... trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học Các nghiên cứu màng Bc trến giới tập trung vào vấn đề đề sản xuất ứng dụng sản phẩm từ màng BC vào lĩnh vực khác Nghiên cứu màng BC từ vi... cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi khuẩn nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown M R., 2005); nghiên cứu. .. công trình bước đầu nghiên cứu trình sinh axit acetic, khả tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [4]; gần nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000, nghiên cứu
TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN -goCQos BÙI THỊ HUẾ ẢNH HƯỞNG CỦA (NH4)2S04, KNO3 TỚI KHẢ NẢNG TẠO MÀNG BC CHO VI KHUẨN GLUCONACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC • •• • Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngưòì hướng dẫn khoa học: TS PHƯƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI, 2015 Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, và thầy TS Phương Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề LỜI CAM ĐOAN này Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tố bộ môn Thực vật - Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em, hoàn thành khóa luận này Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đõ' em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài Em xin trân thành cảm ơn ỉ Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.Đây là kết quả của riêng tôi Tất cả các số liệu trong bảng biếu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dưới sự hướng dẫn của PGS TS Đinh Thị Kim Nhung và TS Phương Phú Công Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Huế DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN Bảng Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT BC: Bacterial cellulose cs: Cộng sự MT: Môi trường STT: Số thứ tự MỤC LỤC MỞ ĐÀU 1 Lý do chọn đề tài Màng sinh học (Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liến kết P-1,4 glucorit) Cellulose vi khuân khác với cellulose thực vật ở chô không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi Với những đặc tính hóa, lí ưu việt trên nên màng BC được xem như là một nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp sản xuất giấy, màng BC được dùng đế sản xuất giấy điện tử chất lượng cao; Trong công nghệ môi trường, màng BC làm màng phân tách để xử lý nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998) Trong y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người; Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triến của vi sinh vật Đe tìm hiếu rõ hơn ảnh hưởng của nitơ tới quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết định chọn đề tài: "Anh hưởng của (NH^ĩSOặ, KNOĩtởi khả năng tạo màng BCcho vi khuấnGluconacetobacter" 2 Mục đích nghiên cứu Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 3 Nội dung nghiên cứu 4 3.1 Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter 3.2 Ánh hưởng của KN0 3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuầnGluconacetobacter 3.3 Ánh hưởng của (NH^SCUtới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 3.4 Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo 4 Ý nghĩa của đề tài 4.1 Ỷ nghĩa khoa học Tìm được nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter 4.2 Ỷ nghĩa thực tiễn Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào một số lĩnh vực trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực y học 5 Phương pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp vi sinh vật 5.2 Phương pháp hóa sinh 5.3 Phương pháp toán học 6 Điểm mới của đề tài Đã lựa chọn được hàm lượng (NH4) 2S04 là 3g/l thích hợp cho lên men tạo màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới 1.1.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới Theo hệ thống Gluconacetobacterthuộc phân loại của chi Acetobacter, nhà khoa học Bergey thì họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn 5 acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1 giờ Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điếm khác nhau Vì vậy, đòi hỏi cần nhiều nghiến cứu hơn nữa về loại vi khuấn này 1.1.2 Đặc điếm phân loại của Gluconacetobacter 1.1.2.1 Đặc điếm hình thái, tế bào học Gluconacetobacter là trực khuấn hình thước khoảng 2ụm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc que, xếp thắng hay hơi cong, kích thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H 2SO4, bắt màu hồng khi nhuộm fucshin.Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5% acid acetic trong môi trường, khi nồng độ acid trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn [4] Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuấn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter ỉ.1.2.2 Đặc điếm nuôi cấy Trên môi trường thạch đĩa, vi khuấn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường Ở điều kiên nuôi tĩnh, trong môi trường dịch thế chúng sẽ hình thành trên bề mặt môi trường môt lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đối oxy và các chất dinh dưỡng 6 Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trương dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hắn cellulose trong điều kiện nuôi tĩnh [ 6] 1.1.2.3 Đặc điếm sinh lí, sinh hóa + Đặc điểm sinh lí: Vi khuấn Gluconacetobacter phát triến ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4 - 6 Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng và tạo màng Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ + Đặc điếm sinh hóa: Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuấn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CƠ 2và H2O; hoạt tính catalase; khả năng tăng trưởng trên môi trường Hoyer Theo quan điếm này Gluconacetobacterìầ chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schiiommycetes Đặc điếm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây: Bảng 1.1 Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuấn Gluconacetobacter theo Frateur (1950) STT Đặc điểm 1 2 Hiện tượng -Oxy hóa ethanol thành -Chuyến hóa môi trường chứa acid acetic Bromphenol Blue 0,04% từ màu -Hoạt tính catalase xanh sang màu vàng -Hiện tượng sủi bọt khí 7 Kết quả + + 3 -Sinh trưởng trên môi -Sinh khối không phát triển - trường Hoyer 4 -Chuyển hóa glycerol -Tạo kết tử đỏ gạch trong dịch sau thành dihydroxyaceton 5 lên men -Chuyển hóa glucose thành -Vòng sáng xuất hiện xung quanh acid 6 + + khuấn lạc trên môi trường chứa -Kiếm tra khả năng sinh CaCƠ3 -Không hình thành săc tô nâu - sắc tố nâu 7 -Kiểm tra khả năng tổng -Váng vi khuẩn xuất hiện màu hợp cellulose xanh lam 1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter 1.2.1 Ảnh hường của nguồn cacbon + Đe vi khuẩn sinh trưởng và phát triến tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điếm sinh lí của từng loại vi sinh vật Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng Đường đơn ở nhiệt độ cao có thế chuyến hóa thành loại hợp chất cố màu tối khó hấp thụ Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyến hóa làm biến đổi pH môi trường Đế tránh hiện tường này khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110°c trong 30 phút Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal) Đe nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường Gluconacetobacter sinh trưng chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol.Có thế sinh trưởng trong môi trường chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7] 8 Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch ) có thể vừa dụng làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật [7] 1.2.2 Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật Môi trường cơ bản cho nghiên cứu về cellulose vi khuấn là môi trường do Hestrin và Schramm thiết lập [7], có chứa cao nấm men và peptone là nguồn hữu cơ, (NH 4) 2S04 là nguồn nitơ vô cơ Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4 + Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH 4+ trong môi trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO 42 ', cr ) làm hạ thấp rất nhiều trị so pH của môi trường Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được sử dụng nhiều hơn (mặc dù dù đắt hơn) Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO 3’ các ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [7] Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn cung cấp nitơ cho sinh vật Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chưa quá 5 gốc axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [7] 1.2.3 Hàm lượng ethanol trong dịch lên men Ethanol được sử dụng như một cơ chất.Hàm lượng ethanol có thế thay đối từ 2 - 10% V Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men Theo Hong - J00 Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - ỉ % tốt nhất là ở 