Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây hoa cúc nhật CN01 (chrysanthemum maximum seiun 3) in vitro

... Ảnh hưởng nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ táo đến chiều cao hoa cúc Nhật CN01 in vỉtro - Ảnh hưởng nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ táo đến chiều dài rễ hoa cúc Nhật. .. Nhật CN01 in vỉtro - Ảnh hưởng nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ táo đến hệ số nhân nhanh hoa cúc Nhật CN01 in vitro - Ảnh hưởng nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ táo đến. .. Thị Hương Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đề tài: “Anh hưởng nước dừa, nước chiết từ mầm ngô nước chiết từ táo đến sinh trưởng hoa cúc Nhật CN01 (Chrysanthemum maxỉmum Seỉun - 3) in vỉtro ” kết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ===»T)D3G8=== ĐỎ THỊ HƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA NƯỚC DỪA, NƯỚC CHIÉT TÙ MẦM NGÔ VÀ NƯỚC CHIÉT TỪ QUẢ TÁO ĐẾN SINH TRƯỞNG CỦA CÂY HOA cúc NHẬT CN01 {Chrysanthemum maximum Seiun - 3) IN VITRO KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực yật HÀ NỘI, 2015 CẢM ƠNsắc đến ThS. La Việt Hồng đã trực Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chânLỜI thành và sâu tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện đế tôi hoàn thành khóa luận. Tôi chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thế cán bộ Phòng Thí nghiệm Sinh lý thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày .. tháng ... năm 2015 Sinh viên thực hiện Đỗ Thị Hương Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Anh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây hoa cúc Nhật CN01 (Chrysanthemum maxỉmum Seỉun - 3) in vỉtro ” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS. La Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác. CAM HàLỜI Nội, ngàyĐOAN ... tháng ...năm 2015 Sinh viên thực hiện Đỗ Thị Hương DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT a-NAA a - Napthalene acelic acid Agar Thạch BAP 6 - benzyl amino purin CT Công thức ĐC Đối chứng IAA p - indole - acetic acid IBA Indode - 3 - butyric acid MS Murashige and Skoog, 1962 DANH MỤC HÌNH Hình 3.11. Chiều dài rễ nuôi cấy trong nước chiết từ mầm ngô ở nồng độ 20% -........................................................................Hình 3.16. Khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ở môi trường nước chiết từ quả táo 20% - 40 ngày.................Error! Bookmark not defined. -........................................................................Hình 3.17. Khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ở môi trường nước chiết từ mầm ngô 10% - 40 ngày..............Error! Bookmark not defined. -........................................................................Hình 3.18. Khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ở môi trường nước dừa 10% - 40 ngày....................................Error! Bookmark not defined. -.............................................Hình 3.19. Khối lượng khô cúc CN01 ở môi trường nước chiết từ mầm ngô 10% -40 ngày................................................................. -......................................................................................................................... Hình 3.20. Khối lượng khô cúc CN01 ở môi trường nước dừa 10% - 40 ngày ............................................................................................ 43 - Hình 3.21. Mầu cúc bị nhiễm khuẩn sau 10 ngày nuôi cấy. Error! Bookmark not defined. - Hình 3.22. Mầu cúc bị mốc sau 10 ngày nuôi cấy .............................................................................. Error! Bookmark not - defined. - - Hình 3.23. Mầu cúc sạch nhưng bị chết sau 10 ngày nuôi cấy.................................................................................. Error! - Bookmark not defined. Hình 3.24. Mầu cúc sạch, sống sau 10 ngày nuôi cấy ..Error! Bookmark not defíned. - DANH MỤC BẢNG - Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước dừa đến sinh trưởng - MỤC LỤC -.............................................................................................................................. -.......................................................................................................................... - PHỤ LỤC - MỞ ĐÀU 1. Lí do chọn đề tài - Hoa là một món quà đặc biệt, có thể ví như nguồn cảm hứng thanh tao, hay người bạn tri âm, tri kỉ mà thiên nhiên đã ban tặng cho con người. Từ bao đời nay, hoa đã gắn liền với đời sống của con người, mang đến cho con người biết bao cảm xúc, niềm tin và tình yêu cuộc sống. - Ngày nay, nhu cầu về hoa trên thị trường rất lớn và ngày càng tăng cao. Sản xuất hoa đã trở thành một ngành kinh tế phát triến đem lại thu nhập cao cho nền kinh tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới như Hà Lan, Nhật, Mỹ... Theo Roger và Alan (1998), năm 1997, giá trị sản lượng hoa trên thế giới đạt 27 tỷ USD và những năm đầu của thế kỷ XXI là 40 tỷ USD [28]. Ở nước ta, sản xuất hoa đã và đang được ưu tiên đầu tư phát triển, diện tích trồng hoa không ngừng tăng lên. Ví dụ như: Diện tích trồng hoa của Hà Nội năm 1995 đạt 500 ha, tăng 12,8 lần so với năm 1990 [3], đến năm 2001, đạt tới 867 ha [14]. - Trong các loài hoa cắt cành hiện nay, hoa cúc là một trong những loài hoa được ưa chuộng và trồng phố biến ở nước ta chỉ đứng sau hoa hồng (Linh Xuan Nguyen, 1998) [24]. Hoa cúc được ưa chuộng bởi sự đa dạng về chủng loại và màu sắc; phong phú về kiểu dáng, khá bền và phù họp với nhiều mục đích sử dụng. Hơn thế cây cúc được điều khiển ra hoa để tạo nguồn sản phẩm hàng hóa liên tục và ổn định quanh năm (John và Harold, 1999) [20]. Chính vì vậy nhu cầu có được các giống cúc mới thông qua chọn tạo và nhập nội nhằm đáp ứng được nhu cầu của thị trường luôn được người sản xuất quan tâm và chú trọng. Đe góp phần làm đa dạng và phố biến giống mới, đồng thời đáp ứng một phần nhu cầu cây giống cho ngành sản xuất hoa cúc ở nước ta, giống cúc Nhật mà đặc biệt là cúc Nhật CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun-3) đã được nghiên cứu sản xuất bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. 1 1 - Nuôi cấy mô tế bào thực vật có ưu điểm là cho hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lượng giống lớn cây trồng trong thời gian ngắn, đồng thời không chịu sự chi phối của môi trường, bảo quản được trong thời gian dài. Hơn nữa, thành phần môi trường nuôi cấy ngày càng trở nên phong phú, đầy đủ hơn, góp phần quan trọng trong việc nâng cao hiệu quả sinh trưởng cây giống in vitro. Cây giống sinh trưởng nhanh, mạnh cho năng suất cao, phần nào đáp ứng được nhu cầu sản xuất hiện nay. - Tuy nhiên, việc nâng cao năng suất và chất lượng giống cúc này vẫn đang gặp rất nhiều khó khăn trong công tác sản xuất. Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Anh hưởng của nước dừay nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trường của cây hoa cúc Nhật CN01 (Chrysanthemum maxỉmum Seỉun - 3) in vỉtro ” 2. Mục đích và nhỉệm yụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cún - So sánh và đánh giá hiệu quả kích thích sinh trưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây cúc Nhật CN01. 2.2. - Nhiệm vụ nghiên cứu Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến chiều cao cây hoa cúc Nhật CN01 in vỉtro. - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến chiều dài rễ cây hoa cúc Nhật CN01 in vỉtro. - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến hệ số nhân nhanh của cây hoa cúc Nhật CN01 in vitro. - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến khối lượng tươi của cây hoa cúc Nhật ỉn vỉtro. 1 2 - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến khối lượng khô cây hoa cúc Nhật in vitro. 3. Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp tư liệu khoa học cho tìm hiểu và nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch thu từ tự nhiên đến sinh trưởng của hoa cúc Nhật CN01 bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Góp phần tìm ra loại dịch tự nhiên có hiệu quả tốt đối với quá trình sinh trưởng của cây in vitro. - NỘIDUNG CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giói thiệu khái quát về cây hoa cúc 1.1.1. Nguồn gốc cây hoa cúc - Nói về nguồn gốc, theo tài liệu ngành Thực vật học, cây hoa cúc xuất xứ từ Trung Hoa. Khoảng 500 năm trước công nguyên, Khống Tử đã đề cập đến việc trồng hoa cúc. Ớ Nhật, vào thế kỷ thứ 8 sau công nguyên mới có sự hiện diện của hoa cúc. Riêng Châu Âu, cúc được mang vào Hà Lan năm 1688, nhưng việc trồng hoa cúc vào thời điểm này không thành công. Cho đến năm 1789, M. Blancard ở Marseilles (Pháp) đem ba loại cúc từ Trung Hoa về Pháp, nhưng chỉ có một trong ba loại này sống được, đó là cúc "Old Purple" và vì vậy đã được ghi trong lịch sử hoa cúc. Ở Anh, cuối thế kỷ 18, người ta thấy có 8 loại cúc được nhập cảng; đến năm 1824 có 24 loại và năm 1826 lên tới 48 loại. Vào năm 1860, nhân dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã đem nhiều loại cúc mới về Châu Âu. Trong sự phát triển hoa cúc, chính sự lai giống tiếp của các loại cúc này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa. Ớ châu úc, hoa cúc được trồng tại Tasmania vào năm 1836, New South Wales 1843, Victoria 1855 và ở New Zealand 1860. Ở Mỹ, cuối thế kỷ 19 cúc được trồng rất nhiều. Riêng hoa cúc của Việt Nam hiện tại có xuất xứ từ Trung Hoa, Nhật và Châu Âu [30]. 1 3 - Hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là loài hoa đặc trưng của đất nước Trung Quốc và Nhật Bản. Ở Trung Quốc, người ta đã làm lễ “thắng lợi hoa vàng” (hoa cúc) và cây hoa cúc đã đi vào các tác phẩm hội họa từ thời gian này. Một thành phố cố xưa của Trung Quốc đã đặt tên là Ju - Xian, có nghĩa là: “Thành phố hoa cúc”. Ở Nhật Bản, hoa cúc được sử dụng chính trong các lễ hội và đã được giới thiệu tới Nhật Bản khoảng thế kỉ thứ VIII. Tới thế kỉ thứ XVII, hoa cúc được mang tới Châu Âu. Ngày nay, cúc được trồng rộng rãi trên thế giới như: Hà Lan, Đức, Pháp, Nhật Bản, Nga, Mỹ, Singapore, Isaren...[5], [12]. - Ở Việt Nam, đến đầu thế kỉ XIX, hoa cúc đã được trồng thành các vùng chuyên canh. Hiện nay, Đà Lạt có diện tích trồng hoa cúc lên tới 5000 ha; Hà Nội đã hình thành các vùng trồng chuyên canh như xã Tây Tựu (Từ Liêm) diện tích xấp xỉ 200 ha, quận Tây Hồ diện tích 70 ha, đảm bảo cung cấp hoa cho người tiêu dung [12], [38]. 1.1.2. Vị trí phân loại - Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp., xuất phát từ tiếng Hy Lạp là Chrysos (nghĩa là vàng) và anthemom (nghĩa là hoa). - Trong hệ thống phân loại thực vật: - Ngành: Angỉospermatophyta - Lóp: Dicotylédones - Bộ: Asterales - Họ: Asteraceae - Chi: Chrysanthemum sp. - Loài: có nhiều loài, nhưng phổ biến như hoa cắt cành có thể kể là morifolium - Họ Cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của Ngành Ngọc Lan (Magnolỉophyta), thực vật hạt kín (Angnỉospermatophyta) [29]. Qua hai hội thảo 1 4 quốc tế về họ Asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên “Sinh học và hóa học của họ Cúc” đã có sự thống nhất tương đối về hệ thống học của họ Asteraceae. Họ Cúc trên thế giới xếp trong 2 phân họ, 13 tông [21]. Nghiên cứu của Anderson (1987), Langton (1989) cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống cúc đã đưa vào sử dụng với sự đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc [17], [22]. Việt Nam có 2 phân họ và 12 tông, nhưng hiện tại chia làm 17 tông. Họ Cúc có khoảng 1550 chi với 23000 loài [13], [29]. - Tuy nhiên, có nhiều tài liệu khác nhau về số liệu loài hoa cúc. Theo tác giả Nguyễn Nghĩa Thìn thì họ Cúc có 2500 loài và có 1100 chi [13]. Theo Trần Lan Hương và cộng sự, hoa cúc có hơn 3000 loài với kích thước, màu sắc khác nhau [5]. 1.1.3. Đặc điếm thực vật học và sinh thái học cây hoa cúc 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật học -Rễ - Cúc thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang phân bố ở tầng đất mặt từ 5 - 20 cm, số lượng rễ lớn nên có khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh. - Thân - Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm giàn để đõ' cây khỏi đổ. - -Lá - Thường là lá đơn, mỗi giống cúc có đặc điểm khác nhau như hình dạng lá xẻ thùy nông hay sâu, phiến lá dày hay mỏng và màu sắc là khác nhau. - -Hoa - Hoa cúc chủ yếu có 2 dạng: hoa lưỡng tính và hoa đơn tính. - + Dạng lưỡng tính: Trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái. 1 5 - + Dạng đơn tính: Trong hoa chỉ nhị đực hoặc nhụy cái; đôi khi có loại - vô tính (không có cả nhị, nhụy, hoa này thường ở phía ngoài đầu). - Khác với các loại hoa khác có từng bông riêng rẻ, hoa cúc là tập họp của rất nhiều hoa nhỏ nằm cùng trên một đế hoa. Đó là một trong những đặc điểm của gia đình Asteraceae. Những hoa nhỏ trên đế hoa gồm có hai loại: loại hoa hình ống (Röhrenblüten) và hoa hình lưỡi (Zungenblüten). Hoa hình lưỡi có cánh hoa dài nằm phía ngoài cùng làm thành một vòng tròn bao quanh phần hoa hình ống nằm chính giữa. Hoa hình lưỡi có cánh dài chỉ để làm đẹp chứ không có khả năng sinh sản. Khả năng này chỉ có ở hoa hình ống mà thôi. Tùy theo sự xếp đặt vị trí của các hoa hình lưỡi: một lớp, nhiều lớp, đều hoặc không đều... mà người ta sẽ có những hoa với hình dáng giản dị đến bông tròn đầy cánh. Ở những hoa tròn đầy ta không thấy rõ nhóm hoa hình ống vì bị che lấp bởi hoa hình lưỡi. - Tùy theo cách sắp xếp cánh hoa, người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp/bông) và hoa đơn (chỉ có một vòng hoa/bông). Những cánh hoa ở phía ngoài thường có màu sắc đậm hơn, xếp thành nhiều tầng, chặt hay lỏng tùy theo từng giống. Cánh có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn đều, có loại dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. - Đường kính bông hoa phụ thuộc vào giống: - + Giống hoa to: đường kính 10 - 12 cm (Pha Lê, Đại Đóa,...). - + Giống hoa trung bình: đường kính 5-7 cm (Thọ đỏ, Đỏ nhung,...). - + Giống hoa nhỏ: đường kính 1-2 cm (chi trắng, chi vàng,...). - Quả - Cây hoa cúc có dạng quả bế khô, hình trụ hơi dẹt chỉ chứa một hạt. Hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ. 1.1.3.2. Đặc điểm sình thải học 1 6 - Nhiệt độ - Hoa cúc có nguồn gốc ôn đới, nên đa số ưa khí hậu mát mẻ. Với Việt Nam, mùa thu là mùa có khí hậu tương đối mát mẻ và thuận lợi, nhiệt độ thích hợp dao động 15 - 20°c, bên cạnh đó cũng có một số giống cúc chịu được nhiệt độ 30- 35°c. Tuy nhiên nhiệt độ quá cao (35°C) hay quá thấp (10°C) đều làm ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng và phát triển của cây. - Ánh sáng - Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng [16]. - Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng, có sinh khối lớn và bộ lá to, do vậy cũng chịu hạn kém. Ánh sáng có sự ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây hoa cúc. Tuy nhiên, ở mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triến cây có yêu cầu ánh sáng khác nhau: - + Thời kỳ cây con: khi mới ra rễ cây cần ít ánh sáng vì lúc này cây non còn sử dụng các chất dinh dưỡng dự trữ. - + Thời kỳ chuẩn bị phân cành: cây cần nhiều ánh sáng để quang họp tạo các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của cây. - Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn, thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày với nhiệt độ là 20 - 25°c. Thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trưởng của cây hoa cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lượng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm, cây ngắn, chất lượng hoa kém [12]. - Ảm độ - Độ ẩm thích hợp nhất cho cây sinh trưởng phát triển là độ ẩm đất 60 70%, độ ẩm không khí 60 - 65%. Nếu độ ẩm trên dưới 80% thì cây sinh trưởng mạnh nhưng dễ mắc một số bệnh nấm. Đặc biệt vào thời kì thu hoạch, hoa cúc 1 7 cần thời tiết trong xanh, khô ráo. Neu độ ẩm cao, tuyến mật của hoa sẽ dễ bị thối do nước đọng lại, cản trở quá trình thu hoạch [37]. - Đất và dinh dưỡng - + Đất: có vai trò cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây. Cây hoa cúc có bộ rễ ăn nông do vậy yêu cầu đất cao ráo, thoát nước, tơi xốp. - + Các chất dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) và các loại phân trung, vi lượng (Mg, - Zn, Cu, Fe, Mn, Bo...) có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triến, năng suất và chất lượng của hoa cúc. 1.2. Giá trị sử dụng của hoa cúc - Hoa cúc có giá trị trang trí, làm cảnh, tùy theo nền văn hóa khác nhau mà cách sử dụng chúng cũng khác nhau, do vậy mà hoa cúc ngày càng được ưa chuộng trong cuộc sống. Ở Chicago (Mỹ) năm 1961, hoa cúc chính thức được coi là hoa của thành phố. Ớ Trung Quốc, một số loại hoa cúc được dùng làm trà, thậm chí được sử dụng làm thuốc trừ sâu thân thiện môi trường. Ở Nhật Bản, hoa cúc được coi là người bạn tâm tình và có một “lễ hội hạnh phúc” để kỉ niệm hoa... Riêng ở Việt Nam, hoa cúc thường ở mặt ở công viên, vườn hoa, phòng khách, bàn làm việc, trong các lễ thăm viếng.... Ngoài ra, cúc còn được trồng đại trà nhằm mục đích cắm hoa bình, trồng trong bồn hay để trang trí...