Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa cúc nhật CN01

... ứng tạo mô sẹo từ đốt thân non hoa Cúc nhật CN01 - Cảm ứng tạo mô sẹo từ non hoa Cúc nhật CN01 - Tạo dòng huyền phù tế bào cụm tế bào hoa Cúc nhật CN01 - Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù tế. .. ứng tạo mô sẹo từ non hoa Cúc nhật CN01 3.2 TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 Nhằm mục tiêu chủ động nhân nhanh sinh khối tế bào, nhu cầu nuôi cấy mô sẹo nhƣ dịch huyền phù hoa Cúc. .. mô sẹo từ mẫu đốt thân non hoa Cúc nhật CN01 29 3.2 TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 36 3.3 TÁI SINH CHỒI TỪ DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ CHỨA TẾ BÀO VÀ CỤM TẾ BÀO 38 KẾT LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN  NGUYỄN THỊ LINH TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học ThS . PHẠM THỊ KIM DUNG HÀ NỘI – 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN  NGUYỄN THỊ LINH TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học PGS.TS. LÊ VĂN SƠN Viện Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn khoa học ThS . PHẠM THỊ KIM DUNG HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS. TS. Lê Văn Sơn - Viện Công nghệ Sinh học đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Sƣ phạm (ĐHSP) Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành khóa luận này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của thầy La Việt Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành khóa luận, nhân đây tôi xin gửi lời cảm ơn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật - trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những ngƣời thân và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian em học tập cũng nhƣ hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do PGS. TS. Lê Văn Sơn hƣớng dẫn và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác. Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Linh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 - D 2,4 - Dichlorophenoxy acetic aicd Agar Thạch BAP 6 - benzyl amino purin CT Công thức ĐC Đối chứng IAA β - indole - acetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 NAA α - Napthalene acelic acid Nxb Nhà xuất bản Ki Kinetin DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 ......................................................................................... 23 Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 ....................................................................................................... 25 Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 ......................................................................................................................... 27 Bảng 2.4: Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào) ...................................................................................................... 28 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của sự kết hợp một số chất điều hòa sinh trƣởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3 tuần nuôi cấy ................................................................................................................... 31 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của sự kết hợp của một số chất điều hòa sinh trƣởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 5 tuần nuôi cấy ................................................................................................................... 33 Bảng 3.3. Sự phát sinh hình thái của tế bào, cụm tế bào sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trƣờng khác nhau ........................................................................ 39 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh hƣởng của một số chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3 tuần nuôi cấy ................................................................................................................... 30 Hình 3.2. Một số hình ảnh mô sẹo đƣợc tạo thành ở môi trƣờng BAP 0,7 + NAA 0,1 sau 5 tuần nuôi cấy .......................................................................... 32 Hình 3.3. Mô sẹo hóa nâu sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng BAP 0,7 + NAA 0,1 .......................................................................................................... 32 Hình 3.4. Một số hình ảnh trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây hoa Cúc nhật CN01 ......................................................................................... 36 Hình 3.5. Một số hình ảnh trong quá trình nuôi cấy huyền phù tế bào cây hoa Cúc nhật CN01 ................................................................................................ 38 Hình 3.6. Các giai đoạn phát sinh phôi của cây hoa Cúc nhật CN01 ............. 41 Hình 3.7. Chồi non dần đƣợc hình thành từ phôi trƣởng thành ...................... 42 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................ 2 2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................. 2 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2 NỘI DUNG ....................................................................................................... 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. NGUỒN GỐC, VỊ TRÍ, PHÂN LOẠI, GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA HOA CÚC............................................................................. 3 1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ YÊU CẦU SINH THÁI CỦA CÂY HOA CÚC ......................................................................................................... 7 1.2.1. Đặc điểm thực vật học............................................................................. 7 1.2.2. Yêu cầu sinh thái của cây hoa Cúc ......................................................... 8 1.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT, PHÁT TRIỂN HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM ............................................................................................. 9 1.3.1. Tình hình sản xuất, phát triển hoa Cúc trên thế giới ............................... 9 1.3.2. Tình hình sản xuất, phát triển hoa Cúc ở Việt Nam ............................. 10 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM................................................................................................................ 10 1.4.1. Tình hình nghiên cứu hoa Cúc trên thế giới ......................................... 10 1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa Cúc ở Việt Nam .......................................... 11 1.5. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT .............................................................................................................. 12 1.5.1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nuôi cấy in vitro) .................................. 12 1.5.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 12 1.5.1.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật .......................... 13 1.5.1.3. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro ........................................... 13 1.5.1.4. Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro ................................ 14 1.5.2. Ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong sản xuất ..................................... 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 20 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 20 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ......................................... 21 2.3. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM .............................................. 21 2.3.1. Dụng cụ thí nghiệm ............................................................................... 21 2.3.2. Thiết bị .................................................................................................. 22 2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................. 22 2.5. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ......................................................................... 22 2.6. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 23 * Thí nghiệm 1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non và mẫu lá non cây hoa Cúc CN01 ................................................................................................. 23 * Thí nghiệm 2: Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01……...26 * Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào)..27 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 29 3.1. CẢM ỨNG TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU ĐỐT THÂN NON VÀ MẪU LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 ............................................................. 