0,6% [4] Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5% Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V Đe tránh hiện tượng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có mooti lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7] Ngoài việc oxy hóa 9 ethanol, vi khuấn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu khác thành acid tương ứng 1.3 Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial celluỉocse BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (PC- Plant Cellulose) Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi polyme ß-l,4glucopynanose mạch thẳng Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [16] Chuỗi polyme (3-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (subfibril ) có kích thước 1,5 nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi vĩ mô (microfibril ) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000) Dải ribbol có chiều dài trong khoảng từ 1-9 nm Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màn mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy Hình 1.2 Sợi cellulose của màng BC Hình 1.3 Sợi cellulose của thực vật 1.3.2 Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse Brown A J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước nhưng tan trong dng dịch kiềm tính Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn 1 0 Bước 1: Nhân giống ị Bước 2: Hoạt hóa giống ị Bước 3: Lên màng I Bước 4: Thu màng Cụ thể như sau: Bước 7: Nhân giống Quá trình nhân giống được tiến hành cấy truyền liên tục chủng Gỉuconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng Hình ảnh vi khuẩn Gluconacetobacter được cấy truyền trên thạch nghiêng được thế hiện trong hình 3.6 Hình 3.6.VÌ khuấn Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng Chủng Gluconacetobacter khi nuôi cấy trên thạch nghiêng có màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bóng, có tính dai và nhớt Bước 2: Hoạt hóa Tiến hành hoạt hóa bằng cách thu sinh khối vi khuấn từ các ống giống Gluconacetobacter nuôi trong các bình chứa nhân giống cấp 1 theo tỉ lệ 3 ống giống/250ml dịch Sau đó tiến hành lắc các bình chứa dịch nhân giống cấp 1 trong khoảng 1-1,5 ngày để thu sinh khối Gỉuconacetobacter Các bình chứa nhân giống cấp 1 được thể hiện trong hình 3.7 28 Hình 3.7.VÌ khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường nhân giống cấp 1 Sau 1-1,5 ngày nuôi lắc, các bình giống Gluconacetobacter có màu trắng đục, có hệ sợi lơ lửng trong dung dịch, đó là các sợi cellulose mà vi khuẩn sinh ra trong quá trình sinh trưởng Bước 3: Tạo màng Dùng micropipet cấy dịch nhân giống cấp 1 vào môi trường lên men theo tỉ lệ lOml/lOOml môi trường Tiến hành lên men tĩnh 4 ngày Các hộp lên men sau 4 ngày xuất hiện 1 lớp màng màu trắng đục trên bề mặt dịch lên men Lớp màng này có thể dày hay mỏng khác nhau ở các hộp khác nhau Bước 4: Thu màng Thu màng ở ngày thứ 4 Sau 4 ngày tiến hành thu màng BC Chuẩn bị hộp cồn 90° để ngâm bảo quản màng Dùng găng tay cao su vớt màng trong các hộp lên men Tiến hành cân và kiểm tra đặc tính của từng màng như cân nặng, độ dày, độ dai 29 Hình 3.8 Màng BC từ chủng Gluconacetobacter Đã lên men tạo màng BC thành cống từ chủng Gluconacetobacter 3.2 Ảnh hưởng của KNO3 tói khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter Trong quá trình phát triến tiến hóa, các vi sinh vật có quan hệ mật thiết với các yếu tố của điều kiện sống Mọi hoạt động sống của vi sinh vật đều phụ thuộc vào sự tác động chi phối của môi trường Các vi sinh vật cần ở môi trường tự nhiên hay môi trường nhân tạo (nuôi cấy) những chất dinh dưỡng đế xây dựng lên các hợp chất của tế bào và các hợp chất dùng cho trao đối chất và năng lượng Đối với sự phát triển của vi sinh vật nói chung và các vi khuấn Gluconacetobacter nói riêng, các điều kiện môi trường cần cung cấp tương đối đơn giản Tuy nhiên cũng phải đảm bảo đầy đủ các nguồn dinh dưỡng như nước, nguồn năng lượng như cacbon, nitơ, gluxit, vitamin, các hợp chất khoáng và các nhân tố sinh trưởng Các yếu tố này không chi' cung cấp năng lượng cho vi sinh vật mà còn là nguồn nguyên liệu cấu trúc nên các thành phần tế bào khi vi khuẩn sinh trưởng và phát triển Do đó các yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triến của vi khuấn Đối với vi khuẩnGluconacetobacter, tế bào nhỏ nên sự ảnh hưởng của các yếu tố trên biếu hiện rõ rệt Sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng không