni tơ vô cơ 3.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ vô cơ Nguồn ni tơ vô cơ cũng ảnh hƣởng tới sự sinh trƣởng, phát triển của tế bào nấmen. Để xác định nguồn ni tơ vô cơ nào phù hợp của chủng nấm men M chúng tôi tiến hành thí nghiệm với môi trƣờng nhân giống với các nguồn ni tơ khác nhau là,(NH4)2SO4,KNO2, KNO3, nồng độ 0,2%,hàm lƣợng men 29 giống 10% nuôi cấy trên máy lắc trong tg 4-5 ngày với tốc độ 150 vòng /phút. Sau đó chúng tôi tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men trên 1ml dịch để xác định sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiaekết quả ở bảng Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các nguồn ni tơ vô cơ đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men. SLTB nấm men Thời gian Sltb (NH4)2SO4 KNO3 KNO2 0 4 ± 0.00 4 ± 0.0 4 ± 0.00 12 56 ± 0.2 46 ± 0.2 40 ± 0.02 24 62 ± 0.2 58 ± 0.3 48 ± 0.03 36 88 ± 0.3 78 ± 0.2 68 ± 0.03 48 150 ± 0.3 130 ± 0.4 118 ± 0.04 60 183 ± 0.2 156 ± 0.2 140 ± 0.02 72 188 ± 0.4 167 ± 0.2 154 ± 0.02 84 145 ± 0.2 130 ± 0.2 123 ± 0.03 96 132 ± 0.3 124 ± 0.3 118 ± 0.03 108 115± 0.3 110 ± 0.2 110 ± 0.02 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 (NH4)2SO4 KNO3 KNO2 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian(h) Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của ni tơ vô cơ đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men 30 Từ bảng số liệu và đồ thị ta thấy chủng nấm men S.cerevisiae M1 phát triển tốt nhất trong môi trƣờng dinh dƣỡng chứa(NH4)2SO4từ 2 – 4 ngày đầu chúng sinh sản và phát triển nhanh nhất tƣơng ứng với pha sinh trƣởng, duy trì ổn định vào ngày 4 – 5 tƣơng ứng với pha cân bằng sau đó giảm dần vào các ngày sau. Tiếp theo là môi trƣờng dinh dƣỡng chứa KNO3 và KNO2. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất thì chỉ có nguồnlà đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp ni tơ. Donguồn ni tơ ở dạng NH4+rất dễ cho nấm men sử dụng. Còn không đƣợc sử dụng vì chúng chứa gốc nitrat gây độc có thể gây ra bệnh ung thƣ cho con ngƣời [10]. Vì vậy tôi thấy rằng nguồn ni tơ phù hợp để cung cấp cho quá trình lên men của chủng nấm men S.cerevisiae M1 là (NH4)2SO4 3.4.3.Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4đến sự phát triển của nấm men Nghiên cứu tiếp theo vớimục đích xác định nồng độ (NH4)2SO4phù hợp nhất đối với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M1 chúng tôi tiến hành nghiên cứu trong môi trƣờng lên men, HL đƣờng 250g/l, Ph = 4, hàm lƣợng men giống 10%,(NH4)2SO4 ở các nồng độ 0,1‰, 0,2‰, 0,3‰, 0,4‰, 0,5‰, với thời gian là 7 – 9 ngày, kết quả đƣợc dẫn ra bảng Bảng 3.7.Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp với sự phát triền của nấm men Nồng độ(NH4)2SO4 Chỉ tiêu đánh giá 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 3.3 ± 0.1 2.6 ± 0.2 2.9 ± 0.1 3.1 ± 0.3 3.4 ± 0.4 Độ cồn(%V) 8.8 ± 0.1 10 ± 0.2 9.5 ± 0.1 8.7 ± 0.3 8.4 ± 0.2 pH 3.7 ± 0.1 4 ± 0.2 4.2 ± 0.1 3.6 ± 0.2 3.3 ± 0.2 Lƣợng đƣờng sót(g/l) 31 12 10 10 9.5 8.8 8.7 8.4 8 Lượng đường sót 6 4 3.3 3.7 2.6 Độ cồn 4.2 4 2.9 3.1 3.6 3.4 pH 3.3 2 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ(NH4)2SO4 Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 hợp với sự phát triền của nấm men Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 0.2‰ và 0.3‰thích hợp cho quá trình lên men vì ở nồng độ này dịch lên men có HL đƣờng sót thấp,HL cồn cao. Ngoài ra chúng ta thấy nồng độ nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng thì hàm lƣợng đƣờng sót cũng tăng, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn TĐC của tế bào nấm men. Nếu quá ít sẽ làm