29 3.1.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 ..... 29 3.2. TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 .. 36 3.3. TÁI SINH CHỒI TỪ DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ CHỨA TẾ BÀO VÀ CỤM TẾ BÀO ................................................................................................ 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 44 MỞ ĐẦU 1.Lí do chọn đề tài Thiên nhiên đã ban tặng cho con ngƣời chúng ta, từ rất lâu rồi, các loài hoa với đủ hƣơng thơm màu sắc, tạo nên cuộc sống muôn màu và đầy hấp dẫn. Nét đẹp của các loài hoa hẳn không ai trong chúng ta có thể phủ nhận về màu sắc kết, cấu hoa, hƣơng thơm độ bền và cái hồn của hoa. Cái đẹp của hoa hấp dẫn tâm hồn ngƣời chơi hoa và cái giá trị kinh tế của hoa đã thu hút những ngƣời trồng hoa phải say mê tới nó. Và trồng hoa đã trở thành một lĩnh vực trong nông nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao, bởi khi cuộc sống vật chất đƣợc thoả mãn thì nhu cầu về hoa lại càng cao hơn bao giờ hết. Trên thế giới thì thị trƣờng tiêu thụ hoa hết sức rộng lớn nhƣng tập trung chủ yếu ở những nƣớc công nghiệp phát triển nhƣ: Anh, Pháp, Hà Lan, Đức, Thụy Điển, Ý, Nhật. Ở Việt Nam, với sự chuyển đổi cơ cấu cây trồng từ mô hình trồng lúa sang trồng hoa đã đem lại hiệu quả kinh tế cao. Trong những năm gần đây, ngành trồng hoa mới thực khởi sắc, dành đƣợc sự quan tâm đầu tƣ của nhiều công ty lớn trong cũng nhƣ ngoài nƣớc. Ngành sản xuất và kinh doanh hoa đƣợc đặc biệt quan tâm, hoa không chỉ dùng vào các dịp lễ tết mà còn thƣờng xuyên có mặt trong đời sống hàng ngày của mỗi ngƣời dân đặc biệt là ở các thành phố lớn. Hiện nay, có nhiều loại hoa đƣợc trồng nhƣng hoa Cúc là một trong những loại hoa đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và trồng phổ biến nhất ở Việt Nam. Khi nói đến hoa, ngƣời Việt Nam không chỉ nói đến hoa Cúc (Chrysanthemum sp.)vì hoa Cúc đƣợc đánh giá là loài hoa có giá trị kinh tế cao, nhu cầu lớn bởi chúng không chỉ hấp dẫn ngƣời tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thơm kín đáo mà còn thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặc trƣng rất bền, có thể vận chuyển đi xa phục vụ cho nhu cầu trong nƣớc và xuất khẩu. Giống cúc CN01 do Viện Di truyền Nông nghiệp nhập nội 1 từ Nhật Bản, khảo nghiệm và sản xuất thử trong 5 năm qua tại các tỉnh phía Bắc đáp ứng đƣợc các tiêu chí đó. Với các ƣu thế trên, hoa cúc đang đƣợc các nhà trồng hoa chú trọng đầu tƣ và phát triển. Có nhiều phƣơng pháp nhân giống: Gieo hạt, tách cây con từ rễ, giâm ngọn, nuôi cấy mô. Trong đó, phƣơng pháp nuôi cấy mô tỏ ra ƣu việt hơn hẳn bởi: Tạo cây con sạch bệnh, cung cấp một lƣợng cây con lớn trong một thời gian ngắn. Kỹ thuật nhân giống thông qua tạo dòng huyền phù tế bào đáp ứng đƣợc các yêu cầu số lƣợng và chất lƣợng cây con giống. Do đó, tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01”. 2. Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1. Mục đích nghiên cứu Tạo dòng tế bào huyền phù góp phần nhân nhanh cây con giống hoa Cúc nhật CN01 đáp ứng nhu cầu trong và ngoài nƣớc. 2.2. Nhiệm vụ nghiên cứu - Cảm ứng tạo mô sẹo từ đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01. - Cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây hoa Cúc nhật CN01 . - Tạo dòng huyền phù tế bào và cụm tế bào cây hoa Cúc nhật CN01. - Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù tế bào và cụm tế bào cây hoa Cúc nhật CN01. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. - Ý nghĩa khoa học: + Cung cấp tƣ liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu góp phần xây dựng quy trình sản xuất nhanh cây con giống hoa Cúc nhật CN01 với số lƣợng lớn đáp ứng nhu cầu trong và ngoài nƣớc. 2 NỘI DUNG CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGUỒN GỐC, VỊ TRÍ, PHÂN LOẠI, GIÁ TRỊ KINH TẾ VÀ GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA HOA CÚC Cây hoa Cúc có tên khoa học là (Chrysanthemum sp.) đƣợc định nghĩa từ Chrysos (vàng) và Anthemom (hoa) bởi Linneaus năm 1953, có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nƣớc Châu Âu. Chen (1985) đã chứng minh rằng Cúc đã đƣợc trồng ở Trung Quốc từ 500 năm trƣớc công nguyên [13]. Lịch sử phát triển nghề trồng Cúc ở Châu Âu muộn hơn so với Trung Quốc. Năm 1843, nhà thực vật học Fortune (ngƣời Anh) đến Trung Quốc để khảo sát và mang về Anh Quốc giống hoa Cúc Chusan Daisy. Giống này chính là giống bố mẹ của giống hoa Cúc hình Cầu và hình Tán xạ ngày nay. Năm 1789, nƣớc Pháp nhập từ Trung Quốc về 3 giống hoa Cúc đại đóa về trồng và đến năm 1827, Bernet đã thành công trong việc tạo ra một số giống Cúc mới bằng phƣơng pháp lai. Từ đó dẫn đến sự cải tiến rất mạnh mẽ về giống Cúc ở Châu Âu [11]. Ngày nay, Cúc đã đƣợc trồng hầu khắp các nƣớc trên thế giới nhƣ: Hà Lan, Ý, Đức, Pháp, Nhật Bản. Ở Việt Nam, hoa Cúc đã đƣợc trồng từ lâu đời, ngƣời Việt Nam coi hoa Cúc là biểu tƣợng của sự thanh cao, là một trong bốn loại thảo mộc đƣợc xếp vào hàng tứ quý "Tùng-Cúc-Trúc-Mai" hoặc "MaiLan-Cúc-Trúc". Trong hệ thống phân loại thực vật, Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1978) [2],đã xếp hoa Cúc vào lớp hai lá mầm (Dicotyledonae), phân lớp Cúc (Asterydae), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae), phân họ giống hoa Cúc (Asteroidae), chi Cúc (Chrysanthemum). 3 Họ Cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), thực vật hạt kín (Angniospermatophyta) [23]. Qua hai hội thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên "Sinh học và hóa học của họ Cúc" đã có sự thống nhất tƣơng đối về hệ thống học của họ Asteraceae. Họ Cúc trên thế giới đƣợc xếp trong 2 phân họ, 13 tông [17],Việt Nam có 2 phân họ và 12 tông, nhƣng hiện tại chia làm 17 tông. Họ Cúc có khoảng 1550 với 23000 loài [1], [10], [23]. Tuy nhiên, có tài liệu khác nhau về số liệu loài hoa Cúc. Theo tác giả Nguyễn Nghĩa Thìn thì họ cúc có 2500 loài và có 1100 chi [10].Theo Trần Lan Hƣơng và cộng sự, hoa Cúc có hơn 3000 loài với kích thƣớc và màu sắc khác nhau[4]. Nghiên cứu của Anderson (1987), Langton (1989) cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống Cúc đã đƣợc đƣa vào sử dụng với sự đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc [12], [20]. Năm 1984, khi nghiên cứu phân loại họ Cúc cho thấy chỉ riêng chi Chrysanthemum. L (Đại Cúc) ở Việt Nam đã có 5 loài và toàn bộ những giống Cúc trồng ra hoa làm cảnh đều nhập từ nƣớc ngoài vào. Nếu muốn làm cảnh hoặc mang sắc thái riêng của Việt Nam thì nên đƣa những loài Cúc hoang dại có hoa đẹp về trồng, có thể thuần hóa hai loài C.cirsium japonicum (Đại kế), với cụm hoa to, rất bền, màu hồng tƣơi và C.plucheapolygonata(Lúc râm), cây cao, đƣờng kính bông lớn, cánh hoa và vòi nhụy đều có màu hồng rất đẹp [1]. Năm 1993, Trần Hợp đã phân loại cây hoa Cúc thuộc nhóm cây thân thảo, có hoa làm cảnh và cũng đƣa ra một số cây Cúc trồng ở Việt Nam nhƣ cây Tần ô (Rau Cúc - C.coronariu Linn), cây Cúc trắng (C.molifolium), cây Cúc vàng (Kim Cúc - C.indicum Linn) và Cúc Trừ trùng (C.cinerariaefolium vis) [3]. 4 Cúc có rất nhiều giống, nhƣng đến nay việc phân loại vẫn chƣa thống nhất. Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) [6], đã dựa vào 3 cách sau để phân loại Cúc: 1. Dựa vào hình dáng hoa để phân loại Cúc đơn hay kép: + Cúc đơn: hoa thƣờng nhỏ từ 2-5cm,chỉ có từ 1-3 hàng cánh ở vòng ngoài cùng, còn những vòng trong là những cánh hoa rất nhỏ thƣờng đƣợc gọi là cồi hoa nhƣ chi Thơm vàng, chi Đà Lạt. + Cúc kép: hoa thƣờng to, đƣờng kính có thể hơn 10 cm, cũng có thể nhỏ hơn 5 cm nhƣng hoa có rất nhiều vòng cánh sếp xít nhau. Cánh hoa cũng rất phong phú, có loại cánh dài, cong nhƣ Cúc đại đóa, cũng có loại cánh ngắn đều nhƣ các giống CN01, CN93, CN98, cũng có loại cánh nhọn, dài, xếp chặt nhƣ Tua vàng. 2. Dựa vào hình thức nhân giống: bao gồm nhân giống bằng phƣơng pháp vô tính nhƣ tỉa chồi, giâm cành và nhân giống bằng phƣơng pháp hữu tính đó là hình thức sử dụng hạt để gieo. 3. Dựa vào thời vụ trồng: sử dụng thời vụ trồng để phân loại thực chất là sử dụng phản ứng của cây đối với điều kiện nhiệt độ, đặc biệt là điều kiện chiếu sáng đến khả năng ra hoa của cây để phân loại. + Cúc trồng vụ Hè - Thu hoặc Xuân - Hè: là những giống có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ tƣơng đối cao, sinh trƣởng phát triển tốt và cho hoa trong điều kiện ngày dài nhƣ giống CN01, CN93, CN98. + Cúc trồng vụ Thu - Đông và Đông - Xuân: là những giống có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ thấp, cây chỉ ra hoa trong điều kiện ngày ngắn. Đa phần các giống Cúc hiện trồng có khả năng sinh trƣởng phát triển và ra hoa trong điều kiện vụ Thu - Đông và Đông - Xuân. Nghiên cứu về thị trƣờng hoa trên thế giới, Woolman (1989) [25],đã cho thấy Cúc là một trong những loài hoa trồng phổ biến nhất và đƣợc sử 5 dụng rất đa dạng, vừa là hoa cắt vừa là hoa chậu, vừa trồng trong nhà kính, vừa trồng cả ngoài vƣờn, dùng để trang trí và một vài công dụng khác nhƣ là thực phẩm (rau ăn), là nguồn sản xuất dƣợc liệu hoặc thuốc trừ sâu. Cúc còn đƣợc sử dụng để chiết tinh dầu thơm, pha chè ngâm rƣợu nhƣ: Cúc chi, dùng làm thuốc trừ sâu nhƣ: Cúc trừ trùng. Đối với ngành y dƣợc một số loài nhƣ: Kim cúc, Bạch Cúc còn có tác dụng chữa bệnh đau đầu, hoa mắt. Ngoài việc phục vụ cho các nhu cầu giải trí thƣởng thức cái đẹp của con ngƣời, hoa Cúc đồng thời là nguồn lợi kinh tế quan trọng. Thực tế cho thấy việc sản xuất kinh doanh hoa Cúc cho phép ngƣời trồng hoa thu đƣợc nhiều lợi nhuận trên mỗi đồng vốn đầu tƣ. Trên một sào đất trồng hoa Cúc với mật độ trung bình 40 -45 cây/m2 có thể thu nhập 4,0-5,0 triệu đồng (mức giá trung bình trên thị trƣờng từ 500 - 700 đồng/bông) kể cả chi phí cho làm đất, chăm sóc, vật tƣ ban đầu chỉ mất từ 2,0 - 3,0 triệu đồng tiền vốn. Với lợi ích kinh tế nhƣ vậy nên hiện nay cùng với hoa Hồng, Đồng tiền, Lily thì Cúc là loài hoa cắt chủ lực đƣợc trồng rộng rãi khắp tất cả các vùng trong cả nƣớc, đặc biệt là các vùng sản xuất hoa nhƣ Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng, TP. Hồ Chí Minh.... 6 1.2. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ YÊU CẦU SINH THÁI CỦA CÂY HOA CÚC 1.2.1. Đặc điểm thực vật học - Rễ: Thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang phân bố ở tầng đất mặt từ 5-20cm, số lƣợng rễ lớn nên có khả năng hút nƣớc và dinh dƣỡng mạnh. - Thân: Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm giàn để đỡ cây khỏi đổ. - Lá: Thƣờng là lá đơn, mỗi giống Cúc có đặc điểm khác nhau: hình dạng lá xẻ thùy nông hay sâu, phiến lá dày hay mỏng và màu sắc là khác nhau. - Hoa: Hoa Cúc chủ yếu có 2 dạng: + Hoa lƣỡng tính (có cả nhị đực và nhị cái) + Hoa đơn tính (chỉ có nhị đực hoặc nhị cái) Hoa Cúc chính gồm nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa. Tùy theo mục đích sử dụng mà có thể để một bông hay nhiều bông trên cành. Tùy theo cách sắp xếp cánh hoa mà ngƣời ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp/bông) và hoa đơn (chỉ có một vòng hoa/bông). Hiện nay ngƣời ta sử dụng loại hoa kép là chủ yếu. Hoa kép nhiều hơn hoa đơn và thƣờng mọc nhiều hoa trên một cành phát sinh từ nách lá. Hoa có nhiều màu sắc khác nhau (trắng, vàng, đỏ, tím, xanh…). Những cánh hoa ở phía ngoài thƣờng có màu sắc đậm hơn xếp thành nhiều tầng, sẽ chặt hay lỏng tùy theo từng giống. Cánh có nhiều hình dáng khác nhau, cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn đều, có loại dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. Đƣờng kính bông hoa phụ thuộc vào giống: + Giống hoa to: Đƣờng kính 10-12cm (Pha lê, Đại Đóa…) 7 + Giống hoa trung bình: Đƣờng kính 5-7cm (Thọ đỏ, Đỏ nhung…) + Giống hoa nhỏ: Đƣờng kính 1 -2 cm (Chi trắng, Chi vàng…). 1.2.2. Yêu cầu sinh thái của cây hoa Cúc - Nhiệt độ Đối với các giống Cúc Đại Đóa, Pha Lê ƣa khí hậu mát mẻ (thích hợp vụ đông): nhiệt độ từ 20-250C. - Ánh sáng Ánh sáng có sự ảnh hƣởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây hoa Cúc. Tuy nhiên ở mỗi thời kỳ sinh trƣởng và phát triển cây có yêu cầu ánh sáng khác nhau: + Thời kỳ cây con: Khi mới ra rễ cây cần ít ánh sáng vì lúc này cây non còn sử dụng các chất dinh dƣỡng dự trữ. + Thời kỳ chuẩn bị phân cành: Cây cần nhiều ánh sáng để quang hợp tạo các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của cây. Cúc đƣợc xếp vào loại cây ngày ngắn: thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng trên ngày với nhiệt độ là 20-250C. Thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trƣởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lƣợng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm: cây ngắn, chất lƣợng hoa kém. - Ẩm độ Độ ẩm thích hợp nhất cho cây sinh trƣởng phát triển là độ ẩm đất 6070%, độ ẩm không khí 60-65%. Nếu độ ẩm trên dƣới 80% cây sinh trƣởng mạnh nhƣng dễ phát sinh sâu bệnh làm ảnh hƣởng năng suất, chất lƣợng hoa. - Các chất dinh dưỡng Các yếu tố N, P, K và vi lƣợng nhƣ Ca, Mg, Mn có vai trò quan trọng đối với sinh trƣởng và phát triển, năng suất phẩm chất các loài hoa. 8 + Đạm (N): Có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh trƣởng của Cúc và ảnh hƣởng đến thời kỳ phát triển. Thiếu đạm cây cằn cỗi, lá úa vàng, hoa nhỏ xấu. Nếu thừa đạm cây sinh trƣởng mạnh, thân mập, lá xoăn dày, giòn, cành nhánh nhiều có thể không ra hoa đƣợc. Cây Cúc cần nhiều đạm trong ra đoạn phát triển sinh trƣởng sinh dƣỡng. + Lân (P): Có tác dụng làm cho bộ rễ phát triển mạnh, thân cứng, hoa bền, màu sắc đẹp, nhanh ra hoa, giúp cây hút nhiều đạm và tăng khả năng chống rét cho cây. Thiếu lân, bộ rễ phát triển kém, cành nhánh ít, hoa chóng tàn, màu nhợt nhạt, hoa ra muộn. + Kali (K): Giúp cho cây tổng hợp, vận chuyển các chất đƣờng bột trong cây, giúp cây chịu hạn, chịu rét, chống chịu sâu bệnh. Thiếu K màu sắc hoa không tƣơi thắm, mau tàn. Cúc cần K nhiều nhất vào thời kỳ phân hóa mầm hoa. Các nguyên tố vi lƣợng: Cây cần ít nhƣng không thể thiếu và không thể dƣ nhƣ: Ca, Mg, B, Mn… Thiếu các nguyên tố vi lƣợng này thì lá sẽ bị vàng làm ảnh hƣởng tới quá trình quang hợp, màu sắc hoa sẽ bị nhợt nhạt… 1.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT, PHÁT TRIỂN HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.3.1.Tình hình sản xuất, phát triển hoa Cúc trên thế giới Hoa Cúc ngày nay là một trong những loại hoa thời vụ phổ biến nhất trên thế giới và đƣợc ƣa chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc, hình dáng hoa và hơn thế nữa ngƣời ta có thể chủ động điều khiển của cây để tạo nên nguồn sản phẩm hàng hóa liên tục và ổn định quanh năm. Theo Yahel và Tsukamoyo (1985) [26], bốn nhà sản xuất chính là Hà Lan 800 triệu cành Cúc mỗi năm, Colombia 600 triệu cành, tiếp theo là Ý là 500 triệu cành và liên bang Mỹ 300 triệu cành. Quốc gia dẫn đầu là Hà Lan phục vụ cho thị trƣờng tiêu thụ rộng lớn gồm 80 nƣớc trên thế giới. Có thể nói 9 Hà Lan là một trong những nƣớc sản xuất hoa Cúc lớn nhất trên thề giới và nhân tố góp phần tạo nên thành công này là đã sử dụng công nghệ nhân giống in vitro để sản xuất cây con giống khỏe, sạch bệnh vàhoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. 1.3.2. Tình hình sản xuất, phát triển hoa Cúc ở Việt Nam Hoa Cúc là một trong năm loại hoa chính đƣợc trồng ở Việt Nam. Hoa Cúc có mặt ở mọi nơi, từ vùng cao đến đồng bằng, từ thành thị đến nông thôn. Tuy nhiên vùng sản xuất chính tập trung ở các thành phố: Hà Nội, Hải Phòng, Huế, Nha Trang, TP. Hồ Chí Minh và Lâm Đồng. Trong đó Đà Lạt là nơi lý tƣởng cho việc sinh trƣởng và phát triển của hầu hết các loại Cúc, diện tích trồng cúc chiếm khoảng 30% diện tích trồng vùng này. Đặc biệt tại đây có công ty hoa Hasfarm của Hà Lan là nơi sản xuất hoa chất lƣợng cao nhằm xuất khẩu. Rõ ràng hoa Cúc đang là một trong những cây trồng có ý nghĩa quan trọng đối với nghề trồng hoa, đã và đang trở thành đối tƣợng đƣợc các nhà nghiên cứu và sản xuất trong và ngoài nƣớc rất quan tâm. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 1.4.1. Tình hình nghiên cứu hoa Cúc trên thế giới Một trong những nhân tố tạo nên sự thành công cho ngành sản xuất hoa Cúc của một số nƣớc trên thế giới là đã sử dụng công nghệ nhân giống in vitro để sản xuất cây con giống. Ngoài chồi đỉnh các nhà nghiên cứ đã sử dụng các bộ phận khác của cây hoa Cúc để nuôi cấy nhƣ đoạn thân, mẫu lá, cánh hoa. Năm 1952, lần đầu tiên tại Pháp, Morell và Martin đã tạo đƣợc hoa Cúc sạch bệnh nhờ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh, cũng theo phƣơng pháp này Mori (1971), Asatani (1972) và Paludan (1974)đã thu đƣợc những giống sạch virut B, Veinmottle, Stunt và Complex viuses (Horst, 1990) [16]. 