chỉ xảy ra khi nó bị thiếu hụt mà còn diễn ra khi ta cung cấp các yếu tố đó ở các nồng độ khác nhau Không phải ở bất kì nồng độ nào vi sinh vật cũng có thể sử dụng các chất dinh dưỡng ta cung cấp và phát triển bình thường mà mỗi loài vi khuấn có một ngưỡng 30 nhất định với từng yếu tố dinh dưỡng và từng điều kiện môi trường sống Các điều kiện này không đạt đến ngưỡng hoặc vượt quá ngưỡng thì sự sinh trưởng và phát triến của vi khuấn diễn ra không bình thường thậm chí ngừng sinh trưởng Mặt khác lại có những nồng độ mà tại đó vi sinh vật sinh trưởng và phát triến rất nhanh và mạnh Với phương pháp nghiên cứu chủ yếu là: giữ nguyên nồng độ các thành phần khác của môi trường, chỉ thay đối nồng độ KNO3, tôi tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường dịch thế MT3 (thay (NH 4) 2S04 bằng KNO3) ở 30°c Hình 3.9 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đỗi hàm lượng KNO 3 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả đạt được biểu hiện ở bảng 3.1 và hình 3.10 31 Hình 3.10 Sau 4 ngày lên men tạo màng BC trên MT3 có sự thay đổi hàm lượng KNO 3 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter ST T 1 Hàm lượng Đặc điểm của màng BC KNO3 (g/1) Khối lượng màng (g) 1 Không có sự hình thành màng 0 2 2 Không có sự hình thành màng 0 3 3 Không có sự hình thành màng 0 4 4 Không có sự hình thành màng 0 5 5 Không có sự hình thành màng 0 6 6 Không có sự hình thành màng 0 Nguồn nitơ ảnh hưởng gián tiếp tới khả năng tạo màng thông qua ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một so coenzyme quan trọng như ATP, NADP, FDA và một so enzyme tham gia vào quá trình tạo thành Hemicellulose Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH4+ Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Do đó 32 khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH^SCU, NH4NO3, nguồn nitơhữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men Từ kết quả kiếm tra cho thấy nguồnnitơ vô cơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triến phù hợp với nghiên cứu của tác giả Neelobon, Jiraporn và Suwanncee (2007) Nguồn nitơ vô cơ KNO 3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triền 3.3 Ảnh hưởng của (NH 4 ) 2 S0 4 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủngvi khuẩn Gluconacetobacter Yeu tố (NH 4) 2S 04 của Gluconacetobacter, là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triến.Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC Ngược lại, nếu hàm lượng nitơ quá nhiều, vi khuấn không sử dụng hết, nó sẽ bị thối rữa gây ô nhiễm môi trường [3] Mặt khác, nitơ có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo của axit nucleic, photpholipit, một số coenzyme quan trọng như ATP, NADP, FDA và một so enzyme tham gia vào quá trình hình thành màng BC Đe tìm ra nồng độ (N]-Lị)2S04tốt nhất cho sự hình thành màng BC, tôi quyết định nuôi cấy chủng Gỉuconacetobacter trên môi trường dịch thế(MT3) ở 30°c với sự thay đối hàm lượng của (NH4) 2S04 từ Og/1 đến 6g/l Hình 3.11 Lên men tạo màng trên MT3 có sự thay đối hàm lượng (NH4)2so4 33 Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả dẫn ra ở bảng 3.2 và biếu đồ 3.1 Bảng 3.2 Ảnh hường của nồng độ (NIỈ 4 ) 2 S 04 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter ST T Hàm lượng Đặc điếm của màng BC (NH 4) 2so 4 (g/1) Khối lượng màng (g) 1 0 Màng mỏng, dễ rách 1.99 2 1 Màng mỏng, dễ rách 3.15 3 2 Màng mỏng, dai, mềm 5,92 4 3 Màng dày, dai, trong 7.64 5 4 Màng mỏng, dai, 5.68 6 5 Màng mỏng, dai, mềm 4.47 7 6 Màng mỏng, dễ rách 2.30 9.000 7.64 0 8.0 7 5.92 0 0 >5 0 3.000 0 52.0 6.0001 u> 1 5.000 0 ÙỌ c §• 4.000 0 0 3.150 1.990 E 00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 Hàm lưựng (g/l) Biểu đồ 3.1 000 Biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ (NH 4 ) 2 S 04 đến hình thành màng BC của chủng Gluconacetobacter 34 Hình 3.12 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SƠ 4 đến khối lượng tươi của màng Từ bảng 3.1, biểu đồ 3.1 và hình 3.12 ta thấy rằng (NH 4)2SƠ4 ở hàm lượng 3/1 vi khuẩn sẽ tạo ra màng BC dày nhất Có thể giải thích kết quả thu được như sau: Ket quả kiểm tra cho thấy, ở hàm lượng 3g/l môi trường cho hiệu suất màng BC cao nhất Hàm lượng (NH4)2SƠ4 trên 3g/l có thể là quá cao đối với nhu cầu của tế bào vi khuấn Gluconacetobacter, do đó không thế hấp thụ hết lượng sulphate amone làm tăng pH dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và