4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp tuyển chọn nấm men trên môi trường thạch đĩa
Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi trƣờng Hansen
2.2.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống trước khi lên men
Để có những tế bào tokhỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 28-30 C trong 24h. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men [8].
2.2.1.3. Phương pháp xác định hoạt lức lên men của nấm men
Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dùng các phƣơng pháp sau:
Phƣơng pháp cân trọng lƣợng bình: Dịch lên men trong các bình cùng thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa hai lần là 0,1 thì dừng lại [5].
Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào bằng buồng đếm Goriaev
2.2.1.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Tế bào nấm men đƣợc nhuộm đơn bằng cách: lấy một lƣợng nhỏ tế bào từ ống thạch nghiêng, dàn đều trên lam kính có chứa một giọt nƣớc cất rồi cố định trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó nhỏ 1-2 giọt xanh metylen lên vết bôi, để trong 2-3 phút rồi rủa bằng nƣớc cất. Làm khô tiêu bản rồi quan sát trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.2.1.5. Phương pháp phân tích
2.2.5.1. Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế
17 2.2.5.3. Xác định Ph bằng giấy đo pH
2.2.5.4. Xác định hàm lƣợng axit trong dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N.từ số ml dung dịch NAOH0,1 N dùng đẻ chuẩn độ ta xác định đƣợc hàm lƣợng axit có trong dung dịch [6].
2.2.1.6. Phương pháp xác định khả năng kết lắng
Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định trên tốc độ nắng của sinh khối, cách tiến hành nhƣ sau: hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (Ph= 4.5) trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc bằng nhau với thể tích của dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hoàn tòan bằng nhau. Sau đó đem lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. Khối dịch chia thành 2 lớp bằng, phần đáy là nấm men.Tiến hành đo lớp kết lắng của chủng nấm men trong các ống nghiệm. Ống nghiệm nào cócó chiều cao kết lắng cao nhất tức là có độ kết lắng tốt nhất[8].
2.2.1.7. Phương pháp cảm quan
Sử dụng các giác quan đánh giá về giá trị cảm quan khác nhau (màu sắc, độ trong, mùi vị,…).
2.2.1.8. Phương pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ:
Số trung bình cộng: dùng để tính trung bình các lần lặp lại thí nghiệm
Trong đó: M: trung bình tổng thể
Mi: giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lân thứ n n: số lần thí nghiệm
18
Độ lệch chuẩn:
Trong đó: : độ lệch chuẩn
X i: Giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần n M: trung bình tổng thể
Sai số trung bình: Hệ số biến động:
Trong đó: CV: Hệ số biến thiên tổng thể
2.3. Địa điểm thực hiện đề tài
19
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men S.cerevisiae
Những chỉ tiêu định hƣớng lựa chọn chủng nấm men: Nấm men đóng vai trò quan trọng với toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng vang. Bên cạnh những chỉ tiêu hình dạng, kích thƣớc khuẩn lạc, độ nhẵn bóng còn phải chú ý đến chỉ tiêu sau:
Chịu đƣợc độ cồn và độ aixit cao
Có khả năng lên men tốt trong môi trƣờng có HL đƣờng cao. Có hiệu suất lên men cao.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kì lên men ngắn. Tạo đƣợc hƣơng thơm và vị đặc trƣng.
Dễ lắng trong và dễ lọc.
3.1.1. Phân lập chủng nấm men S.cerevisiae từ dịch nho cabernet sauvignon
Trong dịch quả đã có những giống nấm men có sẵn, các giống này có khả năng chịu đƣợc những điều kiện khác nhau nhƣ HL đƣờng cao, độ axit cao,...
Chọn nguồn nguyên liệu có chất lƣợng tốt, đảm bảo chất lƣợng và nguồn gốc xuất xứ. Sau đó tiến hành phân lập trên môi trƣờng vô trùng môi trƣờng phân lập thực hiện trên môi trƣờng Hansen.