10 Việc sử dụng đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy in vitro cũng đƣợc thực hiện thành công bởi Sussex (1989) [22], kết quả thí nghiệm cho thấy, phƣơng pháp tối ƣu để mẫu có tỷ lệ sống sót và tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là bảo quản chồi đỉnh Cúc trƣớc nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần từ 0,20C đến 40C với 10% Dimethyl sulfoxide và 3% Glucose, có nhiều giống đã đạt các tỷ lệ này tới 100%. Năm 1990, Kenneth và Torres [18], đã nuôi cấy thành công từ giai đoạn thân và lá của giống hoa Cúc màu tím trên môi trƣờng MS. Tỷ lệ hình thành chồi đạt 100% và trung bình các cây đƣợc nuôi cấy mô này sau 3-4 tháng là ra hoa. Để hoàn thiện quy trình Nuôi cấy mô hoa Cúc, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng là đƣa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng. Năm 1990, Robert và Smith [21], đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm Cellulose sorbarods trong môi trƣờng nuôi cấy dạng lỏng đã làm giảm bớt thiệt hại trong quá trình đƣa cây ra ngoài và cho vào 1 lít môi trƣờng ra rễ dạng lỏng 0,5 - 4 mg Paclobutrazol thì sẽ giảm đƣợc độ héo của cây khi ra ngoài sản xuất làm thân ngắn hơn, rễ to nhiều và tăng diệp lục trên 1 đơn vị diện tích lá. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu hoa Cúc ở Việt Nam Cây hoa Cúc đã đƣợc nhập nội vào nƣớc ta từ lâu nhƣng phải đến sau những năm 1990, tức là sau kinh tế bao cấp đổi mới sang kinh tế thị trƣờng thì nghề trồng hoa nói chung và nghề trồng hoa Cúc nôi riêng mới bắt đầu có những bƣớc phát triển đáng kể. Chính vì vậy, các nghiên cứu về cây hoa Cúc ở Việt Nam còn ít. Cây hoa Cúc ở Việt Nam chủ yếu tập trung nghiên cứu về lĩnh vực phân loại, thu thập và đánh giá nguồn gen, các biện pháp kỹ thuật sử dụng nhằm nâng cao năng suất và chất lƣợng trong sản xuất hoa Cúc. Nghiên cứu cơ bản về cây hoa Cúc đã đƣợc tiến hành ở Việt Nam từ trƣớc những năm 1975. Theo kết quả điều tra phân loại cây cỏ ở Việt Nam đã 11 kết luận, họ Cúc ở Việt Nam rất phong phú, có nhiều chi. Ở Việt Nam có khoảng 75 chi với 199 loài (trong khi đó có nhiều giống đƣợc nhập trồng nhƣng chƣa đƣợc mô tả), trong khi đó trên thế giới có khoảng 1000 chi và có trên 20.000 loài [2]. Năm 1988, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1988) [9], đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống Cúc đang đƣợc trồng phổ biến ở miền Bắc nƣớc ta nhƣ Cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà Lan. Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1988) [9], để nâng cao tỷ lệ sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sử dụng IBA hoặc NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành khoảng 0,5 - 1 cm và dung dịch thuốc từ 3 - 5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát. Công nghệ nhân giống in vitro trong thời gian gần đây đã phát triển khá mạnh. Bắt đầu từ năm 1992 Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp với Bộ môn Nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa Cúc bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Đến nay đã có khá nhiều công trình nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đƣợc công bố và một số đã đƣợc đƣa vào ứng dụng trong thực tiễn trên nhữngđối tƣợng nhƣ: hoa Đồng tiền, hoa Ly ly, Trinh nữ hoàng cung,... 1.5. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT 1.5.1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật (Nuôi cấy in vitro) 1.5.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Có rất nhiều tác giả định nghĩa về nuôi cấy mô tế bào thực vật. Theo Hoàng Minh Tấn và cộng sự [8], đã định nghĩa về nuôi cấy mô tế bào thực vật nhƣ sau: 12 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực của công nghệ sinh học thực vật. Dựa trên tính toàn năng của tế bào và khả năng phân hóa và phản phân hóa của chúng mà ngƣời ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mô nào đấy. 1.5.1.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật * Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902, Haberlandt (Đức) [15], là ngƣời đầu tiên đề xƣớng học thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời". Theo ông: "Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh. Vì vậy, khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể". Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ. * Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào Sự phân hóa là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hóa để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hóa khác nhau. Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật. 1.5.1.3. Điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro - Điều kiện trƣớc tiên là vô trùng. Tất cả các khâu nuôi cấy đều đƣợc thanh trùng: Dụng cụ nuôi cấy, mẫu nuôi cấy, môi trƣờng (giá thể) và các 13 thao tác nuôi cấy,... Sự thành công hay thất bại của việc nuôi cấy mô là phụ thuộc vào việc vô trùng. Nếu có một khâu nào đó không vô trùng thì ngay lập tức mẫu nuôi cấy bị nhiễm và sẽ chết. - Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là phòng thí nghiệm chuyên hóa cao với các thiết bị chuyên dụng. Nó bao gồm một phòng để mẫu, phòng cấy mẫu, phòng nuôi cấy và nhà lƣới để đƣa cây ra đất. Tùy theo quy mô và mục đích mà diện tích các bộ phận khác nhau. Các thiết bị quan trọng nhất của phòng nuôi cấy mô gồm có: nồi hấp khử trùng để vô trùng dụng cụ và môi trƣờng nuôi cấy, buồng cấy vô trùng để thao tác cấy mẫu, phòng nuôi có đủ ánh sáng nhân tạo và điều hoà nhiệt độ,... để nuôi cây. - Môi trƣờng nuôi cấy là giá thể có đầy đủ chất dinh dƣỡng, các hoạt chất nhƣ các nguyên tố đa lƣợng, nguyên tố vi lƣợng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng. Tùy theo từng loại cây và cơ quan nuôi cấy mà ngƣời ta đã có các môi trƣờng riêng cho chúng. Ví dụ: Môi trƣờng cơ bản nhất là môi trƣờng MS cho nhiều đối tƣợng cây trồng, môi trƣờng Anderson cho cây thân gỗ nhỏ, môi trƣờng Gamborg cho nuôi cấy tế bào trần, môi trƣờng CHU cho nuôi cấy bao phấn... 1.5.1.4. Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro  Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Đây là giai đoạn rất quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là tạo ra đƣợc nguyên liệu thực vật vô trùng để đƣa vào nuôi cấy in vitro. Khử trùng mô thực vật, ngƣời ta thƣờng dùng một số chất hoá học nhƣ: HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2. Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp.  Giai đoạn 2: Tái sinh và nhân nhanh chồi 14 Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy giai đoạn này đƣợc xem là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân ngƣời ta thƣờng phải đƣa thêm vào môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trƣởng (auxin,xytokynin, gibberellin,...). Các chất bổ sung khác nhƣ nƣớc dừa, nƣớc chiết nấm men, dịch thủy phân casein,… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy thuộc vào từng đối tƣợng nuôi cấy ngƣời ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.  Giai đoạn 3: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt kích thƣớc nhất định các chồi đƣợc chuyển từ môi trƣờng ở giai đoạn 2 sang môi trƣờng tạo rễ. Thƣờng sau từ 1 - 2 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, ngƣời ta thƣờng bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các auxin vì auxin là hoocmon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này, các chất IAA, IBA, NAA và 2,4 - D đƣợc sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất.  Giai đoạn 4: Đưa cây ra đất Giai đoạn đƣa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất là bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Cây lấy ra từ ống nghiệm phải đƣợc rửa sạch agar bám trên bề lặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc. Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dƣỡng sang sống hoàn toàn tự dƣỡng. Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phải đƣa cây ra vƣờn ƣơm, ƣơm trên các giá thể thích hợp từ 10 - 15 ngày. Lúc 15 này, rễ mới đƣợc sinh ra, lá non bắt đầu hình thành. Sau đó, chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bình thƣờng. * Các giai đoạn phát sinh phôi soma: - Giai đoạn phôi hình cầu: Sau lần phân chia đầu tiên của hợp tử, tế bào ở đỉnh trải qua một loạt phân chia có thứ tự, hình thành một thể phôi hình cầu gồm 8 tế bào, tế bào phía dƣới cũng trải qua một số lần nguyên phân để tạo thành cuống phôi, giúp đính phôi trong túi phôi và giúp hấp thụ dinh dƣỡng cho phôi từ môi trƣờng xung quanh. Trong giai đoạn này, sự phân chia tế bào xảy ra ở tất cả các tế bào.Nguyên bì sẽ trở thành biểu bì trong phôi trƣởng thành. Cuống phôi giúp đính phôi trong túi phôi. - Giai đoạn phôi hình tim: Giai đoạn này đƣợc hình thành bởi sự phân chia nhanh của các tế bào ở hai vùng đỉnh của khối cầu. Hai vùng này sinh trƣởng nhanh tạo thành hai lá mầm, kết quả phôi có hình đối xứng hai bên. - Giai đoạn phôi hình “cá đuối”: Giai đoạn này là kết quả của các tế bào kéo dài khắp trục phôi và phát triển của lá mầm sau này. Trục chồi - rễ (trục phôi) xuất hiện rõ rệt, mô phân sinh đỉnh bắt đầu hoạt động tạo thành mô mạch sơ cấp (mạch gỗ và mạch rây). - Giai đoạn phôi trƣởng thành: Là giai đoạn kết thúc quá trình phát sinh phôi, phôi gồm 3 vùng: + Vùng đỉnh: Hình thành các lá mầm và mô phân sinh đỉnh chồi. + Vùng trung gian (giữa): Tạo thành trụ dƣới lá mầm, rễ, và gần nhƣ mô phân sinh rễ. + Vùng cuống phôi: Tạo thành phần còn lại của mô phân sinh rễ. 16 1.5.2. Ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong sản xuất Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau: - Tạo ra một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn với diện tích thí nghiệm nhỏ. - Tạo ra đƣợc nhiều cây con từ mô và cây con của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện đƣợc. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học. - Bảo quản nguồn gen quý. - Sản xuất các hợp chất thứ cấp, các chất có hoạt tính sinh học (Alcaloid, Steroid,…) qua nuôi cấy mô tế bào, một số cây thuốc trên quy mô lớn,… [5], [7]. Trong đó, ứng dụng trong nhân giống cây trồng là lĩnh vực đƣợc quan tâm hơn cả. Nuôi cấy in vitro là một phƣơng pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phƣơng pháp nhân giống vô tính. Phƣơng pháp này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ đƣợc đặc tính của cây mẹ, có hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đƣợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc, khắc phục đƣợc những điều kiện bất lợi của thời tiết. Phƣơng pháp này đặc biệt tỏ ra hiệu quả hơn với các loài cây khó nhân giống bằng phƣơng pháp hữu tính và các giống quý có số lƣợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh. Theo Murashige (1974) [19], có khoảng 300 loại cây có thể nhân giống bằng các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Lợi ích của phƣơng pháp này còn ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể với số lƣợng lớn, sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, lƣu giữ bảo quản nguồn gen dƣới dạng cây in vitro. Khả năng ứng dụng dễ thấy nhất của phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật là phục tráng giống cây trồng. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với 17 khoai tây, cây ăn quả và nhiều loại cây trồng nhân giống vô tính khác. Đối với khoai tây, bệnh nguy hiểm nhất đó là bệnh virut - một trong những nguyên nhân chính gây nên hiện tƣợng thoái hoá giống. Một số tác giả đã dùng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng tạo đƣợc cây khoai tây không có virut, mang lại hiệu quả rất lớn cho ngành sản xuất khoai tây của thế giới. Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống đƣợc nâng lên một mức mới khi các nhà khoa học nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách cây nho và cây khoai tây đem cấy chuyển nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn đã đƣợc thể hiện ở quy mô thƣơng mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao nhƣ chuối, dứa, cà, khoai tây,... và đã có những đóng góp to lớn cho nền nông nghiệp thế giới. Trong lĩnh vực sản xuất hoa cây cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in vitro và các công nghệ sinh học khác nhƣ: tạo phôi soma, biến dị soma,... đã ngày càng đóng góp rất nhiều vào thị trƣờng Hoa - Cây cảnh trên thế giới. Năm 1985, kim ngạch của thị trƣờng này ƣớc tính 20 - 25 tỷ USD. Ở Hà Lan, kỹ thuật vi nhân giống trở thành nền tảng của công nghệ hoa và cây cảnh. Năm l987, Thái Lan có 20 công ty tƣ nhân dùng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trên quy môthƣơng mại để sản xuất hoa cắt. Colombia là nƣớc sản xuất hoa Cẩm chƣớng lớn nhất thế giới nhờ công nghệ nuôi cấy in vitro. Nuôi cấy in vitro đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chọn và nhân giống hiện đại. Bằng phƣơng pháp này, con ngƣời đã xây dựng nên các hệ thống sản xuất giống gốc, cho nhiều loại cây hoàn toàn sạch virut (khoai tây, đu đủ,…) Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nƣớc đã thành lập và thu đƣợc thành quả đáng kể. Viện Sinh vật - Viện Khoa học Việt Nam đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nhƣ lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi,... Tại trƣờng Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây. Tại các tỉnh phía Nam xây dựng đƣợc ngân hàng cà phê với 10 giống khác nhau, 18 hoàn thiện quy trình nhân giống cao su. Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào trong cả nƣớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa và cây ăn quả. Nuôi cấy mô thực vật hiện nay đƣợc đƣa vào trong các chƣơng trình chọn giống và nhân giống hiện đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và thực tiễn nông nghiệp. Mở ra mộthƣớng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, sinh hoá, sinh lý thực vật. Đặc biệt đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng. 19 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mẫu cây hoa Cúc CN01(Chrysanthmum maximum Seiun – 3)do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN,Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp. Hình 2.1. Mẫu cây hoa Cúc nhật CN01(Chrysanthmum maximum Seiun – 3) * Vài nét về giống hoa Cúc nhật CN01 CN01 là giống cúc đơn (Chrysanthmum maximum Seiun – 3). Đây là giống nhập nội của Nhật Bản, đƣợc đƣa ra từ Trung tâm Hoa - Cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001. Giống có đặc điểm: - Thân: cao 70 - 75 cm, cứng, mập, thẳng. - Bộ lá gọn, dày, màu xanh đậm, có từ 32 - 34 lá. - Hoa: kép to, màu vàng cam, đƣờng kính hoa từ 10 - 11cm. - Mật độ: 500.000 - 550.000 cây/ha; khoảng cách: 13×14 cm - 12×14 cm. - Độ bền hoa cắt: 10 - 12 ngày. - Giá trị kinh tế: 400 - 500 đồng/bông. - Vùng trồng: trồng đƣợc hầu hết các tỉnh phía Bắc. 20 Giống hoa Cúc này đã đƣợc đƣa vào sản xuất thử tại một số vùng trồng hoa ở Hà Nội nhƣ: Phú Thƣợng, Tây Tựu, Quảng An, Vĩnh Phúc một số tỉnh phía Bắc khác nhƣ: Thái Nguyên, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Lào Cai,... Thực tế sản xuất cho thấy: giống CN01 ổn định, sinh trƣởng phát triển tốt, chịu nóng, cho năng suất cao và chất lƣợng tốt, đƣợc các vùng trồng hoa rất ƣa chuộng với diện tích trồng đến năm 2006 là 16,2 ha, mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng một cách bền vững. Tháng 9 năm 2007, giống cúc CN01 đã đƣợc Hội đồng khoa học phê duyệt và đề nghị Bộ Nông nghiệp - Phát triển Nông thôn công nhận chính thức để mở rộng diện tích trong sản xuất, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nƣớc và hƣớng tới xuất khẩu. 2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 từ ngày 25/06/2014 - 03/2015. 2.3. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 2.3.1. Dụng cụ thí nghiệm Dao cấy, khay cấy, kéo, túi ninon, bình tam giác, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy... 21 2.3.2. Thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Cân kĩ thuật GM612, Đức Máy đo pH HM30G/TOA, Đức Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAYAMA, Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan Máy cất nƣớc hai lần Trung Quốc Buồng cấy vô trùng AV - 110/TELSTAR Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia Cân phân tích CP224S, Đức Tủ ấm UNIVERSAL 320R/HETTICH, Đức 2.4. Môi trường nuôi cấy - Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [14]: MS + 30g/l đƣờng sacharose + 7 g/l agar và các chất điều hòa sinh trƣởng. Riêng đối với môi trƣờng lỏng thì không bổ sung agar còn các thành phần dinh dƣỡng khác vẫn giữ nguyên. - pH môi trƣờng: 5,8. - Môi trƣờng đƣợc khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1170C trong 15 phút. 2.5. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo: - Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux. - Quang kì: 16 giờ/ngày. - Nhiệt độ phòng: 250C – 270C. - Độ ẩm trung bình: 70% - 74%. 22 2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * Thí nghiệm 1.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non và mẫu lá non cây hoa Cúc CN01 * Thí nghiệm 1a. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc CN01 Mẫu cây Cúc CN01 do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp, sau đó đƣợc nhân lên trong môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS để tạo ra nguồn nguyên liệu đủ để thực hiện các thí nghiệm sắp đƣợc tiến hành. Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúc in vitro đạt chiều cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt lấy chồi đỉnh (chiều dài khoảng 2 - 2,5 cm) cắt loại bỏ lá, thu mẫu đốt thân (mỗi mẫu có chiều dài khoảng 1cm). Sau đó đem mẫu cấy vào môi trƣờng dinh dƣỡng. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non câyhoa Cúc nhật CN01 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Công thức (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 0,7 + NAA 0,1 CT3 BAP 0,7 + NAA 0,3 CT4 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% 23 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian thí nghiệm kéo dài trong 5 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: - Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo. - Số mẫu không tạo ra mô sẹo. - Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100. - Độ xốp của mô sẹo. * Thí nghiệm 1b. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúcin vitro cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt đỉnh sinh trƣởng (chiều dài khoảng 2 - 2,5cm) cắt thu mẫu lá (chọn những lá non, gần đỉnh sinh trƣởng, khoảng 3 - 4 lá mới gần đỉnh sinh trƣởng nhất). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, Ki, 2,4 - D, IAA với nồng độ thay đổi đƣợc thể hiện trong bảng 2.2. 24 Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá noncây hoa Cúc nhật CN01 Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Công thức CT1 (ĐC) (mg/l) MS CT2 2,4-D 1,0 CT3 2,4-D 2,0 CT4 2,4-D 1,5 CT5 2,4-D 0,5+ Ki 0,2 CT6 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 CT7 2,4-D 1,5 + Ki 0,2 CT8 2,4-D 2,0 + Ki 0,2 CT9 BAP 0,7 +NAA 0,1 CT10 BAP 1,0 +NAA 0,3 CT11 BAP 1,0 +IAA 0,1 CT12 BAP 0,5 CT13 BAP 0,7 CT14 BAP 1,0 Chia làm 4 nhóm: - Nhóm 1 (N1): Ảnh hƣởng của 2,4 - D đến khả năngcảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 2-4). - Nhóm 2 (N2): Ảnh hƣởng của 2,4 - D kết hợp với Ki đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 5-8). - Nhóm 3 (N3): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 9-10). 25 - Nhóm 4 (N4): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với IAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT11). - Nhóm 5 (N5): Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 12- 14). Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian nuôi cấy và theo dõi thí nghiệm trong 5 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: - Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo. - Số mẫu không tạo ra mô sẹo. - Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100. - Độ xốp của mô sẹo. - Dạng mô sẹo đƣợc tạo thành. * Thí nghiệm 2. Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 Sau khi tạo ra đƣợc các khối mô sẹo, ta tiến hành chọn những khối mô sẹo sinh trƣởng, phát triển nhanh, có màu xanh lá để sử dụng trong thí nghiệm tạo dòng tế bào. Sử dụng khối mô sẹo vừa đƣợc lựa chọn, loại bỏ hết agar, tách cẩn thận, nhẹ nhàng ra thành những mảnh môcó kích thƣớc nhỏ, đem nuôi trong môi trƣờng lỏng: MS + 30g/l sacharose và có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, nƣớc dừa với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.3. 26 Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 Công thức Nổng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 0,7 CT3 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT4 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 1,0 + nƣớc dừa 10% Cần lƣợng mô sẹo khá lớn 2 - 3 g/100ml dung dịch môi trƣờng (Helgeson, 1979). Đặt bình nuôi cấy trên máy lắc, lắc với tốc độ 120 - 150 vòng/phút. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, đánh giá thí nghiệm sau 3 tuần nuôi cấy. Chỉ tiêu theo dõi: - Màu sắc tế bào huyền phù - Sự nhân lên của các tế bào mô sẹo đƣợc nuôi trong dung dich huyền phù. * Lƣu ý: thể tích dịch nuôi cấy trong bình chỉ chiếm khoảng 20% tổng thể tích bình. * Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào) Sau khi tạo đƣợc dòng tế bào huyền phù, tiến hành thu nhận các tế bào, khối tế bào trong dung dịch huyền phù. Chọn lấy những khối tế bào có màu xanh, đem nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung một số chất điều 27 hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, Ki, NAA, IAA với nồng độ thay đổi nhƣ trong bảng 2.4. Bảng 2.4: Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào) Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Công thức (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,1 CT3 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,3 CT4 BAP 1,0 + Ki 0,2 + IAA 0,2 CT5 BAP 0,7 + Ki 0,2 + IAA 0,2 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình 5 mẫu. đánh giá thí nghiệm sau 20 ngày nuôi cấy. Chỉ tiêu theo dõi: - Màu sắc mô sẹo - Dạng phát sinh hình thái từ mô sẹo. 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. CẢM ỨNG TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU ĐỐT THÂN NON VÀ MẪU LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 Để có thể tạo dòng tế bào huyền phù, nguồn nguyên liệu không thể thiếu là mô sẹo. Vì vậy, trƣớc tiên, ta tiến hành thí nghiệm nghiên cứu tìm ra môi trƣờng thích hợp để tạo ra nguồn nguyên liệu này, tiến hành trên hai đối tƣợng đó là: mẫu thân non, và mẫu lá non cây hoa cúc nhật CN01. 3.1.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 Sau 2 tuần nuôi cấy, đoạn thân bắt đầu cảm ứng hình thành mô sẹo ở tại vị trí vết cắt tiếp xúc với môi trƣờng, sau đó mô sẹo bắt đầu phát triển rộng ra tạo thành một khối có màu vàng nhạt, cứng. Kết quả theo dõi cho thấy ở thời điểm 3 tuần sau khi cấy, sự bổ sung BAP và NAA, cũng nhƣ tƣơng tác giữa các nồng độ BAP và nƣớc dừa có hiệu quả khác biệt rõ lên sự tạo mô sẹo từ đoạn thân non cây cúc CN01. Tỷ lệ tạo mô sẹođạt 100% không khác biệt giữa các công thức bổ sung BAP nồng độ 0,7 mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l và 0,3 mg/l, nhƣng có sự khác biệtso với các công thức khác. Môi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 0,5 - 0,7 mg/l kết hợp với nƣớc dừa 10% có sự tạo mô sẹo nhƣng với tỷ lệ thấp hơn, và ở môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS thì không có sự cảm ứng tạo mô sẹo. 29 A. BAP 0,7 + NAA 0,1 B. BAP 0,7 + NAA 0,3 C. BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% D. BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% E. MS Hình 3.1. Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên khảnăng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3 tuần nuôi cấy 30 Bảng3.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp một số chất điều hòa sinh trưởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3 tuần nuôi cấy Môi Nồng độ phối hợp Công của các chất điều thức hòa sinh trưởng (mg/l) Số mẫu cấy trường nuôi cấy tạo ra mô sẹo CT1( Số mẫu tạo mô sẹo Số Hiệu mẫu quả không tạo tạo mô mô sẹo sẹo (%) MS 30 - 0 30 0 CT2 BAP 0,7 + NAA 0,1 30 + 30 0 100 CT3 BAP 0,7 + NAA 0,3 30 + 30 0 100 30 + 10 20 30 + 12 18 ĐC) CT4 CT5 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% Độ xốp của mô sẹo * Hơi xốp Hơi xốp 33,33 Cứng 40 Cứng Ghi chú:(*): Không tạo mô sẹo nên không đánh giá độ xốp của mô sẹo. Qua bảng 3.1 ta thấy ở CT2, CT3 có sự phối hợp giữa BAP nồng độ 0,7 mg/l và NAA nồng độ 0,1 - 0,3 mg/l cho hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu cấy đoạn thân non cây hoa Cúc nhật CN01 cao, đạt tỷ lệ tối đa tới 100% sau 3 tuần nuôi cấy. Mô sẹo có màu vàng nhạt, thành khối, cứng (hình 3.1.A 3.1.B) Tuy nhiên, qua quá trình tiếp tục nuôi cấy và theo dõi ở 2 tuần tiếp theo nhận thấy: một số mô sẹo đƣợc tạo thành ở CT2 và CT3 có sự phát triển nhanh chóng về kích thƣớc và màu sắc cũng chuyển dần sang màu xanh lá, 31 hơi xốp (hình 3.1 - 3.2) và ở CT3 có số lƣợng mô sẹo trên nhiều hơn. Nhƣ vậy, ta có thể sử dụng BAP (0,7 mg/l) kết hợp với NAA (0,1 mg/l) để tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây Cúc CN01. Hình 3.2. Một số hình ảnh mô sẹo được tạo thành ở môi trường BAP 0,7 + NAA 0,1 sau 5 tuần nuôi cấy Bƣớc sang tuần thứ 6, các mô sẹo đƣợc tạo ra có hiện tƣợng già hóa, khối tế bào màu vàng nhạt chuyển dần sang vàng đậm, tiếp đến hóa nâu rồi chết (hình 3.3). Hình 3.3. Mô sẹo hóa nâu sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường BAP 0,7 + NAA 0,1 32 3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp của một số chất điều hòa sinh trưởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 5 tuần nuôi cấy Công thức CT1 Môi Số Nồng độ chất điều Số trường mẫu hòa sinh trưởng mẫu nuôi tạo (mg/l) cấy cấy tạo mô mô sẹo sẹo Hiệu Số mẫu quả không tạo tạo mô mô sẹo sẹo (%) Độ xốp của mô Dạng mô sẹo hình thành sẹo MS 30 - 0 30 0 * * CT2 2,4-D 1,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT3 2,4-D 2,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT4 2,4-D 1,5 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT5 2,4-D 0,5+ Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT6 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT7 2,4-D 1,5 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT8 2,4-D 2,0 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT9 BAP0,7 +NAA 0,1 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT10 BAP 0,7 +NAA 0,3 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT11 BAP 0,7 +IAA 0,1 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT12 BAP 0,5 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT13 BAP 0,7 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT14 BAP 1,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn (ĐC) Đối với thí nghiệm này tôi đã thử trên rất nhiều công thức khác nhau, nhƣng chƣa tìm đƣợc môi trƣờng thích hợp cho việc tạo ra mô sẹo với các đặc điểm: sinh trƣởng phát triển nhanh, có màu xanh, hơi xốp. Để phù hợp cho việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01. Kết quả thể hiện cụ thể trong bảng 3.2. 