tổng hợp màng BC của vi khuấn Vì vậy, lượng BC tạo ra thấp hơn so với môi trường có hàm lượng (NH4)2SƠ4 3g/l Còn hàm lượng (NtLị^SCU dưới 3g/l có thể là thấp hơn so với yêu cầu phát triển của vi khuẩn, nên lượng BC tạo ra thấp hơn Ket quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Schramm và Hestrin (1954) và tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013), tôi quyết định sử dụng nguồn (NtLị^SCU với hàm lượng 3g/l để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Nguồn nỉtơ vô cơ (NH ậ) 2SO 4 phù hợp cho quá trình lên men tạo màng BC của chủng Gỉuconacetobacterlà 3 (g/ỉ) 3.4 Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo Nước gạo có lượng dinh dưỡng rất cao với lượng chất béo chưa bão hoà, vitamin nhóm E, nhóm B, kẽm, canxi, kali đều rất cao, ngoài ra trong cám gạo còn có chứa chất béo omega 3 khá cao Khoảng 65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám, thành thần của cám có nhiều lọai vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho vi khuẩn phát triển Thành phần - Calori - Lipit - Chât béo bão hòa Khối lượng/100g 316 KJ 21 g 4.2 g - Chất xơ tiêu hóa được 21 g - Carbohydrat 28 g - Đường 0,9 g - Protein 13,3 g - Vitamin E 4,9 mg - Vitamin B6 4,1 mg - Canxi 57 mg Theo: www.Nutritiondata.com Tôi tiến hành lên men tạo màng từ chủng Gluconacetobacterưèn môi trường dịch thể (MT3) ở 30°c với môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa Ket quả thí nghiệm được dẫn ra trên hình 3.13 và bảng 3.3 Bảng 3.3 So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo Đặc điếm màng BC Môi trường nước dừa Môi trường nước gạo Màu sắc, cảm quan Khối lượng màng Màng mỏng, nhẵn, màu Màng mỏng, nhẵn, màu trong đục 7.64g 5.91g tươi thu được Hình 3.13 Khối lượng màng BC thu được trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo Nhận xét :môi trường nước gạocó khả năng tạo màng tốt,tương đương với môi trường nước dừa Thu màng ở ngày thứ 4,không có sự chênh lệch lớn về khối lượng, màng mỏng, dai, nhẵn.Ket quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trung Kiên (2013) Như vậy môi trường nước gạo có thế thay thế môi trường nước dừa khi lên men tạo màng BC từ chủngGluconacetobacter KÉT LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ 1 Kết luận 1.1 Kiểm tra một một số đặc tính sinh học và lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacterthu màngốn định ở ngày thứ 4 1.2 Nguồn nitơ KNO3 không thích hợp cho chủng Gluconacetobacter phát triển 1.3 Xác định được nguồn nitơ vô cơ (NH^SCU phù hợp cho quá trình lến men tạo màng BC của chủng Gỉuconacetobacterìầ 3 (g/1) 1.4 Đã xác định được khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước gạo 2 Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ đến khả năng hình thành màng của chủng Gluconacetobacter Đe sản phẩm hoàn thiện hơn và ứng dụng vào thực tiễn cần phải tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng khác tới khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIÉNG VIỆT [1] Chu Văn Man (2003), ứng dụng tin học trong sinh học , Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội [2] Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr 214267 [3] Đặng Thị Hồng (2007), Phân lập, tuyến chọn và nghiên cứu một sổ đặc tính sinh học của vi khuân Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học, Luận văn thạc sĩ sinh học trường ĐHSP Hà Nội [4] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một sẻ đặc điểm của vi khuấn Acetobacter và ứng dụng lên men acetỉc theo phương pháp chìm,Luận án PTS khoa học sinh học ĐHSP Hà Nội [5] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Hoàng Thị Thảo (2011), "Nghiên cứu vi khuấn Acetobacter xylinum sinh tống hợp màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị bỏng", Tạp chí Y học thảm họa và bỏng, ISSN 1859-3461 số 2, tr 122-127 [6] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu các đặc tính màng cellulose vi khuân từ Acetobacter xỵlỉnum sử dụng làm màng trị bỏng Số 361, Tạp chí dược học [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 149-150 [8] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tr 17-34, 63-74, 89-92 [9] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterỉal cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận văn thạc sĩ sinh họctrường ĐHSP Hà Nội [10] khả Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học và