Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào cho bằng lipofectaminetm ltx ứng dụng tạo dòng tế bào cho biểu hiện kháng thể nivolumab

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHUYỂN GEN TẾ BÀO CHO BẰNG LIPOFECTAMINETM LTX ỨNG DỤNG TẠO DÒNG TẾ BÀO CHO BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ NIVOLUMAB Người hướng dẫn: TS BRUCE MAY ThS NGUYỄN MAI KHÔI Sinh viên thực hiện: TRƯƠNG THỊ THÙY CHÂU Số thẻ sinh viên: 107120243 Lớp: 12SH Đà Nẵng, 5/2017 SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX - Ứng dụng tạo dòng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab Sinh viên thực hiện: Trương Thị Thùy Châu Số thẻ sinh viên: 107120243 Lớp: 12SH Trong 30 năm qua, sản xuất protein tái tổ hợp trở thành kỹ thuật quan trọng ứng dụng chủ yếu vào sản phẩm dược phẩm sinh học, có kháng thể đơn dòng dùng để điều trị nhiều loại ung thư Kháng thể đơn dòng Nivolumab chứng nhận loại bỏ di u hắc tố, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư thận ung thư hạch bạch huyết Tuy nhiên, giá thành thuốc rào cản lớn nhiều bệnh nhân ung thư nước ta Hiện nay, kháng thể đơn dòng đa phần loại protein tái tổ hợp khác sản xuất với hệ thống biểu tế bào buồng trứng chuột túi má Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary CHO) Trong nghiên cứu này, sử dụng LipofectamineTM LTX làm nhân tố chuyển gen, qui trình chuyển gen vào tế bào CHO có hiệu tốt xây dựng dựa kết so sánh điều kiện: lượng DNA sử dụng/tế bào; tỉ lệ LipofectamineTM LTX DNA sử dụng; môi trường phục hồi tế bào sau chuyển gen Bên cạnh đó, hai vector tái tổ hợp mang gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể Nivolumab thiết kế biểu thành cơng Qui trình vector tái tổ hợp tạo ứng dụng để tạo thành cơng dịng tế bào CHO biểu ổn định kháng thể Nivolumab Kết thử nghiệm ứng dụng cho công tác tạo dòng biểu protein kháng thể khác, làm tiền đề cho việc sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Việt Nam Từ khóa: kháng thể đơn dòng, Nivolumab, chuyển gen, tế bào CHO, protein tái tổ hợp, biểu protein SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong 30 năm qua, sản xuất protein tái tổ hợp trở thành kỹ thuật quan trọng ứng dụng chủ yếu vào sản phẩm dược phẩm sinh học Hầu hết protein tái tổ hợp đưa vào sản xuất sử dụng phân tử sinh học có cấu trúc phức tạp đặc trưng Để bảo toàn hoạt tính sinh học, chúng cần tế bào chủ biến đổi hậu dịch mã tái cấu trúc cách xác[1][2] Sở hữu khả này, tế bào động vật hữu nhũ đối tượng ưa chuộng sản xuất protein lớn cần phải oligomer hóa nhiều chuỗi, mà phổ biến kháng thể[1] Trong công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, trước sử dụng tế bào động vật hữu nhũ tế bào vi sinh vật chọn hệ thống biểu protein[1][3], cụ thể tế bào vi khuẩn nấm men Tốc độ sinh trưởng nhanh, hệ thống biểu linh hoạt, thành phần môi trường đơn giản rẻ tiền ưu điểm việc việc sử dụng tế bào vi khuẩn để sản xuất protein tái tổ hợp qui mô lớn[3] Tuy nhiên, vốn tế bào nhân sơ, vi khuẩn thiếu khả biến đổi hậu dịch mã (post-translational modifications) bao gồm việc phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị, phản ứng glycosyl hóa, methyl hóa[3][4], … nên sản phẩm bị hoạt tính sinh học dễ bị phân giải Trong đó, tế bào nấm men tế bào nhân thực nên có khả biến đổi hậu dịch mã cho protein[3] Thế tế bào nấm men ứng dụng để sản xuất sản phẩm sinh dược cho người có hoạt tính mạnh dễ kích thích đáp ứng miễn dịch, trình biến đổi hậu dịch mã protein chúng không thực theo phương thức xác tế bào người[1] Hiện số loại protein tái tổ hợp không phụ thuộc nhiều