33 Qua bảng 3.2 và thực tế quan sát, theo dõi mẫu trong quá trình nuôi cấy nhận thấy: - Ở môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản CT1, không có sự cảm ứng tạo mô sẹo. - Ở các công thức còn lại (từ CT2 đến CT14) có sự hình thành khối mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy, cùng là mô sẹo cứng. Tuy nhiên, ở mỗi sự phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau, mô sẹo đƣợc hình thành cũng có những đặc điểm khác nhau: + Ở N1: Ảnh hƣởng của 2,4 - D cảm ứng tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3, và sau 4 tuần nuôi cấy thì mô sẹo rễ xuất hiện ở tất cả các công thức thí nghiệm thuộc N1 (hình 3.4 - H). Đặc biệt chú ý tới CT4: Trong quá trình hình thành mô sẹo rễ, ở tuần nuôi cấy thứ 3, thứ 4 diện tích lá cũng nhƣ thể tích khối mô sẹo tăng nhanh, có màu xanh lá, tuy nhiên khối mô sẹo cứng (hình 3.4-B). + Ở N2: Môi trƣờng có bổ sung 2,4 - D và Ki cảm ứng tạo mô sẹo nhỏ gọn,với kích thƣớc nhỏ và nhanh chóng chuyển vào giai đoạn già hóa ngay sau khi mô sẹo đƣợc hình thành (hình 3.4 - C). Nhƣ vậy, sự kết hợp của 2,4 D và Ki dƣờng nhƣ không thích hợp cho việc cảm ứng tạo mô sẹo từ lá. + Ở N3: Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung BAP (0,7 mg/l) và NAA (0,1-0,3 mg/l) cảm ứng tạo mô sẹo nhỏ gọn, cứng (hình 3.4 - A). + Ở N4: Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BAP (0,7 mg/l) và IAA (0,1 mg/l) cảm ứng tạo mô sẹo bắt đầu ở tuần nuôi cấy thứ 3 (hình 3.4 - E), sau 5 tuần nuôi cấy phát hiện thấy hầu hết trên mỗi khối mô sẹo xuất hiện 1 rễ kéo dài (hình 3.4 - F) + Ở N5: Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BAP (0,5 - 0,7 - 1,0 mg/l) cảm ứng hình thành mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 (hình 3.4 - D), bƣớc sang 34 tuần thứ 4 các khối mô sẹo đi vào giai đoạn già hóa, chuyển màu nâu đen và chết dần ở tuần thứ 5 (hình 3.4-G). A. BAP 0,7 + NAA 0,3 (3 tuần) B. 2,4-D 1,5 (tuần 3) C. 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 (tuần 3) D. BAP 1,0 (3 tuần) E. BAP 0,7 + IAA 0,1 (3 tuần) F. BAP 0,7 + IAA 0,1 (5 tuần) 35 G. BAP 1,0 (5 tuần) H. 2,4-D 1,0 (4 tuần) Hình 3.4. Một số hình ảnh trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây hoa Cúc nhật CN01 3.2. TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 Nhằm mục tiêu chủ động nhân nhanh sinh khối tế bào, nhu cầu nuôi cấy mô sẹo cũng nhƣ dịch huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 vô cùng cấp thiết. Mặt khác, mô sẹo thƣờng có biểu hiện già hóa nhanh khi nuôi cấy trong môi trƣờng thạch trong thời gian dài. Biểu hiện của già hóa là tế bào chuyển màu vàng nhạt, sang màu vàng đậm, tiếp theo là nâu hóa rồi chết. Hơn nữa, tốc độ tăng sinh khối trên môi trƣờng đặc chậm. Để khắc phục tình trạng này, ta tiến hành tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01. Sau khi tạo đƣợc mô sẹo, tôi tiến hành lựa chọn những khối mô sẹo có sức sinh trƣởng phát triển nhanh, kích thƣớc tế bào to, có màu xanh lá, hơi xốp để tiến hành sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào này. Ở giai đoạn này tôi sử dụng môi trƣờng có bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng BAP, BAP kết hợp với nƣớc dừa với các nồng độ khác nhau. Tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng lỏng, lắc nhằm mục đích tạo ra dòng tế bào đồng đều về kích thƣớc và độ tuổi.Ở môi trƣờng lỏng lắc, mô sẹo vừa hấp thu 36 chất dinh dƣỡng dễ dàng, vừa có sự trao đổi khí tốt hơn nên trọng lƣợng tế bào tăng rất nhanh, đồng thời đƣợc tách thành những cụm tế bào và tế bào rời trong dung dịch nuôi cấy. Đây chính là dạng khởi đầu của dịch huyền phù tế bào (hình 3.5 - A). Thời gian nuôi cấy và theo dõi trên môi trƣờng lỏng lắc 2 3 tuần. Qua theo dõi nhận thấy: sau 2 tuần nuôi cấy, các tế bào đƣợc nuôi trên môi trƣờng có bổ sung BAP ở nồng độ 0,7 mg/l có sự nhân lên đáng kể, sinh khối mô sẹo tăng và có màu xanh (hình 3.5 - C), gồm các tế bào đơn hoặc các cụm tế bào nhỏ tách rời, tƣơng đối đồng đều về mặt kích thƣớc và hình dạng. Nhƣ vậy, môi trƣờng thích hợp để tạo dòng mô sẹo cây hoa Cúc nhật CN01 là BAP 0,7 mg/l. Ở các môi trƣờng BAP (0,5-0,7-1 mg/l) kết hợp với nƣớc dừa (10%) khối tế bào cũng có sự phát triển, nhƣng chỉ sau vài ngày các tế bào đã bƣớc vào giai đoạn già hóa, màu sắc chuyển nâu dần (hình 3.5-B). Điều này cũng xảy ra với các tế bào đƣợc nuôi trong môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung BAP nồng độ 0,7 mg khi thời gian nuôi cấy bƣớc sang tuần thứ 3 (hình 3.5-D). 37 A.Tế bào khi bắt đầu nuôi cấy B. Tế bào sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% C. Tế bào sau 2 tuần nuôi cấy trong D. Tế bào sau 3 tuần nuôi cấy trong môi môi trƣờng BAP 0,7 trƣờng BAP 0,7 Hình 3.5. Một số hình ảnh trong quá trình nuôi cấy huyền phù tế bào cây hoa Cúc nhật CN01 3.3. TÁI SINH CHỒI TỪ DUNG DỊCH HUYỀN PHÙ CHỨA TẾ BÀO VÀ CỤM TẾ BÀO Có thể nói đây là khâu quan trọng mang tính chất quyết định sự thành công hay không của việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 38 nhằm nhân nhanh cây con giống, tạo ra số lƣợng lớn cây giống đồng đều, chất lƣợng cao trong thời gian ngắn đáp ứng nhu cầu của thị trƣờng. Sau khi thu đƣợc dòng huyền phù tế bào ổn định, tiến hành thu nhận các tế bào, khối tế bào trong dung dịch. Chọn lấy những cụm tế bào có màu xanh đem nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, Ki, NAA, IAA với các nồng độ khác nhau nhằm mục đích tái sinh chồi từcác tế bào này. Quan sát các giai đoạn phát sinh phôi soma từ mô sẹo: - Giai đoạn phát sinh phôi somalà một con đƣờng quan trọng trong sự tái sinh của thực vật từ những hệ thống nuôi cấy tế bào. Phôi thế hệ trải qua những giai đoạn phát triển căn bản giống phôi hợp tử: phôi dạng hình cầu, phôi dạng hình tim, phôi dạng hình cá đuối (thủy lôi) và phôi trƣởng thành [24]. Kết quả khảo sát quá trình phát sinh hình thái cuả tế bào, cụm tế bào sau 3 tuần nuôi cấy đƣợc thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Sự phát sinh hình thái của tế bào, cụm tế bào sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Màu sắc khối mô sẹo Dạng phát sinh hình thái CT1 (ĐC) MS Nâu đen Không phát sinh hình thái CT2 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,1 Xám nhạt Không phát sinh hình thái CT3 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,3 Xám nhạt Không phát sinh hình thái CT4 BAP 1,0 + Ki 0,2 + IAA 0,2 Xanh lá Phát sinh hình thái CT5 BAP 0,7 + Ki 0,2 + IAA 0,2 Xanh lá Phát sinh hình thái 39 Quan sát bảng 3.3 nhận thấy: - Ở công thức CT4, CT5, sau một tuần nuôi cấy, có sự xuất hiện của những phôi hình cầu (hình 3.6 - A). Sau 10 ngày nuôi cấy, các phôi tiếp tục phát triển thành phôi dạng hình tim (hình 3.6 - B), sau đó là phôi dạng hình cá đuối (thủy lôi) (hình 3.6 - C.1 - C.2) và phôi trƣởng thành (hình 3.6 - D), biểu hiện bởi những điểm xanh quan sát kĩ ta có thể thấy bằng mắt thƣờng trên khối mô sẹo. Phôi trƣởng thành với cực chồi, cực rễ đƣợc nhận thấy sau 15 ngày nuôi cấy.Sau 25 ngày, các phôi bắt đầu hình thành sơ khởi lá, tăng trƣởng thành cây (hình 3.7). Nhƣ vậy, sự phát sinh phôi soma từtế bào, cụm tế bào trong dung dịch huyền phù đã xảy ra trên môi trƣờng đƣợc bổ sung kết hợp BAP (0,7 - 1,0 mg/l), Ki (0,2 mg/l) và IAA (0,2 mg/l). - Ở công thức thí nghiệm CT1, môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS, sau 1 tuần nuôi cấy khối mô sẹo tiếp tục tăng trƣởng về kích thƣớc. Ở tuần nuôi cấy thứ 2, mô sẹo tăng kích thƣớc rất chậm và dần chuyển sang màu nâu đỏ. Tuần nuôi cấy thứ 3, khối mô sẹo không có sự tăng trƣởng về kích thƣớc, chuyển màu nâu đen và không có sự phát sinh phôi. Trên các công thức thí nghiệm CT2, CT3 bổ sung BAP (1,0 mg/l), Ki (0,2 mg/l) và NAA (0,1 - 0,3 mg/l) sau 3 tuần nuôi cấy khối mô sẹo tăng lên về kích thƣớc, màu sắc chuyển dần sang màu xám nhạt. - Trong công thức thí nghiệm CT4, CT5 số phôi soma tạo ra giảm dần theo sự tăng của nồng độ BAP. Nhƣ v ậy, qua thực nghiệm cho thấy môi trƣờng phù hợp nhất tạo phôi soma môi trƣờng có bổ sung kết hợp của BAP (0,7 mg/l), Ki (0,2 mg/l) và IAA (0,2 mg/l). 