Cách tiến hành: Phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa đã vô trùng, chuẩn
bị 10 ống nghiệm định mức, dùng pipet hút 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch hoa quả cho vào ống thứ nhất( dịch pha loãng ở 10^-10). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch có nồng độ pha loãng ở 10^-2. Làm tƣơng tự với các ống tiếp theo cho đến ống9 sẽ có độ
20
pha loãng 10^-9. Có thể chọn ở các nồng độ 10^-6 – 10^-9
Phân lập:Dùng pipet hút 1- 2 giọt dịch pha loãng nhỏ vào đĩa petri có
sẵn môi trƣờng han sen đã đƣợc khử trùng. Sau đó dùng que trang dàn đều lên mặt thạch. Đặt ngƣợc các hộp petri xuống, dùng giấy báo gói lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300c. Sau 2-3 ngày lấy ra quan sát. Trên bề mặt thạch ta thấy xuất hiện những khuẩn lạc, dựa vào hình thái khuẩn lạc nấm men ta chọn những khuẩn lạc to, tròn, nhẵn, lồi, nhẵn bóng có màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Kết quả phân lập cho ra đƣợc3 mẫu nấm men dùng làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1. Nấm men S.cerevisiae M1 phân lập trên môi trường thạch đĩa
Sau đó các khuẩn lạc này chúng tôi cấy sang các ống thạch nghiêng đã có sẵn môi trƣờng Hansen vô trùng để giữ giống, sau 2-3 ngày lấy ống thạch nghiêng ra quan sát, làm tiêu bản soi kính để kiểm tra hình thái tế bào nấm men. Kí hiệu cho các chủng nấm men thu đƣợc là M1, M2, M3.
21
Hình 3.2 Cấy truyền chủng nấm men M1, M2, M3 thu được từ môi trường thạch nghiêng
Hình 3.3 Hình ảnh tế bào của chủng nấm men S.cerevisiae M1độ phóng đại 1000 lần
22
3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho
3.1.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các chủng nấm men bằng hàm lượngCO2 thoát ra
Quá trình lên men của 3 chủng nấm men đƣợc biểu thị bằng HL co2 sinh ra. Lƣợng CO2sinh ra và thoát khỏi môi trƣờng càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu bằng cách cho các chủng nấm men vào môi trƣờng dịch quả 100ml có hàm lƣợng đƣờng 250g\l, pH: 4, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 10^ 6, nhiệt độ 25- 300C. Sau 72h mở nắp bình lên men đem cân trọng lƣợng bình ta thấy trọng lƣợng bình giảm đó chính là lƣợng co2 thoát ra. Kết quả đƣợc dẫn ra bảng
Hoạt lực lên men của các chủng nấm men(g/100ml)sau 5 ngày
Bảng 3.1. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men
Khối lƣợng
ban đầu(g) Tên chủng
Khối lƣợng sau 48h Khối lƣợng sau 48h15‟(mở nắp bình 15‟) Khối lƣợng CO2 thoát ra sau 15‟ mở bình 183.40 M1 183.23 188,19 0.17 188.31 M2 188,20 188.19 0.11 174.82 M3 174.69 174.68 0.13
Từ kết quả trên, chúng tôi thấy rằng chủng M1 có HL CO2 thoát ra nhiều hơn chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh nhất. Tiếp đó là chủng M2 và M3.chủng M1 cũng cho sản phẩm rƣợu có hƣơng thơm và chất lƣợng tốt nhất theo cảm quan.
3.1.2.2. Nghiên cứu khả năng lên men các loại đường
Xác định khả năng lên men đƣờng của 3 chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch
23
lên men. Các chủng nấm men đƣợc đƣa vào dịch quả 100ml, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, nhiệt độ 25 - 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 10^ 6 tế bào /ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.3
Từ kết quả ở bảng, chúng tôi thấy M1 chủnglên men có HL cồn và hiệu suất lên men cao nhất, sau đó là các chủng M2 vàM3.