tốc độ len men yếu, HL đƣờng sót cũng tăng, HL cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả trƣớc đó(7)(8). Vì vậy chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ độ (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ và 0.3‰ để bổ sung vào dịch lên men. 3.5. Lên men vang nho cabernet sauvignon quy mô phòng thí nghiệm 3.5.1. Lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi tiến hành lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm với môi trƣờng lên men là môi trƣờng 3(MT3) ở điều kiện 28c, pH = 4 tỷ lệ men giống là 10% với quy mô phòng thí nghiệm trong các 32 bìnhlên men 250ml, sau khi kết thúc giai đoạn lên men chính trong vòng 9 ngày. Chúng tôi tiến hành phân tích các chỉ số cần thiết và chuyển sang quá trình lên men phụ. Kết quả phân tích đƣợc dẫn ra bảng Bảng 3.8. Kết quả phân tích quá trình lên men rượu vang nho cabernet sauvignon Chỉ tiêu phân tích Đơn vị Mẫu Độ rƣợu %V 10.2 Đƣờng sót % 2.2 Acid % 0.45 Độ pH 4.5 Sản phẩm đƣợc đánh giá cao.Trên cơ sở đó chúng tôi trình bày quy trình lên men vang nho. 33 3.5.2. Quy trình công nghệ lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm 3.3. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang nho cabernet sauvignon 34 3.5.3. Thuyết minh công nghệ Quy trình sản xuất vang nho gồm 4 giai đoạn chính Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men Giai đoạn 2: Lên men chính Giai đoạn 3: Lên men phụ (ủ chín vang Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lƣợng vang và tiêu thụ sản phẩm Giai đoạn 1: Chế biến dịch lên men Quả nho chín đƣợc thu hoạch từ các vƣờn trồng nho về chọn ra những quả lành, không sâu bệnh, loại bỏ những quả dập nát, quả thối. Sau đó rửa lại bằng nƣớc cho sạch bụi bẩn rồi để ráo nƣớc. Nho đƣợc đƣa vào các thùng ngâm đƣờng với tỷ lệ 1:1. Sau khoảng 15 ngày ta thu đƣợc dịch siro hoa quả có nồng độ đƣờng khoảng 60% - 80% và nhiều chất dinh dƣỡng khác đƣợc chiết từ thịt quả. Giai đoạn 2: Lên men chính Dịch lên men đƣợc bổ sung nấm men ( tỷ lệ khoảng 7 – 10%). Điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men thƣờng khoảng 25 – 300C. Trong quá trình lên men phải tiến hành phân tích mẫu và kiểm tra nấm men thƣờng xuyên để điều chỉnh quá trình lên men cho phù hợp để hạn chế sự thất thoát cồn, hƣơng thơm, mùi vị,... trong quá trình lên men chính cần thiết phải lên men đầy bình, nên giữ áp lực ở mức thấp. Lên men chính thƣờng kết thúc sau khoảng 7- 9 ngày. Giai đoạn 3: Lên men phụ (ủ chín vang) Quá trình lên men phụ nên giữ ở nhiệt độ dƣới 10c,sau khi kết thúc lên men đƣợc 80-90 ngày có thể tiến hành tách cặn ở đáy bình sau đó có thể bổ sung phụ gia lắng trong bằng cách pha loãng chất phụ gia với cồn(10-15% V) và cho từ từ vào bình, vừa cho vừa khuấy theo một chiều cố định trong 35 khoảng 10-15 phút. Trong thời gian tàng trữ ngƣời ta thƣờng tách cặn ở đáy bình 2-3 lần trong suốt thời gian tàng trữ. Giai đoạn 4: Hoàn thiện chất lượng và tiêu thụ sản phẩm Sau khi ủ chín vang để tăng cƣờng giá trị cảm quan, độ trong của sản phẩm thì cần phải tiến hành lọc vang đến khi sản phẩm đạt đƣợc độ trong cần thiết. Việc đóng chai và tiêu thụ sản phẩm thƣờng đƣợc tiến hành ngay sau khi lọc vang lần cuối. Để tránh gây ô nhiễm rƣợu khi đóng chai cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các yêu cầu vệ sinh ở giai đoạn này. Vang sau khi đóng chai có thể đƣợc cất trữ và bảo quản trong thời gian dài. 36 KÊT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Kết quả nghiên cứu từ dịch siro nho cabernet sauvignon đã phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng sinh trƣởng, phát triển tốt, hoạt