40 A. Phôi hình cầu B. Phôi hình tim C.1: Phôi hình cá đuối (thủy lôi) C.2: Phôi hình cá đuối (cắt rời) D. Phôi trƣởng thành Hình 3.6. Các giai đoạn phát sinh phôi của cây hoa Cúc nhật CN01 41 A B C D E Hình 3.7. Chồi non dần được hình thành từ phôi trưởng thành 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Dựa vào những kết quả thu đƣợc từ những thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1.1. Môi trƣờng thích hợp để cảm ứng tạo mô sẹo từ đốt thân cây hoa Cúc nhật CN01 là BAP 0,7 mg/l + NAA 0,1 mg/l hiệu quả tạo mô sẹo rất cao đạt 100%. 1.2. Môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung2,4 - D cảm ứng hình thành mô sẹo rễ từ mẫu lá non cây Cúc nhật CN01 với hiệu quả tạo mô sẹo rễ rất cao đạt 100%. 1.3. Môi trƣờng 2,4 - D + Ki không thích hợp để tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01. 1.4. Môi trƣờng thích hợp để tạo dòng mô sẹo ổn định của cây hoa Cúc nhật CN01 là BAP 0,7 mg/l và nên thu sinh khối tế bào sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng nuôi cấy không liên tục, lỏng, lắc này. 1.5. Môi trƣờng thích hợp cho việc tạo phôi soma và tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù chứa tế bào, cụm tế bào thu đƣợclà BAP 0,7 mg/l + Ki 0,2 mg/l + IAA 0,2 mg/l. 2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các giai đoạn trong quá trình sản xuất cây con giống thông qua việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 để đạt hiệu quả cao nhất. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Kim Biên (1984), Góp phần nghiên cứu phân loại họ cúc ở Việt Nam, Luận án TS sinh học, Viện Khoa học Việt Nam, tr.45-91. 2. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1978), "Phân loại học thực vật", Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, tr.424-436. 3. Trần Hợp (1993), Cây cảnh, hoa Việt Nam, Nxb Hà Nội, tr.258-270. 4. Trần Lan Hƣơng, Trần Tuấn Anh, Phạm Thanh Hƣơng (2006) "Tìm hiểu về thế giới thực vật, Nxb Giáo dục. 5. Dƣơng Công Kiên (2002), Nuôi cấy mô thực vật, Nxb Đại học Quốc gia TP. Hồ chí Minh. 6. Nguyễn Xuân Linh chủ biên (1998), "Hoa và kỹ thuật trồng hoa", Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tr.182-184. 7. Trần Văn Minh (1995), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Giáo trình Đại học, Viện Đại học mở bán công TP. Hồ Chí Minh. 8. Hoàng minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng (2006), Giáo trình Sinh lí thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.244 - 246. 9. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Xuân Trƣờng (1998), "Thử nghiệm các dung dịch dinh dƣỡng cho việc trồng một số cây rau bằng kĩ thuật trồng cây trong dung dịch", Tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm. 10. Nguyễn Nghĩa Thìn (2006), Thực vật có hoa, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội. 2. Tài liệu tiếng Anh 11. Amagasa, K., Kameya, T. (1989) , "Plant regeneration and formation from chrysanthemum morifolium, C. 44 Coronrium and lacturcasativa protoplasts", Journal of the Japanese Society for horticultural Science. pp.620-625. 12. Anderson, N.O. (1987), "Reclassification of genus Chrysanthemum",Horticultural science, Euphytica, pp.313 - 314. 13. Chen. J (1985), "Phenotypic differences in transgenic plants of Chrysanthemum",Acta/Horticulture. pp.349-361. 14. Gamborg, L,; Murashige, T.; Thorpe T.A,; Vasil I.K.; (1968), Plant Tissue Culture Media In vitro, 12: 473 - 478. 15. Haberlandt, G,; (1902), Culturversuche mit isolierten Pflanzenllen, SitzBer. Mat. Nat. Kl. Kais. Akad. Wiss. Wien, 111: 69 - 92. 16. Host. R.K (1990), Handbook of plant cell culture, Vol.5, New York, pp.215-217. 17. Kere Bremer (1994), Asteraceae clasditic and classification, New York. 18. Kenneth C, Torres (1990), Tissue culture techniques for horticulture, pp.26-34. 19. Murashige, T. (1974), “Plant propagation through tissue cultures”, Ann. Rev. Physiol. Plant,25: 135 - 166. 20. Langton, F.A. (1989), "Inheritance in chrysanthemum morifolium Ramat", Heredity, pp.419 - 423. 21. Robert, A.V and Smith, E.P (1990), "The preparation invitro of Chrysanthemum for transplantion to soil", Plant cell tissue and organ culture, pp.129-140. 22. Sussex, I.M. (1989), Developmental programming of the shoot meristem cell, 56, pp.225-229. 23. Takhtajan, A.L. (1987), Sysyema Magnolioophytorum, Leningrad Nauka. 24. West M.A.L. and Harada J.J., 1993. “Embryogennesis in higher plant: An overview”. Plant cell. Vol 5, pp.1361 - 1369. 45 25. Woolman.J. (1989), A plantsmans guide to Chrysanthemum",London, pp.142-154. 26. Yahel. H and Y. Tsukamoto (1985), Chrysanthemum (perenmial species), Japan, pp.258 -264. 3. Tài liệu Internet 27. http://nongnghiep.vn. 28. http://www.khcnpy.gov.vn. 46 [...]... tạo mô sẹo từ đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 - Cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây hoa Cúc nhật CN01 - Tạo dòng huyền phù tế bào và cụm tế bào cây hoa Cúc nhật CN01 - Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù tế bào và cụm tế bào cây hoa Cúc nhật CN01 3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: + Cung cấp tƣ liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật - Ý nghĩa thực... qua tạo dòng huyền phù tế bào đáp ứng đƣợc các yêu cầu số lƣợng và chất lƣợng cây con giống Do đó, tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2.1 Mục đích nghiên cứu Tạo dòng tế bào huyền phù góp phần nhân nhanh cây con giống hoa Cúc nhật CN01 đáp ứng nhu cầu trong và ngoài nƣớc 2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu - Cảm ứng tạo. .. dõi: - Màu sắc tế bào huyền phù - Sự nhân lên của các tế bào mô sẹo đƣợc nuôi trong dung dich huyền phù * Lƣu ý: thể tích dịch nuôi cấy trong bình chỉ chiếm khoảng 20% tổng thể tích bình * Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào) Sau khi tạo đƣợc dòng tế bào huyền phù, tiến hành thu nhận các tế bào, khối tế bào trong dung dịch huyền phù Chọn lấy những khối tế bào có màu xanh,... nghiệm trong 5 tuần Chỉ tiêu theo dõi: - Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-) - Số mẫu tạo ra mô sẹo - Số mẫu không tạo ra mô sẹo - Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100 - Độ xốp của mô sẹo - Dạng mô sẹo đƣợc tạo thành * Thí nghiệm 2 Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 Sau khi tạo ra đƣợc các khối mô sẹo, ta tiến hành chọn những... to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng 19 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Mẫu cây hoa Cúc CN01( Chrysanthmum maximum Seiun – 3)do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN,Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp Hình 2.1 Mẫu cây hoa Cúc nhật CN01( Chrysanthmum maximum Seiun – 3) * Vài nét về giống hoa Cúc nhật CN01 CN01 là giống cúc đơn (Chrysanthmum maximum... vòi nhụy đều có màu hồng rất đẹp [1] Năm 1993, Trần Hợp đã phân loại cây hoa Cúc thuộc nhóm cây thân thảo, có hoa làm cảnh và cũng đƣa ra một số cây Cúc trồng ở Việt Nam nhƣ cây Tần ô (Rau Cúc - C.coronariu Linn), cây Cúc trắng (C.molifolium), cây Cúc vàng (Kim Cúc - C.indicum Linn) và Cúc Trừ trùng (C.cinerariaefolium vis) [3] 4 Cúc có rất nhiều giống, nhƣng đến nay việc phân loại vẫn chƣa thống nhất... tích lá 1.4.2 Tình hình nghiên cứu hoa Cúc ở Việt Nam Cây hoa Cúc đã đƣợc nhập nội vào nƣớc ta từ lâu nhƣng phải đến sau những năm 1990, tức là sau kinh tế bao cấp đổi mới sang kinh tế thị trƣờng thì nghề trồng hoa nói chung và nghề trồng hoa Cúc nôi riêng mới bắt đầu có những bƣớc phát triển đáng kể Chính vì vậy, các nghiên cứu về cây hoa Cúc ở Việt Nam còn ít Cây hoa Cúc ở Việt Nam chủ yếu tập trung... của tế bào và khả năng phân hóa và phản phân hóa của chúng mà ngƣời ta có thể tái sinh cây từ một tế bào hay một mô nào đấy 1.5.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật * Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902, Haberlandt (Đức) [15], là ngƣời đầu tiên đề xƣớng học thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời" Theo ông: "Mỗi tế bào. .. nhân tạo: - Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux - Quang kì: 16 giờ/ngày - Nhiệt độ phòng: 250C – 270C - Độ ẩm trung bình: 70% - 74% 22 2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * Thí nghiệm 1.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non và mẫu lá non cây hoa Cúc CN01 * Thí nghiệm 1a Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc CN01 Mẫu cây Cúc CN01 do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh... kéo dài trong 5 tuần Chỉ tiêu theo dõi: - Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-) - Số mẫu tạo ra mô sẹo - Số mẫu không tạo ra mô sẹo - Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100 - Độ xốp của mô sẹo * Thí nghiệm 1b Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúcin vitro cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt đỉnh