[12], [37]. - Không chỉ đế làm cảnh, theo Lê Kim Biên thì họ cúc gồm có 374 loài, trong đó có tới 181 loài đã biết giá trị sử dụng, chiếm 50%: ...[1] - Làm thuốc: cây hoang dại 85%, 16 loài cây trồng Làm cảnh: 30 loài (nhập nội có nguồn gốc nước ngoài) - Rau ăn: 31 loài tự nhiên, 4 loài trồng Thuốc trừ sâu: 3 loài (không gây độc) 1 8 - Phân xanh: 1 loài, cúc quỳ ở Mỹ dùng để phủ đất trống bạc màu Chất béo và tinh dầu: 12 loài, đặc biệt là cây thanh hao Ngày nay, khi mà khoa học công nghệ ngày một hiện đại thì việc sản xuất và nhân giống hoa cũng không còn là vấn đề khó khăn. Người ta đã có thể kéo dài được tuối thọ của hoa, điều khiển ra hoa theo ý muốn, trồng trái vụ hoặc cho nở vào các dịp lễ tết đã làm cho giá trị của hoa được tăng lên rất nhiều lần. 1 9 - Nhắc tới chi Chrysanthemum sp., có cúc Đại Đóa với nhiều loài, hoa có màu sắc khác nhau: vàng, trắng, đỏ tía, tím. Bông lớn, dáng đẹp, hoa nở nhiều vào dịp tết. Gần đây một số loài đã được trồng gần như quanh năm, phục vụ nhu cầu trang trí vào những ngày lễ. - Một số loài khác của chi Chrysanthemum sp. như cúc vàng hay kim cúc (C. ỉndỉcum L.) có bông nhỏ hon, dùng để pha chè, ngâm rượu, trồng làm cảnh; cúc trắng hay bạch cúc (C. morfolium ramat) dùng đế pha chè, ngâm rượu hoặc làm thuốc chữa nhức đầu, đau mắt; rau cải cúc (C. coronarỉum L.) thường trồng làm rau ăn [10]. 1.3. Đặc điểm sinh học cây hoa cúc CN01 - Giống cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) là giống cúc đơn [7] . Đây là giống nhập nội của Nhật Bản, được cung cấp từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triến Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001. - Giống cúc CNO1 có những đặc điếm: - Cây cao 70 - 75 cm, thân mập cứng, lá dài xanh bóng, bộ lá gọn, khả năng phân cành ít nên có thể trồng dày 45 - 50 cây/m 2. Hoa kép to, cánh ngắn, cứng, xếp chặt, có màu vàng cam [7]. Thời gian sinh trưởng từ 85 - 95 ngày, độ bền hoa cắt từ 10 - 12 ngày, được trồng chính vào các vụ xuân hè, hè thu và thu sớm. - Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ Phòng Nông nghiệp các tỉnh phía Bắc, năm 2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến - 6,3 ha; riêng Hà Nội có 4,9 ha [4]. Hình 1.1. Chrysanthemum - 2 0 maximum Seiun - 3 - Cây được trồng hầu hết ở các tỉnh phía Bắc. Giống hoa cúc này đã được đưa vào sản xuất thử tại một số vùng trồng hoa ở Hà Nội như Phú Thượng, Tây Tựu, Quảng An; Mê Linh - Vĩnh Phúc; một số tỉnh phía Bắc khác như Thái Nguyên, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Lào Cai...Thực tế sản xuất cho thấy, giống CN01 ốn định, sinh trưởng phát triển tốt, chịu nóng, cho năng suất cao và chất lượng tốt, được các vùng trồng hoa rất ưa chuộng với diện tích trồng đến năm 2006 là 16,2 ha, mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng một cách bền vững. Tháng 9/2007, giống cúc CN01 đã được Hội đồng khoa học phê duyệt và đề nghị Bộ NN - PTNT công nhận chính thức để mở rộng diện tích trong sản xuất, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và hướng tới xuất khấu.... [31]. 1.4. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong công tác nhân giống 1.4.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy ỉn vỉtro) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng. Trong môi trường nhân tạo, tù' các mô sẹo, mô phân sinh, chồi đỉnh... có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh, rút ngắn thời gian, không phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh và cho số lượng cây giống lớn, sạch bệnh. 1.4.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.4.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật - Năm 1902 lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức tên là Haberlandt [19] đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào. Theo nhận định của ông “mỗi 2 1 một tế bào bất kì lấy từ một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thế hoàn chỉnh”. - Mãi hơn 50 năm sau, các nhà thực nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật mới đạt được những thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào [2]. Đó là các công trình của các tác giả: - Miller và Skoog (1953) tạo được chồi từ mảnh mô cắt từ thân cây thuốc - lá. - Reinert và Steward (1958) tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn của mô tượng tầng bách từ củ và nuôi cấy dạng huyền phù. - Cooking (1960) tách và nuôi sống tế bào trần từ nhu mô mảnh lá. - Takebe (1971) đã tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần. - 1.4.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào 2 2 - Sự phân hoá là sự chuyến các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau. - Sự phản phân hóa là sự chuyến từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. - Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật. 1.4.3. 1.4.3.1. - ưu, nhược điếm của phương pháp nhân giống ỉn vỉtro Ưu điểm Có khả năng hình thành một số lượng lớn cây giống từ một mô, cơ quan với kích thước nhỏ 0,1 - 10 mm. - Cây giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh, không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh các giống sạch bệnh. - Hoàn toàn có thể điều chỉnh được thành phần dinh dưỡng, nhiệt độ, các chất điều tiết sinh trưởng... theo ý muốn. - Hệ số nhân giống cao, có khả năng sản xuất số lượng giống lớn cây trồng trong thời gian ngắn. Hệ số nhân giống trong khoảng 3 6đến 1012 cây giống/năm [2]. - Tiến hành quanh năm, không chịu sự chi phối của môi trường. - Có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro. 1.43.2. Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống cao nhưng cây giống có kích thước nhỏ khó trồng trong điều kiện tự nhiên, đôi khi xuất hiện các cây không mong muốn. 2 3 - Do được cung cấp nguồn hydratcacbon nhân tạo nên khả năng tự tống họp các chất hữu cơ kém. Cây giống ỉn vỉtro được nuôi trong các bình thủy tinh hoặc bình nhựa có độ ẩm tương đối bão hòa. Do đó, khi trồng ngoài tự nhiên thường bị mất cân bằng nước, gây hiện tượng bị héo cây và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện ỉn vỉtro ra điều kiện tự nhiên, cần trải qua giai đoạn “huấn luyện” để quen dần với điều kiện tự nhiên. - Cần thiết bị hiện đại, kĩ thuật viên có trình độ cao. 1.4.4. 1.4.4. ]. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào Vật liệu nuôi cấy - Nguyên liệu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn rễ và thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn, thậm chí các mấu thân ngầm hoặc các cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành) cũng được dùng cho nuôi cấy [16]. - Mục đích của nuôi cấy và đặc tính của loài cây sẽ quyết đinh việc chon lựa loại mẫu nào là phù hợp. Đe tiến hành vi nhân giống thực vật, cây cho mẫu (cây mẹ) phải mang một hoặc nhiều đặc điếm ưu việt mà chúng ta quan tâm: sinh trưởng tốt, cho sản lượng, chất lượng cao, ít bị nhiễm bệnh, khả năng chống chịu tốt... Đa phần các mẫu thường được thu nhận vào đầu mùa sinh trưởng, lúc sáng sớm khi toàn cây vẫn còn trạng thái trương nước [27]. - Sự tái sinh của mẫu phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy, đặc điểm di truyền của loài cây, trạng thái sinh lí của cây cho mẫu và đôi khi chịu ảnh hưởng của các mùa trong năm. 1.4.4.2. Môi trường nuôi cấy - Vào thời kỳ Haberlandt tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào phân lập, những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất 2 4 hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất điều khiển sinh trưởng hầu như chưa được khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công. - Từ đầu những năm 20 đã có một số công trình sử dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp. Ngoài muối khoáng và nguồn cacbon, bổ sung vào môi trường còn có vitamin và một số chất khác. Kotte và Robbins (1922) đã hoàn thiện thành phần môi trường, trong đó bổ sung thêm các loại đường, aminoaxit và dịch chiết nấm. Trong những năm 60, môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và cải tiến. Đó là các môi trường Linsmainer và Skoog (1965) [25], môi trường Murashige và Skoog (1962) [26], môi trường Gamborg (1968) [18]. - Với từng loại thực vật, tế bào, mô, cơ quan khác nhau thì thành phần môi trường nuôi cấy cũng khác nhau tùy thuộc vào mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trường cơ bản cho tất cả các loại cây bao gồm: - Các nguyên tố đa lượng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu huỳnh): là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan tử trong cơ thể thực vật. - Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden, bo, iot). Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Mọi sự thiếu và thừa các nguyên tố này đều có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của cây [2]. - Nguồn cacbon: Mô và tế bào thực vật ỉn vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, hoặc bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. VI vậy bổ sung nguồn cacbon (thường là saccharose) là điều bắt buộc và cần thiết [2]. Ngoài ra, còn có một số nguồn cacbon khác có thể sử dụng trong nuôi cấy là glucose, maltose, fructose, lactose.... 2 5 - Vitamin: Dù các tế bào và mô đều có khả năng tự tống hợp vitamin, nhưng thường không đủ về số lượng, do đó cần phải bổ sung từ bên ngoài vào, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B (Bl, B6, B3, B5, axit nicotinic...). Trong đó vitamin BI đóng vai trò quan trọng nhất, tham gia biến đổi cacbon, tạo thành phần tổ họp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thường dùng là 0,1 - l,0mg/l [16]. - Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, nước chiết từ quả táo, nước chiết từ mầm ngô, dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,... cũng được sử dụng trong nuôi cấy in vỉtro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đấy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trưởng của mô [15]. - Agar: là một polysacarit của tảo (chủ yếu là tảo đỏ - Rodophyla). Agar khi ngâm nước ở 80°c sẽ chuyến sang dạng sol và ở 40°c thì trở lại trạng thái gel. Khả năng ngậm nước cao, khoảng 6 - 12g/l nước. Tuy ở trạng thái gel nhưng vẫn đảm bảo cho các ion vận chuyến dễ dàng, thuận lợi cho việc hút dinh dưỡng của cây trong môi trường nuôi cấy [2]. - Các chất điều hòa sinh trưởng: auxin, cytokinin, kinetin, zeatin, abscisic acid (ABA)... là các chất điều hòa thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào. Mỗi chất có ảnh hưởng và tác dụng khác nhau tới từng bộ phận của mô, tế bào, cơ quan nuôi cấy. Nhờ có các chất này mà có thể tái sinh cây hoàn chỉnh một cách dễ dàng, giúp cây sinh trưởng, phát triển nhanh và mạnh về cả 2 phía. * Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành 2 6 1'ễ [2]. Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA, a - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến [15]. 2,4 - D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA, a - NAA thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ [6]. * Cytokinin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy. Các cytokinin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BAP, zeatin giúp tạo số lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ [6], có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thế và kìm hãm sự tạo rễ). Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/cytokinin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đấy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triến chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành [15]. - Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit). Gibberelin điến hình là GA 3 có tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,... Nhưng so với auxin và cytokinin thì nhóm GA rất ít được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA 3 được đưa vào môi trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật [15]. - pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin. Sự hấp thụ các 2 7 hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. pH môi trường thường ở 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng [11] . Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy [9]. Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9. Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đối trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 - 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi. Những thay đối này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào. Tuy nhiên, giá trị pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate. 1.4.4.3. Điều kiện nuôi cấy a. Nhiệt độ - Các loài khác nhau thì yêu cầu về điều kiện nhiệt độ cho sinh trưởng và phát triển là không giống nhau. Nhiệt độ thích hợp cho phòng thí nghiệm nuôi cấy thường là 25 ± 1 °c. Nếu nhiệt độ thấp hoặc quá thấp sẽ làm chậm hay làm ngừng hẳn sinh trưởng của mẫu nuôi cấy, được sử dụng nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro. - Theo Shigenobu và Sakamoto (1981), nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải không đối trong suốt thời gian nuôi cấy. b. Ánh sáng - Ánh sáng ảnh hưởng mạnh mẽ tới quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô. Cường độ ánh sáng càng lớn thì sinh trưởng của chồi chậm lại 2 8 nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ [16]. Do ánh sáng còn tham gia vào sự phát sinh, phát triến phôi soma nên cường độ ánh sáng cao gây nên sự sinh trưởng của mô sẹo. Ánh sáng ở cường độ trung bình kích thích sự tạo chồi, ngoài ra cường độ ánh sáng thấp, chồi sẽ gia tăng chiều cao và có màu xanh đậm [16]. 1.5. Các nhóm chất tự nhiên sử dụng trong nuôi cấy mô - Đe đáp ứng nhu cầu sản xuất hiện nay, các nhà nuôi cấy mô và tế bào đã không ngừng nghiên cứu và tìm tòi ra các biện pháp làm tăng năng suất và chất lượng cây giống. Họ khắng định môi trường chỉ bao gồm muối khoáng và đường chưa đủ cho tế bào sinh trưởng tốt. Yì vậy, thành phần môi trường nuôi cấy ngày càng trở nên phong phú, đầy đủ và phức tạp hơn. Người ta đã bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số nhóm chất tự nhiên nhằm làm gia tăng thành phần dinh dưỡng và các chất có hoạt tính sinh học cao nên sẽ kích thích sự sinh trưởng, phát triển của cây ỉn vitro. Một số dịch chiết hữu cơ thường được bổ sung như: nước dừa, dịch chiết mầm lúa mỳ, dịch chiết nấm men [31], [32], [2] ngoài ra còn có nước chiết từ quả táo, nước chiết từ mầm ngô... 1.5.1. Nước dừa - Năm 1941, Datura và Daucus đã sử dụng nước dừa để nuôi phôi và mô. Theo kết quả phân tích thành phần nước dừa từ non tới già của Tuleckevad (1961) cho thấy trong nước dừa có: - Amino acid tự do: Đạt nồng độ từ 190,5 ppm đến 685 ppm trong nước dừa tùy theo tuổi của quả tính từ non tới già. Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm [2]. - Amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid. - Axit hữu cơ - Đường - RNA và DNA 2 9 - Ngoài ra, nước dừa còn chứa các họp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập như: - Myo Inositol - Các hợp chât có hoạt tính auxin - Các cỵtokinin dạng glycoside 1.5.2. Nước chiết từ quả táo - Thành phần có nhiều trong táo là carbohydrat (pectin...), acid malic, acid quinic và các acid hữu cơ khác; các hợp chất thơm; các sinh tố và nguyên tố: K, p, Fe, Zn có vai trò trong sinh trưởng. 