Bảng 3.2. Khả năng lên men của các chủng nấm men
Chỉ tiêu đánh giá Chủng nấm men
M1 M2 M3
Đƣờng tổng số(g) 250± 0.32 250± 0.2 250± 0.3
HL đƣờng sót(%) 4 ± 0.02 4.3 ± 0.03 4,1 ± 0.02
HL cồn(%V) 9,9 ± 0.03 8,2 ± 0.02 8.5 ± 0.05
Hình3.4. Biểu đồ biểu diễn HL đường sót và HL cồn
3.1.2.3. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men
Tiến hành hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút.Chúng tôi thu đƣợc kết quả bảng 3.4. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M1 M2 M3 4 4.3 4.1 9.9 8.2 8.5 HL đường HL cồn
24
Bảng 3.2. Khả năng kết lắng của các chủng nấm men
Tên chủng M1 M2 M3
Chiều cao cột sinh khối (mm)
18.5 17.6 18
Từ kết quả ở bảng trên,chúng tôi thấy rằngmẫu có khả năng kết lắng tốt nhất là chủng M1 sau đó là M2 và M3
3.1.2.4. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm
Sau khi lên men đƣợc 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hƣơng thơm, độ trong bằng phƣơng pháp cảm quan và đo chiều cao cột kết lắng. Từ kết quả cho thấy chủng nấm men M1 đạt độ trong và hƣơng thơm tốt hơn 2 chủng còn lại.
Tổng hợp kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy chủng nấm men M1 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ƣu điểm vƣợt trộ hơn nhiều so với hai chủng M2 và M3 vì vậy chúng tôi quyết định chọn chủng
S.ceresvisiae M1 để tiếp tục nghiên cứu.
3.2.1. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng S. ceresvisiae M1 trong quá trình nhân giống quá trình nhân giống
Trong quá trình sản xuất rƣợu vang, giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian ngắn nhƣng lại có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình tăng nhanh số lƣợngtế bào nấm men. Việc nghiên cứu động thái sinh trƣởng của chủng
S.cerevisiae M1 là một khâu quan trọng của quá trình sản xuất rƣợu vang
Để xác định động thái phát triển của chủng nấm mem M tiến hành cấy giống vào môi trƣờng nhân giống với số lƣợng tế bào ban đầu là 3,5 x 10^6 tế bào/ml, nuôi trên máy lắc ở 150 vòng/phút ở 310C. Sau 12h lại kiểm tra số lƣợng tế bào một lần
25
Bảng 3.3. Khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng M trong môi trường nhân giống Thoi gian (giờ) SLTB x 10^ 6 TB/ML 0 3.5 12 43 24 215 36 180 48 63
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh trưởng phát triển của nấm men trên môi trường nhân giống
Qua hình 3.5. Ta thấy số lƣợng tế bào trong 12 h đầu tăng chậm ứng với pha tiềm phát của nấm men. Lƣợng tế bào tăng nhanh từ 12h đến 24h. Từ 24h đến 36h số lƣợng tế bào tăng chậm, và ổn định và đạt giá trị cực đại, ứng với pha logarit, là quá trình nấm men tăng cƣờng trao đổi chất để sinh trƣởng nên số lƣợng tế bào tăng nhanh. Từ 36h đến 48h số lƣợng tế bào giảm ứng với pha cân bằng. Từ48h đến 72h là pha suy vong do nguồn dinh dƣỡng suy giảm nên tế bào nấm men chết dần.
0 43 215 180 63 0 50 100 150 200 250 0h 12h 24h 36h 48h SLTBx10^6 Số lƣ ợ ng tế bà o Thời gian(h)
26
Mục đích nghiên cứu nghiên cứu của thí nghiệm này là để xác định thời gian nhân giống thích hợp và cũng là cơ sở để nghiên cứu ảnh hƣởng của một số nhân tố tới quá trình phát triển của chủng nấm men đƣợc tuyển chọn.Kết quả của tôi khi nghiên cứu về thời gian nhân giống đối với chủng S.cerevisiace M1 phù hợp với một số tác giả [8].
Từ kết quả trên tôi xác định thời gian nhân giống cho chủng nấm men S.cerevisiae M1là 24h.