vào trình biến đổi hậu dịch mã sản xuất qui mô lớn với tế bào vi khuẩn insulin, hormone sinh trưởng, interleukin, interferon,… tế bào nấm men albumin huyết thanh, vaccine viêm gan B,…[1] So sánh với tế bào vi sinh vật vi khuẩn nấm men, tế bào động vật hữu nhũ có máy biến đổi hậu dịch mã tương đồng với tế bào người[5] Một số dòng tế bào buồng trứng chuột túi má Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary - CHO), tế bào thận chuột túi má (Baby Hamster Kidney - BHK) hay tế bào thận phôi người (Human Embryonic Kidney - HEK) trở thành hệ biểu lý tưởng để sản xuất protein tái tổ hợp phức tạp[2] Trong số dòng tế bào động vật hữu nhũ, SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX tế bào CHO ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm sinh dược thương mại[3] Trong số dược phẩm phê chuẩn Cơ quan Quản lý Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), có tới 70% sản phẩm tạo từ tế bào CHO[3] quy trình cơng nghệ sản xuất tế bào nghiên cứu kỹ thời gian dài[2] Tuy nhiên, bất lợi chủ yếu nuôi cấy tế bào động vật hữu nhũ chi phí tương đối cao sản xuất với qui mơ cơng nghiệp quy trình tinh chế phức tạp để thu lại protein tiết[2][6] Ở qui mô phịng thí nghiệm, cơng tác nghiên cứu tạo dịng sản xuất protein tái tổ hợp tế bào động vật gặp trở ngại hiệu chuyển gen tỉ lệ biểu gen tế bào chủ sau chuyển gen thường không ổn định[7][8], khiến việc chọn dòng đơn bào để đưa vào sản xuất tốn nhiều thời gian cơng sức[1] Bên cạnh đó, sau q trình chuyển gen vào tế bào cần có q trình khuếch đại tín hiệu biểu protein[9] trước chọn dịng tế bào có khả biểu hiệu với sản lượng đủ cao để đưa vào sản xuất với qui mô công nghiệp Trước thực tế này, nhiều nghiên cứu tiến hành với mục đích tìm giải pháp nâng cao hiệu biểu protein tái tổ hợp tế bào chủ với nhiều hướng tiếp cận khác Để cải thiện thân tế bào chủ, nhiều dòng tế bào đột biến tạo nhờ kĩ thuật công nghệ di truyền[5] Những đột biến tạo điều kiện thuận lợi cho cơng tác khuếch đại tín hiệu biểu protein tái tổ hợp lên nhiều lần sau chuyển gen Bên cạnh đó, quần thể tế bào sau chuyển gen có khả biểu tốt rút ngắn q trình khuếch đại tín hiệu Vì vậy, nghiên cứu thiết kế vector có hiệu quả[7], chọn lọc tối ưu hóa phương pháp chuyển gen vào tế bào[10] mối quan tâm hàng đầu để đảm bảo đạt hiệu chuyển gen tốt Điều giúp nhà nghiên cứu rút ngắn thời gian nghiên cứu sản xuất sản phẩm protein tái tổ hợp định, mang lại lợi kinh tế, tiết kiệm thời gian công sức Một số sản phẩm protein tái tổ hợp nghiên cứu sản xuất ứng dụng chữa bệnh thành công kháng thể đơn dòng Hiện kháng thể đơn dòng dùng hiệu pháp điều trị trúng đích nhiều loại ung thư Nổi bật số loại kháng thể đơn dòng đưa thị trường dược phẩm Nivolumab Đây kháng thể kháng PD-1 thử nghiệm lâm sàng pha 39 bệnh nhân mắc ung thư di kháng thuốc[11] Tháng 12 năm 2014, Cơ quan Quản lý Thuốc Thực phẩm Mỹ cấp phép cho sử dụng Nivolumab để điều trị phối hợp điều trị miễn dịch ức chế ung thư khối u ác tính[12] Sử dụng Nivolumab điều trị ung thư chứng nhận loại bỏ di u SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX hắc tố, ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư thận ung thư hạch bạch huyết[13] Tuy nhiên, giá thành thuốc rào cản lớn nhiều bệnh nhân ung thư nước ta Đứng trước tình hình thực tế này, đề tài “Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX - Ứng dụng tạo dòng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab” tiến hành để tạo bước đệm cho cơng tác tạo dịng sản xuất thuốc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành nhằm mục đích: 1) Tạo vector