1.5.3. Nước chiết từ mầm ngô - Nhắc tới ngô thì có rất nhiều loại ngô, các giống ngô nếp, ngô răng ngựa ở nước ta thì có hàm lượng tinh bột cao, lượng đường ít. Trong khi các loài ngô ở Mỹ và châu Âu thường được lai tạo để có lượng tinh bột rất ít, độ ngọt cao (họ vẫn gọi là sweetcorn). - Trong ngô chứa rất nhiều thành phần hóa học quan trọng, có ý nghĩa như: protein, lipit, các loại axit amin, khoáng và các vitamin [33]: - Protein: Ngô có từ 8,5 - 10% protein, protein chính của ngô là zeatin, một loại prolamin gần như không có lysin và tryptophan. Neu ăn phối họp ngô với đậu đỗ và các thức ăn động vật thì giá trị protein ngô sẽ tăng lên nhiều. - Lỉpit: Lipit trong hạt ngô toàn phần từ 4 - 5%, phần lớn tập trung ở - mầm. - Chất béo: Trong ngô có 50% là axit linoleic, 31% là axit oleic, 13% là axit panmitic và 3% là stearic. - Gluxit: Gluxit trong ngô khoảng 60% chủ yếu là tinh bột, ở hạt ngô non có thêm một số đường đơn và đường kép. 3 0 - Chất khoáng: Ngô nghèo canxi, giàu photpho. Giống như gạo, ngô cũng là thức ăn gây toan. - Vitamin: Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có nhiều vitamin Bl. Vitamin pp hơi thấp cộng với thiếu tryptophan một axit min có thể tạo vitamin pp. Vì vậy nếu ăn ngô đơn thuần và kéo dài sẽ mắc bệnh Pellagre. Riêng ngô vàng có chứa nhiều caroten (tiền vitamin A). - Letham và Miller (1963) lần đầu tiên đã tách được cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là zeatin và có hoạt tính mạnh hơn kinetin 10 - 100 lần [34], [35]. - CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật - Cây cúc CN01 (Chrysanthmum maxỉmum Seiun - 3) do phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp. - - Hình 2.1. Mẩu cúc CN01 (Chrysanthmum maximum Seiun - 3) vô trùng 3 1 2.1.2. Chuẩn bị nước dừa, nưởc chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo cho nuôi cấy in vitro - Nước dừa: Là chất lỏng, trong, chứa trong quả dừa. Khi quả dừa già đi, nước dừa được thay thế bởi cùi dừa và không khí. Quả dừa non chứa rất ít cùi dừa, và lóp cùi này mỏng, rất mềm và khá trong. Chứng tỏ việc sử dụng nước dừa từ quả bánh tẻ đã được ứng dụng trong nghiên cứu. - Nước chiết từ mầm ngô: Hạt ngô được sử dụng cho gieo lấy mầm là hạt giống của ngô lai. Tiến hành ngâm và ủ ngô ở nhiệt độ thích họp cho nảy mầm. Ngâm hạt trong nước ấm: 2 sôi 3 lạnh từ 3 - 5h, sau đó ủ trong khăn ẩm hoặc tra trực tiếp xuống đất cát rồi giữ ẩm 3 - 4 ngày đến khi mầm mọc khỏi mặt đất. Khi ngô đã nảy mầm, tiến hành thu mầm và chiết lấy nước. - Hình 2.2. Hạt ngô đem gieo cho nảy mầm - - Hình 2.3. Mầm ngô đã tách khỏi hạt Nước chiết từ quả táo: Táo được sử dụng trong thí nghiệm là táo Gala (vỏ đỏ, chứa nhiều tinh bột, thịt táo mềm, nhiều nước). Tiến hành gọt vỏ, bổ miếng nhỏ sau đó cho vào xay. Khi thịt táo đã được xay nhuyễn, tiếp tục cho vào lọc, vắt lấy nước. Nước ép táo thu được này sẽ được sử dụng đế nuôi cấy mô cúc CNO1. 2.1.3. Thời gian và địa điếm nghiên cứu 3 2 - Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Sinh lý thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 từ ngày 10/03/2014 - 15/04/2015. 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm - a. Thiết bị - Tên thiêt bị - Hãng sản xuât - Cân kĩ thuật - GM612, Đức - Tủ lạnh sâu - FRIGO - Máy đo pH - HM30G/TOA, Đức - Nôi hâp khử trùng - HV - 110/HIRAYAMA, Nhật - Tủ lạnh Hitachi - 31AG5D, Thái lan - Máy cât nước hai lân - Trung Quôc - Buông cây vô trùng - AV - 110/TELSTAR - Máy khuây từ gia nhiệt - ARE/VELP, Italia - Cân phân tích - CP224S, Đức - Buông khí hậu nhân tạo - E8OO/AXYOS, Đức - mf Ả - UNIVERSAL 320R/ HETTICH, Đức Tủ âm - b. Dụng cụ - 2.1.5. Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy,... Môi trường nuôi cấy - Các thí nghiệm nuôi cấy in vỉtro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [18]: MS + 30g/l đường sacharose + 7,5g/l agar và các dịch chiết hữu cơ thực vật. - pH môi trường: 5,8. 3 3 - Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 11 7°c trong 15 phút. 2.1.6. Điều kiện nuôi cấy - Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo. - Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy với cường độ chiếu sáng 3000 - lux. - Quang kì: 16 giờ/ngày. - Nhiệt độ phòng: 25°c - 27°c. - Độ ẩm trung bình: 70% - 74%. 2.2. Phương pháp nghiên cửu 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.2. ì.1. Bo trí thí nghiêm - Đe xác định ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng cây cúc Nhật, thí nghiệm được tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose + 7g/l agar có bổ sung dịch chiết với các nồng độ khác nhau. Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại. Đánh giá thí nghiệm sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày theo dõi dựa trên các chỉ tiêu: Chiều cao cây, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô, hệ số nhân nhanh. - *Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nước dừa đến sinh trưởng của cây cúc Nhật. - Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước dừa đến sinh - trưởng cây hoa cúc Nhật. - Công thức - Nông độ (%) (v/v) - ĐC - 0,0 - DI - 10 3 4 - D2 - 15 - D3 - 20 - *Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nước chiết từ mầm ngô đến sinh trưởng của cây hoa cúc Nhật. - Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước chiết từ mầm ngô đến sinh trưởng cây hoa cúc Nhật. - Công thức - Nông độ (%)(v/v) - ĐC - 0,0 - N1 - 10 - N2 - 15 - N3 - 20 - *Thí nghiệm 3: Ánh hưởng của nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây hoa cúc Nhật. - Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng cây hoa cúc Nhật. - Công thức - Nông độ (%)(v/v) - ĐC - 0,0 - TI - 10 - T2 - 15 - T3 - 20 2.2.7.2. - Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu Chiều cao cây: được đo bằng thước kẻ thẳng. Đối tượng được đặt song song với thước kẻ thẳng, gốc cây được đặt tương ứng với vạch 0 (cm) của 3 5 thước, ngọn cây chạm tương ứng với vạch nào thì đó sẽ là chiều cao của cây, đơn vị đo là cm. - Chiều dài rễ: được đo bằng thước kẻ thẳng. Đối tượng được đặt song song với thước kẻ thẳng, chóp rễ được đặt tương ứng với vạch 0 (cm) của thước, gốc cây chạm tương ứng với vạch nào thì đó sẽ là chiều dài rễ của cây, đơn vị đo là cm. - Khối lượng tươi: được xác định bằng cân kỹ thuật. Bật nút nguồn, điều chỉnh cân cho về đơn vị gam, sau đó đặt mảnh giấy trắng, phang lên bề mặt cân, bấm nút “tare” về không (0) rồi cuối cùng là đặt cây lên mảnh giấy để cân, đơn vị là g (gam). - Khối lượng khô: được xác định bằng cân phân tích, xác định bằng cách làm tương tự như với cân điện tử, đơn vị là g (gam). 2.2.2. Phương pháp phân tích số liệu - Các số liệu được phân tích theo các tham số thống kê gồm giá trị trung bình, độ lệch chuấn ... trên chương trình Excel 2007 [8]. - Sự sai khác giữa các công thức được kiểm định bằng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD với a = 0,05. 3.1. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến chiều cao cây cúc Nhật CN01 in vitro - Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1. Bảng chỉ tiêu chiều cao cây cúc Nhật CN01 in vitro 3 6 N gày 2 -0 n gày 3 0 n gày 4 0 n gày - - T C I 2 3 C I 2 3 C I 2 3 Nước dừa CChiêu cao cây Đ - 2,39 ± a D 0,34 - 2,60 ± 0,46a D - 2,00 ± 0,47bc D - 2,22 ± 0,34ac Đ - 2,50 ± a D 0,35 - 2,50 ± 0,85a D - 2,05 ± 0,79a D - 2,15 ± 0,57a Đ - 3,07 ± a D 0,64 - 3,25+ 0,58ac D - 2,30 ± 0,67b D - 2,60 ± 0,62abd T C 1 2 3 C 1 2 3 C 1 2 3 Nước chiêt từ C Đ N N N Đ N N N Đ N N N mâm ngô Chiêu cao cây 2,40 ± a 0,34 1,80 ± 0,63bd 1,98 ± 0,69ad 2,04 ± 0,27cd 2,50 ± a 0,35 2,07 ± 0,73ad 2,05 ± 0,49bd 1,75 ± 0,35cd 3,07 ± a 0,64 3,50 ± 0,94a 1,65 ± 0,47bd 2,07 ± 0,62cd Nước chiêt từ quả táo CT ĐC TI T2 T3 ĐC TI T2 T3 ĐC TI T2 T3 Chiêu cao cây 2,39 ± a 0,25 2,66 + 0,28ab 2,90 + 0,36a 3,33 ± 0,28ac 2,86 + a 0,12 2,33 ± 0,28b 2,93 + 0,1 la 3,16 ± 0,28a 3,06 + a 0,40 2,93 ± 0,1 la 3,33 ± 0,28a 3,90 ± 0,17b (Chú thích: Trong cùng một cột, ký tự theo nhau khác nhau thế hiện sự sai khác cỏ ỷ nghĩa thông kê) - Nưởc dừa: - Sử dụng nước dừa cho sinh trưởng và phát triển của cây cho hiệu quả tốt hơn so với nuôi cấy cây chỉ trong môi trường MS cơ bản. Hầu hết các mẫu cấy không bị hóa nâu, tốc độ tăng sinh tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Thời - gian đầu sau khi nuôi cấy mẫu tăng sinh chậm, đến ngày thứ 20 tốc độ tăng sinh bắt đầu gia tăng và đến ngày thứ 30 mẫu tiếp tục tăng sinh mạnh. Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cho thấy việc bổ sung 10% (Dl) nước dừa (v/v), 3 7 cho hiệu quả tốt nhất với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây từ 2,60 - 3,25 cm là 25%. - - 40 ngày - Hình 3.1. Sự sinh trưởng của cúc CN01 ở nồng độ nước dừa 10% trong - 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày Nước dừa là dạng phôi nhũ lỏng có chứa nhiều thành phần có nồng độ khác nhau, người ta đã chứng minh được trong nước dừa có chứa zeatin (Letham, 1974) [23]. cấu trúc của zeatin gần giống với kinetin nhưng 3 8 hoạt tính cao hơn khoảng 10 lần. Zeatin có trong nước dừa là một loại cytokinin, chất này làm tăng hoạt động phân chia tế bào trong điều kiện có auxin, giúp gia tăng kích thước tế bào và tổng hợp protein. - Hình 3.2. Chiều cao cúc CN01 được xác định bằng thước kẻ Nước dừa có tác dụng vô cùng hiệu quả đến sinh trưởng của cây ỉn - vitro, tuy nhiên không phải nồng độ nào cũng cho hiệu quả tốt như nhau. Với cúc CN01, nước dừa 20% (D3) lại làm ức chế sự sinh trưởng của cây. - - Hình 3.3. Mau nuôi cấy trong môi Hình 3.4. Mấu nuôi cấy trong môi -- 3 9 - trường nước dừa ử nông nước dừa ử nông độ 10% độ 20% - 20 ngày trường Nước chiết từ mầm ngô: - 20 ngày Sử dụng nước chiết từ mầm ngô cho sinh trưởng và phát triển của cây cho hiệu quả kém hơn so với nuôi cấy cây chỉ trong môi trường MS cơ bản. Hầu hết các mẫu cấy không bị hóa nâu, không bị chết, tuy nhiên xét về màu sắc và hình dáng, cây không được xanh mượt và tốt như nuôi cấy trong môi trường có nước dừa. Tốc độ tăng sinh của cây tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Thời gian đầu sau khi nuôi cấy mẫu tăng sinh nhanh, đến ngày thứ 20 tốc độ tăng sinh bắt đầu tăng chậm lại và đến ngày thứ 40 mẫu giảm tăng sinh nhanh. Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cho thấy việc bố sung 10% (N1) nước mầm ngô (v/v) cây sinh trưởng ổn định, chiều cao cây tăng từ 1,80 - 3,50 cm là 94,4%. - - 40 ngày 4 0 - Hình 3.5. Sự sinh trưởng của cúc CN01 ở nồng độ nước chiết từ mầm ngô 10% trong 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày - Cũng giống như nước dừa, không phải nồng độ nào của nước chiết từ mầm ngô cũng cho hiệu quả cao. Với cúc CN01, nồng độ 20% (N3) lại gây ức chế sự sinh trưởng đối với giống cây này. - - Hình 3.6. Chiều cao cây nuôi cấy trong nước chiết từ mầm ngô ở nồng độ - - 20% - 30 ngày Nước chiết từ quả táo: - Sử dụng nước chiết từ quả táo đối với sinh trưởng và phát triển của cây cho hiệu quả tốt hơn so với nuôi cấy cây chỉ trong môi trường MS cơ bản. Thành phần nước táo có nhiều carbohydrat (pectin...), acid malic, acid quinic và các acid hữu cơ khác; các họp chất thơm; các sinh tố và nguyên tố: K, p, Fe, Zn có vai trò trong sinh trưởng của cây (bảng 3.3). Tuy nhiên, táo khi ép thành nước thường hóa nâu, có thế quan sát bằng mắt được rõ rệt. 4 1 - - Hình 3.7. Môi trường nước chiết từ quả táo có màu nâu - Nguyên nhân đó là do cơ chế chống vi khuấn và nấm của táo. Cơ chế này khiến các tế bào bị ảnh hưởng, chẳng hạn khi ta cắt quả táo, một số enzym trong tế bào được tiếp xúc với oxy. Lúc đó, các enzym phản ứng với oxy tạo ra một lớp oxy hóa cung cấp cơ chế bảo vệ chống lại các vi khuẩn bên ngoài xâm nhập vào quả táo. - Cụ thể hơn, một loại enzyme gọi là polyphenol oxidase (enzyme này còn được gọi là tyrosinase), bao gồm các enzyme monophenol oxidas và catechol oxidase, khi tiếp xúc với oxy sẽ khiến các hợp chat phenolic trong mô táo trở thành các chất ortho-quinon hay "o-quinon". O-quinon chính là chất cung cấp cơ chế bảo vệ táo khỏi các vi khuấn và nấm, vì chúng tạo ra một chất khử trùng tự nhiên. O-quinon không có màu sắc, nhưng chúng có phản ứng với axit amin và oxy, tạo ra melanin, chính vì thế chúng ta thấy phần táo tiếp xúc với không khí bị biến thành màu nâu [36]. - Ket quả cũng cho thấy, về màu sắc và hình dáng của cây, cây không được xanh mượt và tốt như nuôi cấy trong môi trường có nước dừa. Cây có màu xanh 4 2 sẫm hơn, cứng cáp hơn và già hóa cũng nhanh hơn. Tốc độ tăng sinh của cây tỷ lệ thuận với thời gian nuôi cấy. Thời gian đầu sau khi nuôi cấy - mẫu tăng sinh nhanh, đến ngày thứ 20 tốc độ tăng sinh bắt đầu tăng nhanh và đến ngày thứ 40 mẫu giảm tăng sinh, cây có dấu hiệu già hóa. - co - in - - Hình 3.8. Chiều cao cây nuôi cấy trong môi trường nước chiết từ quả táo - ở nồng độ 20% - 30 ngày Công thức 10% (Tl) nước chiết từ quả táo cho hiệu quả thấp nhất (bảng 3.3), với chiều cao trung bình từ 2,66 đến 2,93, tăng 10,15% . Đặc biệt, kết quả thí nghiệm cho thấy việc bố sung 20% (T3) nước chiết từ quả táo (v/v) cây sinh trưởng ốn định, tăng trưởng mạnh. 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến chiều dài rễ cây cúc Nhật CN01 ỉn vitro -Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.2 4 3 - Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu chiều dài rễ cây cúc Nhật CN01 in vitro - Ng - Nước dừa - Nước chiêt từ - Nước chiêt từ ày mâm ngô quả táo CChiêu CChiêu CChiêu dài T dài rê T dài rê T rê 20 Đ2,20 ± Đ2,20 ± Đ2,20+ a a a ngày C 1,4 l C 1,4 l C l,04 D1,30 ± N0,20 ± T0,73 ± a b I 0,82 1 0,42 I 0,25a D1,80 ± N0,05 T0,66 ± 2 0,48a 2 +0,16cb 2 0,35a D1,57 ± N0,05 T0,96 ± 3 0,96a 3 ±0,16db 3 0,25a 30 Đ1,80 ± Đ1,80 + Đ2,50 ± a a ngày C 0,9 l C 0,91“ C 0,50 D3,90 ± N0,40 ± T2,66 ± I 2,10bd 1 0,93bd I 0,28a D4,00 ± N0,53 ± T3,33 ± 2 2,19cd 2 0,84cd 2 0,57ac D1,05 ± N0,0 T4,50 + 3 0,68a 3 3 0,50bc 40 Đ3,49 ± Đ3,49 + Đ3,49 + ngày C 0,62a C 0,62a C 0,50a D5,20 ± N1,90 + T4,93 + b b b I l,68 1 l,37 I 0,12 D3,60 ± N0,30 + T6,10 + 2 0,96a 2 0,42° 2 0,36° D3,70 ± N0,10 + T6,83 + 3 0,58a 3 0,21dc 3 0,28cd - (Chú thích: Trong cùng một cột, ký tự theo nhau khác nhau thê hiện sự sai khác có ỷ nghĩa thống kê) - Nước dừa: -Trong nước dừa có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng chưa xác định, các thành phần dinh dưỡng bổ sung này sẽ giúp thúc đẩy sự tăng trưởng của tế bào. Theo phân tích thành phần dinh dưỡng của tổ chức y tế thế giới (WHO) thì trong nước dừa có chứa protein, hydratecarbon, calcium, sắt và 4 4 - một số vitamine như thiamine, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Mặc dù protein trong nước dừa đã bị loại bỏ do sự kết tủa trong quá trình lưu giữ lâu dài, nhưng các thành phần đa dạng khác của nước dừa đã cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong việc kích thích sự tăng trưởng và nhân số lượng tế bào. Nước dừa ở nồng độ 10% (Dl) và 15% (D2) cũng kích thích sự kéo dài của rễ. - - Hình 3.9. Rễ cúc được nuôi cấy Hình 3.10. Chiều dài rễ cúc CN01 - trong môi trường nước dừa được xác định bằng thước kẻ ở 15% - 30 ngày nước dừa 10% - 30 ngày Nước chiết từ mầm ngô : Zeatin trong ngô có hoạt tính tương tự kinetin. Zeatin tự do ở dạng trans trong phần lớn thành phần thực vật, mặc dù cả 2 dạng cis và trans đều có hoạt tính của cytokinin. Tính chất đặc trưng của cytokinin là kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn đến kích thích sự phân chia tế bào. Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phân hóa cơ quan thực vật. Người ta chứng minh rằng sự cân bằng giữa tỷ lệ auxin (phân hóa rễ) và 4 5 - 4 6 - Cytokinin (phân hóa chồi) có ý nghĩa rất quyết định trong quá trình phát sinh hình thành của mô nuôi cấy ỉn vỉtro cũng như trên cây nguyên vẹn. Neu tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin thì kích thích sự ra rễ, còn tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin thì kích thích ra chồi. Ở trong cây, rễ là cơ quan tổng hợp cytokinin chủ yếu nên rễ phát triển mạnh thì hình thành nhiều cytokinin và kích thích chồi trên mặt đất cũng hình thành nhiều. - không cao. Rễ cây ngắn, to, cứng và có độ giòn cao. - 3.11. Chiều dài rễ nuôi cấy trong nước chiết từ mầm ngô ở nồng độ Hình - Tuy nhiên, nước chiết từ mẩm ngô cho hiệu quả về chiều dài rễ 20% - 30 ngày Nước chiết từ quả táo: - Công thức 20% (T3) nước chiết từ quả táo cho hiệu quả về chiều dài rễ tương đối cao. Chiều dài rễ có sự tăng nhanh và mạnh mẽ sau 20 ngày nuôi cấy với chiều dài trung bình là 0,96cm. Sau 20 ngày tiếp theo (tức ngày thứ 40), chiều dài rễ tăng lên 6,83cm, gấp 7,1 lần. 4 7 ễ-E — o ------^o I_______________________ Hình 3.12. Chiều dài rễ nuôi cấy trong môi trường nước chiết từ quả - táo ở nồng độ 20% - 30 ngày 3.3. Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến hệ số nhân nhanh cây cúc Nhật CN01 in vitro - Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.3 4 8 y - Bảng 3.3. Bảng chỉ tiêu hệ số nhân nhanh cây cúc Nhật CN01 in vitro Ngà - Nước dừa - Nước chiêt từ - Nước chiêt từ T 20 ngày 30 ngày 40 ngày - C I 2 3 C I 2 3 C I 2 3 - C - Hệ sô nhân Đ - 1,0 nhanh ±0,00 D - 1,5 ± 0,70a D - 1,4 ± 0,5la D - 1,4 ± 0,51a Đ - 1,0 ±0,00 D - 1,7 ± 0,82a D - 2,0 ± 0,94a D - 1,3 ± 0,48a Đ - 1,0 ±0,00 D - 1,8+1,03 “ D - 2,0 ± 0,47ab D - 1,4 ± 0,51ac T C 1 2 3 C 1 2 3 C 1 2 3 C Đ N N N Đ N N N Đ N N N mầm ngô - Hệ sô nhân - 1,0 nhanh ±0,00 - 1,2+0,4 2 - 1,0 ±0,00 - 1,1 ±0,31 - 1,0 ±0,00 - 2,2 ± 0,63a - 1,6 ± 0,84a - 1,0 ±0,00 - 1,0 ±0,00 - 2,2 ± 0,78a - 1,9 ± 0,56a - 2,0 ±0,8 r - T C I 2 3 C I 2 3 C I 2 3 C quả táo - Hệ sô Đ - T - T - T - Đ - T - T - T - Đ - T - T - T - nhân 1,0 nhanh ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 1,0 ±0,00 (Chú thích: Trong cùng một cột, ký tự theo nhau khác nhau thê hiện sự sai khác có ỷ nghĩa thống kê) - Bảng 3.3 cho thấy: Nước dừa cho hệ số nhân nhanh tốt hơn so với nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo. Công thức 15% (D2) nước dừa cho hệ số nhân nhanh cao nhất với 2,0 trong 40 ngày. Công thức 10% (Nì) 4 9 - nước chiết từ mầm ngô cho hệ số nhân nhanh là 2,2, cao hơn các công thức còn lại trong 40 ngày. Riêng nước chiết từ quả táo cho hệ số nhân giống thấp, chỉ một chồi trên một cây, làm giảm hiệu quả trong sản xuất cây giống in vitro. Hình 3.13. Hệ số nhân cúc CN01 ở Hình 3.14. Hệ số nhân cúc CN01 ở môi trường nước dừa nồng độ 10% - 30 ngày môi trường nước chiết từ mầm ngô nồng độ 10% - 30 ngày Hình 3.15. Hệ số nhân cúc CN01 ở môi trường nước chiết từ quả táo nồng độ 20% 30 ngày 3.4. Ảnh hưỏng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ỉn vỉtro -Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.4 - Bảng 3.4. Bảng chỉ tiêu khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ỉn vitro - Ng - Nước dừa - Nước chiêt từ - Nước chiêt từ ày mầm ngô quả táo C C C - Khôi - Khôi - Khôi T T T lượng lượng lượng 20 Đ - 0,06 ± Đ - 0,06 ± Đ - 0,06 ± a a a ngày C 0,03 C 0,03 C 0,02+ D - 0,18 ± N - 0,03 ± T - 0,53 I 0,05bd 1 0,03b I 0,05b D 0,14 + N 0,04 + T 0,50 + cd cb abd 2 0,04 2 0,02 2 0,20 D - 0,19 ± N - 0,05 T - 0,30 + 3 0,06d 3 +0,01ab 3 0,03cd 30 Đ - 0,32 + Đ - 0,32 + Đ - 0,32 ± ngày C 0,15“ C 0,15“ C D - 0,35 N - 0,22 + T - 0,09a 0,53 ab I +0,18 1 0,16“ I +0,15ac D - 0,29 + N - 0,09 ± T - 0,50 ± 2 0,17” 2 0,05b 2 0,18ac D - 0,20 ± N - 0,04 + T - 0,61 + 3 0,06cb 3 0,01° 3 0,09bc 40 Đ - 0,69 + Đ - 0,69 ± Đ - 0,69 + a ngày C 0,07а+ C 0,07“ C 0,09 D 0,46 N 0,54 T 0,21 I 0,13b 1 +0,2 lb I ±0,01b D - 0,47 ± N - 0,15 T - 0,42 + 2 0,27cb 2 ±0,05c 2 0,02° D - 0,36 + N - 0,12 ± T - 0,33 + 3 0,16db 3 0,04dc 3 0,03d - (Chú thích: Trong cùng một cột, ký tự theo nhau khác nhau thê hiện sự sai khác có ỷ nghĩa thống kê) -Khối lượng tươi của cây tỉ lệ thuận với tăng sinh của cây, cụ thể là tỉ lệ thuận với chiều cao cây, chiều dài rễ và hệ số nhân nhanh. Cây càng cao, càng mập, hệ số nhiều thì khối lượng của cây đó càng lớn. Do vậy công thức 10% (Dl) nước dừa cho khối lượng tươi cao hơn các công thức còn lại. Với nước - chiết từ mầm ngô, công thức 10% (N1) cũng cho khối lượng tươi lớn hơn công thức 15% (N2) và 20% (N3). Ở môi trường nước chiết từ quả táo, công thức 20% (T3) nước táo cũng cho khối lượng tươi lớn nhất. - - Hình 3.16. Khối lượng tươi cây cúc Hình 3.17. Khối lượng tươi cây - Nhật CN01 ở nước chiết từ quả táo cúc Nhật CN01 ở nước chiết từ - 20% - 40 ngàymầm ngô10% ngày 40 - - Hình 3.18. Khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01 ở môi trường nước dừa 10% - 40 ngày 3.5. Ánh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến khối lượng khô cây cúc Nhật CN01 in vitro - Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.5 y Bảng 3.5. Bảng chỉ tiêu khối lượng khô cây cúc Nhật CN01 ỉn vitro Ngà - Nước dừa - Nước chiêt từ - Nước chiêt từ mầm ngô T 20 ngày 30 ngày 40 ngày - C I 2 3 C I 2 3 C I 2 3 C Đ D D D Đ D D D Đ D D D - Khôi lượng - 0,008 ± khô a 0,002 - 0,053 ± 0,066ad - 0,016 ± 0,005bd - 0,021 ±0,006cd - 0,035 + 0,0 \T+ - 0,033 0,01 la - 0,031 ± 0,018a - 0,025 ± 0,004a - 0,055 a - +0,015 0,049 ± 0,022ac - 0,045 ± 0,015ac - 0,034 + 0,010bc CT ĐC N1 N2 N3 ĐC N1 N2 N3 ĐC N1 N2 N3 - quả táo Khôi lượng 0,008 khô la ±0,00 0,008 ± 0,004a 0,007 ± 0,003a 0,008 ±0,001a 0,035 + 0,0 \T± 0,030 0,014a 0,015 ±0,008btl 0,011 ±0,005cd 0,050 + a 0,015± 0,050 0,024a 0,020 ± 0,008bd 0,010 ±0,006cd CT ĐC TI T2 T3 ĐC TI T2 T3 ĐC TI T2 T3 - Khôi lượng khô - 0,008 la - ±0,00 0,020 ± 0,007a - 0,050 ± 0,005btl - 0,030 ± 0,010cad - 0,030 ± a 0,025+ - 0,030 0,0 \T - 0,040 ± 0,033a - 0,060 ± 0,032a - 0,055 ± a 0,005± - 0,035 0,005bc - 0,095 ± 0,032ac - 0,047 +0,07 lac (Chú thích: Trong cùng một cột, kỵ tự theo nhau khác nhau thê hiện sự sai khác có ỷ nghĩa thong kê) - Cũng giống như khối lượng tươi, khối lượng khô của cây cũng tỷ lệ thuận với tăng sinh của cây. Kết quả cho thấy, công thức 10% (Dl) nước dừa, 10% (N1) nước chiết từ mầm ngô, 20% (T3) nước chiết từ quả táo cho khối lượng khô cao nhất. - - Hình 3.19. Khối lượng khô cúcHình 3.20. Khối lượng khô cúc - CN01 ở môi trường nước chiết CN01 ở môi trường nước dừa - từ mầm ngô 10% - 40 ngày - 40ngày - Song song với thành công trong công tác khảo sát ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tới sinh trưởng của cây cúc CN01, trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi vẫn còn gặp phải một số khó khăn do tình trạng mẫu bị khuẩn, mốc... Nguyên nhân được xác định có thể là do thao tác chưa đúng hoặc điều kiện thời tiết ẩm ướt hoặc dụng cụ, đồ dùng thí nghiệm chưa hoàn toàn đảm bảo... - - Hình 3.21. Mẩu cúc bị nhiễm Hình 3.22. Mau cúc bị mốc sau khuẩn sau 10 ngày nuôi cấy 10 ngày nuôi cấy - -- Hình 3.23. Mầu cúc sạch nhưng bị chết sau 10 ngày nuôi cấy - - Hình 3.24. Mẩu cúc sạch, sống sau 10 ngày nuôi cấy KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 1. Kết luận - Dựa vào những kết quả thu được từ những thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Nước dừa 10% (Dl), nước chiết từ quả táo 20% (T3) có ảnh hưởng tốt đến chiều cao cây cúc Nhật CN01. - Nước dừa 10% (Dl), 15% (D2) và nước chiết từ quả táo 20% (T3) có ảnh hưởng tốt đến chiều dài rễ cây cúc Nhật CN01. - Nước dừa 10% (Dl) có ảnh hưởng tốt đến hệ số nhân nhanh của cây cúc Nhật CN01. - Nước dừa 10% (Dl), nước chiết từ mầm ngô 10% (N1), nước chiết từ quả táo 20% (T3) có ảnh hưởng tốt đến khối lượng tươi cây cúc Nhật CN01. - Nước dừa 10% (Dl), nước chiết từ mầm ngô 10% (N1), nước chiết từ quả táo 20% (T3) có ảnh hưởng tốt đến khối lượng khô cây cúc Nhật CN01. 2. Kiến nghị - Nghiên cứu, tìm ra được nhiều loại dịch chiết tự nhiên từ thực vật để ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật. - TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng việt [1] . Lê Kim Biên, (2007), Thực vật chí Việt Nam 7, Họ Cúc - Asteraceae, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. [2] . Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp. [3] . Lê Hữu Cấn, Nguyễn Xuân Linh. Giao trình hoa, cây cảnh. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2003, trang 81 - 95. [4] . Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc (2003), Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao - Cây hoa Cúc, Nxb Lao động - Xã hội. [5] . Trần Lan Hương, Trần Tuấn Anh, Phạm Thanh Hương (2006), Tìm hiểu về thế giới thực vật, Nxb Giáo dục. [6] . Dương Công Kiên (2003), Nuôi cấy mô thực vật //, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [7] . Nguyễn Thị Kim Lý, Nguyễn Xuân Linh (1999), “Kết quả thực nghiệm trồng một số giống Cúc trong vụ xuân - hè tại Hà Nội”, Tạp chỉ Khoa học Công nghiệp và Quản lý kỉnh tế NNCNTP. [8] . Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong, (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, 12: 179- 216. [9] . Trần Văn Minh (1995), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình Đại học, Viện Đại học mở bán công TP. Hồ Chí Minh. [10] . Hoàng Thị Sản (2006), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục. [11] . Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình công nghệ sinh học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [12] . Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông (2002), Cây hoa cúc và kĩ thuật trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. [13] . Nguyễn Nghĩa Thìn (2006), Thực vật có hoa, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. [14] . Đỗ Năng Vịnh. Công nghệ sinh học cây trồng. NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 2002. [15] . Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục. [16] . Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lí học thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam. 2. Tài liệu nước ngoài [17] . Anderson, N.o. (1987), “Reclassification Chrysanthemum”, Horticultural science, Euphytica, 313-314. of genus [18] . Gamborg, L.; Murashige, T.; Thorpe T.A.; Vasil I.K.; (1968), Plant Tissue Culture Media In vitro, 12: 473 - 478. [19] . Haberlandt, G.; (1902), Culturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitz-Ber. Mat. Nat. Kl. Kais. Akad. Wiss. Wien, 111: 69 - 92. [20] . John M. D., Harold F. w., (1999). Floriculture Principles, prentice Hall, Inc., p.292-303. [21] . Kere Bremer (1994), Asteraceae clasdistic and classification, New York. [22] . Langton, F.A. (1989), “Inheritance in chrysanthemum morifolium Ramaf\ Heredity , 419 - 423. [23] . Letham D. s. (1974) Regulation of cell division in plant tissue. XX. The cỵtokinin of coconut - milk. Physiol. Plant, 27: 66 - 70. [24] . Linh Xuan Nguyen, (1998). Cut Flower Production in ASIA. FAO, Bangkok, Thailand, p.63 - 67. [25] . Linsmainer, E.M. and Skoog, F. (1965), "Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture", Physiol. Plant, 18: 100 - 127. [26] . Murashige T. and Skoog F. (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol. Plant 15: 473 479. [27] - . Narayanaswamy, s. 1994. Plant Cell and Tissue Culture. Tata Me Graw hill Publishing Company Limited New Delhi. [28] . Roger, w. and Alan, H. Cut flower - Astudy of manor markets, International trade, Centre uncdad/WTO. Geneve, 1998, pp. 1- 237. [29] . Takhtajan, A.L. (1987), Sysyema Magnoliophytorum, Leningrad Nauka. 3. Tài liệu internet [30] . http://www.vietcvber.com/forums/archive/index.php/t-l 14935.html [31] . http://nongnghiep.vn/giong-hoa-cuc-cnO 1 -post4466.html [32] . http://www.scirp.org/iournal/PaperDownload.aspx?paperID=50185 [33] . http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-tinh-bot-ngo-49654/ [34] . http://tiennong.vn/Y25/cytokinin.aspx. [35] . http://vi.wikipedia.org/wiki/Cytokinin. [36] . http://khoahoc.tv/khampha/kham-pha/53763 chuyen-mau-nau.aspx. [37] [38] . http://en.wikipedia.org/wiki/Chrysanthemum. . http://www.rauhoaquavietnam.vn. vi-sao-qua-tao-cat-ra-lai- - PHỤ LỤC 1. Thành phần môi trường dinh dưỡng MS (Murashige and Skoog, 1962) - - ST T I - 1 - Các nguyên tố đa lưọng KNO 3 - 2 - - 3 - 4 - 5 - II 1 - NH 4 NO 3 - 1650 MgS0 .7H 2 0 - 370 - 170 - 440 - 6,2 4 4 CaCl .2H 2 0 2 Các nguyên tố vi lượng - H 3 BO 3 - 2 - MnS0 .4H 2 0 - 3 - ZnS0 .4H 2 0 - 4 - KI - 5 - Na Mo0 .2H 2 0 6 - - 7 III - 1900 2 - Nồng độ sử dụng (mg/1) - kh po - - Tên khoa học - 22,3 - 0,83 - 0,25 CuS0 .5H 2 0 4 - 0,025 - CoC1 .6H 2 0 - 0,025 - Các vitamin Nicotinic acid - 0,5 4 4 2 4 2 8,6 - - 1 - 2 - Thiamin - 0,5 - 3 - Pyridoxin 0,5 - 4 - Glycine - - 5 - Inositol - 100 - - 2,0 IV - NaFeEDTA - 1 - Na 2 - EDTA - 37,3 - 2 - FeS0 .7H 2 0 - 27,8 4 - - [...]... Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến chiều dài rễ cây hoa cúc Nhật CN01 in vỉtro - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến hệ số nhân nhanh của cây hoa cúc Nhật CN01 in vitro - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến khối lượng tươi của cây hoa cúc Nhật ỉn vỉtro 1 2 - Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết. .. Nhật CN01 (Chrysanthemum maxỉmum Seỉun - 3) in vỉtro ” 2 Mục đích và nhỉệm yụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cún - So sánh và đánh giá hiệu quả kích thích sinh trưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây cúc Nhật CN01 2.2 - Nhiệm vụ nghiên cứu Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến chiều cao cây hoa cúc Nhật CN01 in vỉtro... 1: Ảnh hưởng của nước dừa đến sinh trưởng của cây cúc Nhật - Bảng 2.1 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước dừa đến sinh - trưởng cây hoa cúc Nhật - Công thức - Nông độ (%) (v/v) - ĐC - 0,0 - DI - 10 3 4 - D2 - 15 - D3 - 20 - *Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nước chiết từ mầm ngô đến sinh trưởng của cây hoa cúc Nhật - Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước chiết từ mầm ngô đến sinh trưởng. .. dừa, nước chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo đến khối lượng khô cây hoa cúc Nhật in vitro 3 Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp tư liệu khoa học cho tìm hiểu và nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch thu từ tự nhiên đến sinh trưởng của hoa cúc Nhật CN01 bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật - Góp phần tìm ra loại dịch tự nhiên có hiệu quả tốt đối với quá trình sinh trưởng của cây in vitro - NỘIDUNG... thí nghiệm ảnh hưởng của nước chiết từ mầm ngô đến sinh trưởng cây hoa cúc Nhật - Công thức - Nông độ (%)(v/v) - ĐC - 0,0 - N1 - 10 - N2 - 15 - N3 - 20 - *Thí nghiệm 3: Ánh hưởng của nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng của cây hoa cúc Nhật - Bảng 2.3 Các công thức thí nghiệm ảnh hưởng của nước chiết từ quả táo đến sinh trưởng cây hoa cúc Nhật - Công thức - Nông độ (%)(v/v) - ĐC - 0,0 - TI - 10 - T2... quả sinh trưởng cây giống in vitro Cây giống sinh trưởng nhanh, mạnh cho năng suất cao, phần nào đáp ứng được nhu cầu sản xuất hiện nay - Tuy nhiên, việc nâng cao năng suất và chất lượng giống cúc này vẫn đang gặp rất nhiều khó khăn trong công tác sản xuất Do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Anh hưởng của nước dừay nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến sinh trường của cây hoa cúc Nhật. .. LSD với a = 0,05 3.1 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nước dừa, nước chiết từ mầm ngô và nước chiết từ quả táo đến chiều cao cây cúc Nhật CN01 in vitro - Sau 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu nhận đánh giá kết quả các công thức thí nghiệm và trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Bảng chỉ tiêu chiều cao cây cúc Nhật CN01 in vitro 3 6 ... Hình 2.1 Mẩu cúc CN01 (Chrysanthmum maximum Seiun - 3) vô trùng 3 1 2.1.2 Chuẩn bị nước dừa, nưởc chiết từ mầm ngô, nước chiết từ quả táo cho nuôi cấy in vitro - Nước dừa: Là chất lỏng, trong, chứa trong quả dừa Khi quả dừa già đi, nước dừa được thay thế bởi cùi dừa và không khí Quả dừa non chứa rất ít cùi dừa, và lóp cùi này mỏng, rất mềm và khá trong Chứng tỏ việc sử dụng nước dừa từ quả bánh tẻ đã... nhiên phức tạp: nước dừa, nước chiết từ quả táo, nước chiết từ mầm ngô, dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein, cũng được sử dụng trong nuôi cấy in vỉtro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đấy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất... phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng [16] - Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng, có sinh khối lớn và bộ lá to, do vậy cũng chịu hạn kém Ánh sáng có sự ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây hoa cúc Tuy nhiên, ở mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triến cây có yêu cầu ánh sáng khác nhau: - + Thời kỳ cây con: khi mới ra rễ cây