3.2.2. Nghiên cứu động thái quá trình lên men vang nho của chủng S.cerevisiae M1
Để xác định động thái lên men vang nho chúng tôi tiến hành lên men trong các bình có dung tích 250ml.Môi trƣờng lên men là dịch siro nho đƣợc pha loãng với nƣớc cất để đạt hàm lƣợng đƣờng ban đầu là 250/ml, hàm lƣợng men giống là 10% giống, pH:4, nhiệt độ là 26 – 280
C. Tiến hành phân tích mẫu 2 ngày 1 lần trong 8 ngày liên tục. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau
Bảng 3.4. Sự biến đổi hàm lượng đường và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang nho cabernet sauvignon
Thời gian(ngày) HL đƣờng sót(%) HL cồn 0 25 ± 0.2 0 2 17.3 ± 0.2 3.5 ± 0.2 4 11.5 ± 0.2 7.9 ± 0.2 6 6.3 ± 0.2 9.5 ± 0.2 8 3.5 ± 0.2 13 ± 0.2
27
Hình3.6. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lượng đường và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang nho
Ta nhận thấy sinh sản và phát triển nhanh nhất ở 2-6 ngày đầu (pha sinh trƣởng), duy trì ổn định ở nhà thứ 6 – 7 – 8 (pha cân bằng). Sau đó giảm dần vào các ngày sau do do hàm lƣợng đƣờng giảm mạnh, hàm lƣợng cồn tăng dần. Đó là do phần lớn đƣờng đƣợc chuyển hóa thành rƣợu dẫn đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men.
Hàm lƣợng axit tổng số cũng tăng dần nhƣng cũng không lớn lắm do trong quá trình lên men rƣợu, ngoài việc tạo ra sản phẩm chính là rƣợu thì còn tạo nên các acid hữu cơ nhƣ lactic, xucxinic....sự tạo thành acid trong quá trình lên men đã làm giảm pH của dịch lên men
Chủng S.cerevisiae M1 sinh sản và phát triển nhanh nhất ở 2 - 5 ngày đầu, duy trì ổn định từ ngày thứ 6- 8. Sau đó giảm dần vào các ngày sau do hàm lượng đường giảm mạnh, hàm lượng cồn tăng dần. Từ kết quả trên, xác định được thời gian lên men chính là 7 - 9 ngày
0 5 10 15 20 25 0 2 4 6 8 25 17.3 11.5 6.3 3.5 0 3.5 7.9 9.5 13 HL đường HL cồn Thời gian HL đƣ ờ ng, cồ n
28
3.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ ở các hàm lƣợng khác nhau đến quá trình lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon lên men rƣợu vang nho cabernet sauvignon
3.3.1. Ảnh hưởng của ni tơ hữu cơ
Có rất nhiều nguồn ni tơ khác nhau đƣợc sử dụng trong nuôi cấy nấm men. Các nguồn ni tơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các axitamin ( nấm men chỉ sử dụng đƣợc các axitamin ở dạng tự nhiên ), các peptit, các nucleotit,... trong thực tế ngƣời ta thƣờng hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên ( đậu tƣơng, khô dầu lạc...) làm nguồn ni tơ hữu cơ. Tuy nhiên chúng ta thấy rằng pepton là nguồn nguyên liệu đƣợc sử dụng phổ biến nhất do thích hợp với sự sinh trƣởng, phát triển của nấm men và giá thành thấp
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm để xác định nguồn ni tơ hữu cơ nào phù hợp với sự phát triển của chủng nấm mentrong moi trƣờng lên men có hàm lƣợng đƣờng250g/l, pH:4, hàm lƣợng men giống 10%, pepton ở các hàm lƣợng 1-10% g/l, TG 6 - 7 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng pepton trong quá trình phát triển của nấm men
HL(g/l) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
29
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của pepton ở hàm lượng 4-5g/l các tế bào nấm men sinh trưởng và phát triển tốt
Từ bảng số liệu và biểu đồ ta thấy rằng nguồn ni tơ vô cơ từ pepton ở HL 4 – 5 g/l các tế bào nấm men sinh trƣơng và phát triển tốt, SLTB tạo ra nhiều 425 - 490x10^6tế bào. Ở hàm lƣợng pepton 1- 2 g/l SLTB nấm men thấp dẫn đến sinh trƣởng của nấm men chậm, kéo dài thời gian lên men hoặc lên men khi triệt để, giảm năng suất, giảm chất lƣợng do acid amind và các peptit tạo