lực lên men cao, HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp, độ cồn cao, tạo vang có vị thơm ngon, độ lắng cao. 1.2. Nghiên cứu xác định động thái của quá trình lên men vang nho vàthời gian nhân giống thích hợp là 24h. 1.3. Đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nitơ đến lên men rƣợu vang. Trong đó nguồn nitơ hữu cơ từ 4 - 5g/l và nguồn nitơ vô cơ (NH4)2SO4 với hàm lƣợng 0,2% - 0.3% là thích hợp để bổ sung quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon. 1.4. Bƣớc đầu xây dựng quy trình công nghệ lên men thành công vang nho tạo ra đƣợc một loại vang có chất lƣợng tốt và quy trình lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm. 2. Kiến nghị Từ kết quả thu đƣợc trong quá trình nghiên cứu chúng tôi mong muốn đóng góp chủng nấm men đã đƣợc tuyển chọn vào quá trình nghiên cứu sản xuất rƣợu vang từ nguồn nguyên liệu là nho cabernet sauvignonnói riêng và các giống nho khác nói chungnhằm phát triển ngành sản suất rƣợu vang từ nguồn nguyên liệu có sẵn trong nƣớc từ các vùng trồng nho nhƣ Ninh Thuận, Bình Thuận. 37 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Bùi Ái (2003), công nghệ lên men ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm.Nxb đại học quốc gia Tp HCM. [2].Nguyễn Thị Trân Châu, Trần Thị Áng(2001). Hóa sinh học. Nxb giáo dục (pp156-161). [3]. Nguyễn Lân Dũng và cộng tác viên (1976). Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập 2, 3. Nxb khoa học kỹ thuật [4]. Nguyễn Thành Đạt (1979), Vi sinh vật học đại cƣơng. Nxb giáo dục [5]. Vũ Công Hậu (1982).Chế vang trái cây rong gia đình. Nxb nông nghiệp [6]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh (2011), Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiaeH2 và H8, thông báo khoa học trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1. [7]. Đinh Thị Kim Nhung (2001), Nghiên cứu động thái phát triển và quá trình lên men rượu vang phối hợp 2 chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae N9 và P6, thông báo khoa học trường, Trường ĐHSPHN2 (pp.289-300) [8].Đinh Thị Kim Nhung(2007), tạp chí khoa học và công nghệ, trường ĐHSPHN2, tập 45, số 2 (pp.87-92).. [9]. Đinh Thị Kim Nhung. Nguyễn Phƣơng Châm. Đặng Thị Thu Hiền (1998), Tuyển chọn chủng nấm men lên men rƣợu vang. Thông báo khoa học, trườngĐHSP Hà Nội 2,số 1, (203,208) [10].Lƣơng Đức Phẩm (2004). Công nghệ VSV.Nxb Nông nghiệp HN [11]. NguyễnĐình Sinh(1997).Nấm men và khả năng sử dụng chúng trong công nghệ sinh học. Luận án tiến sỹ trƣờng đại học sƣ phạm Hà nội [12]. Hoàng Thị Thúy (2007). Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng và hàm lƣợng men giống cho quá trình lên men táo mèo. Khóa luận tốt nghiệp trường ĐHSP HN2. 39 [13]. Mark Berkowitz (september/october năm 1996). „world‟s Earliest wine.archaeology, truy cập ngày 10 tháng 9 năm 2014 [14]. “Oldest known wine-making facility‟ found in America”. BBC News (BBC), 11tháng 1.truy cập ngày 10 tháng 9 năm 2014 40 [...]... quyết định nghiên cứu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ đến quá trình lên men rượu vang nho cabernet sauvignon’’ 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng nitơ đến quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon 2 3 Nội dung của đề tài 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp để lên men rƣợu vang nho carbernet sauvignon 3.2 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae... trƣờng lên men 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng của các nguồnnitơ ở nồng độ khác nhau đếnquá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon 3.4 Lên men vang nho cabernet sauvignon quy trình lên men vang nho quy mô phòng thí nghiệm 4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài 4.1.Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho cabernet sauvignon Kết quả nghiên cứu. .. suốt quá trình lên men do nhiệt độ ảnh hƣởng đến quá 11 trình lên men và các chất hình thành 1.5.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang Trong thời gian lên men chính, nếu thời gian lên men quá ngắn, có thể lƣợng cồn tạo ra quá ít Trong thời gian lên men phụ, nếu thời gian lên men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc... lợi cho quá trình lên men, ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu Nhìn chung hàm lƣợng men giống thích hợp cho quá trình lên men khoảng 10% 1.5.2 .Ảnh hưởng của độ pH và nồng độ cồn pHcủa môi trƣờng ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình phát triển của nấm 10 men Tuy nhiên, pH tối ƣu cho sự phát triển và lên men rƣợu của nấm men không cố định, pH này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, chủng nấm men Thành phần của môi... Hàm lƣợng men giống đóng vai trò quan trọng đến quá trình sinh trƣởngcũng nhƣ quá trình lên men của nấm men Hàm lƣợng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì quá trình lên men càng kéo dài hơn, dễ bị nhiễm vi khuẩn ngƣợc lại hàm lƣợng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men ngắn hơn Nhƣng hàm lƣợng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trƣờng lên men, sẽ không... tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 1.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống Đƣờng là yếu tố trực tiếp đến hoạt động của nấm men và quá trình lên men Môi trƣờng có nồng độ đƣờng từ 10 – 25% thuận lợi cho sự lên men, khi nồng độ đƣờngtừ 25% trở lên thì sự lên men khó khăn hoặc chậm.Dung dịch đƣờng có nồng độ rất cao sẽ tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây phá hủy trạng thái sinh lý bình thƣờng của. .. bào nấm men Kí hiệu cho các chủng nấm men thu đƣợc là M1, M2, M3 20 Hình 3.2 Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 thu được từ môi trường thạch nghiêng Hình 3.3 Hình ảnh tế bào của chủng nấm men S.cerevisiae M1độ phóng đại 1000 lần 21 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho 3.1.2.1 Xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men bằng hàm lượngCO2 thoát ra Quá trình lên men của 3 chủng... tiếp tục nghiên cứu 3.2.1 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S ceresvisiae M1 trong quá trình nhân giống Trong quá trình sản xuất rƣợu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn nhƣng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lƣợngtế bào nấm men Việc nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng S.cerevisiae M1 là một khâu quan trọng của quá trình sản xuất rƣợu vang Để... axitamin Nấm men sử dụng nitơ tổng hợp tế bào mới và các enzim proteaza trong quá trình sinh trƣởng và sinh sản Trong quá trình lên men việc cung cấp đủ lƣợng nitơ để nấm men có thể đồng hóa là rất cần thiết Nó ảnh hƣởng tới tốc độ chuyển hóa đƣờng thành rƣợu và khả năng chịu cồn của nấm men Vì vậy nitơ đóng một vai trò quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men trong lên men rƣợu vang, do... với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 7-20 ngày.Thời gian lên men phụ và tàng trữ ít nhất phải vài tháng trở lên 1.6 Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rƣợu vang Nấmmen S.cerevisiae đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất Chủng nấm men này có khả năng lên men này có khả năng lên men dịch có HL đƣờng cao và tạo đƣợc 20 % - 30 % V cồn Sự lên men rƣợu đƣợc