tái tổ hợp mang gen biểu kháng thể Nivolumab 2) Xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO sử dụng LipofectamineTM LTX có hiệu chuyển gen cao 3) Ứng dụng vector tạo qui trình xây dựng để tạo dòng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab Phạm vi đối tượng nghiên cứu − Dòng tế bào CHO K1 − Dòng tế bào CHO DG44 − Dòng tế bào E.coli TOP10F − Plasmid pNIC2_GFP, pUC57_MAR_AR1, pNIC2_MAR_GFP, pNIC2_MAR_NIVH, pNIC2_MAR_NIVL, pDHFR Nội dung thực − Tạo dòng vector mang gen biểu kháng thể Nivolumab − So sánh điều kiện có ảnh hưởng lớn đến hiệu chuyển gen cho tế bào CHO: lượng DNA sử dụng/tế bào; tỉ lệ nhân tố chuyển gen DNA sử dụng; môi trường phục hồi tế bào sau chuyển gen − Dựa kết so sánh, xây dựng qui trình chuyển gen − Sử dụng vector vừa tạo qui trình vừa xây dựng để tạo dòng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào động vật biểu protein 1.1.1 Giới thiệu tế bào CHO Tế bào buồng trứng chuột túi má Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary cellsCHO cells) ngày trở thành hệ thống tế bào chủ quan trọng sản xuất protein tái tổ hợp quy mô công nghiệp Với số lượng nhiễm sắc thể (2n < 22) động vật hữu nhũ, chuột túi má Trung Quốc mơ hình lý tưởng cho di truyền học tế bào chiếu xạ nuôi cấy mô [5] Năm 1957, Theodore T Puck lần lấy sinh thiết buồng trứng chuột túi má xuất xứ Trung Quốc đem ni giữ đĩa[23] Từ tạo nên dòng tế bào CHO mà ngày sử dụng phổ biến Dù có nhiều loại tế bào động vật khác 70% protein tái tổ hợp dùng tế bào CHO vật chủ biểu hiện[3] Hình 1.1 Hình ảnh dịng tế bào CHO[5]qua kính hiển vi Tế bào CHO có nhiều đặc tính ưu việt so với việc sử dụng hệ thống vật chủ vi khuẩn, nấm men hay trùng Có thể kể đến có hệ thống xử lý sau dịch mã tự nhiên, xử lý giống với chế người[8] Vì vậy, tế bào CHO thực tốt trình hình thành cầu nối disulfide, gấp cuộn chuỗi polypeptide, phân cắt, ghép nối tiểu phần, glycosyl hóa, phosphoryl hóa, … dù phức tạp thực cách xác, hiệu không gây đáp ứng miễn dịch đưa vào thể người[7] Tế bào CHO số tế bào dễ biến nạp DNA, thuận tiện sàng lọc, biểu mạnh ổn định protein mục tiêu[2] Chúng có sức sống SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX cao, dễ tăng sinh đặc biệt cịn có khả thích ứng cao chuyển từ mơi trường ni cấy bám dính sang huyền phù Bên cạnh đó, virus nguy hiểm HIV, virus gây viêm gan siêu vi B- HBV, virus cúm, bại liệt, sởi, rubella nhiều loại adenovirus chép tế bào CHO [5] Những đặc điểm với lịch sử nghiên cứu ứng dụng 20 năm [7] chứng minh tính an tồn khiến CHO trở thành dòng tế bào chủ lý tưởng cho sản xuất protein tái tổ hợp Với việc sử dụng rộng rãi tế bào CHO nghiên cứu sinh học y khoa phát triển nhanh chóng kỹ thuật cơng nghệ di truyền, dịng biến đổi chuyên biệt tế bào CHO phát triển để cải tiến tế bào chủ nhằm tăng khả biểu protein Mỗi dịng tế bào CHO có đặc tính di truyền học khác sử dụng nghiên cứu tìm hiểu chế hệ thống biểu protein, từ phát triển nhiều dòng phụ với suất sản xuất protein khuếch đại lớn 1.1.2 Các dòng phụ tế bào CHO Hình 1.2 Các dịng phụ tế bào CHO phát triển[24] • Dịng CHO K1 Dòng tế bào CHO K1 (ATCC CCL-61; ECACC 85051005) dòng thứ cấp (subclone) dòng tế bào CHO[5], tạo dịng thành cơng vào năm 1957[5] sử dụng phổ biến nghiên cứu điều hòa biểu gen động vật hữu nhũ Dịng tế bào CHO K1 có 21 nhiễm sắc thể, nhiễm sắc thể so với tế bào từ chuột túi má Trung Quốc nguyên bản[24] CHO K1 vốn SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX dòng tế bào bám dính, đồng thời nuôi cấy dạng huyền phù Đặc điểm có lợi ni cấy huyền phù đơn giản rẻ tiền ni cấy bám dính nhiều • Dòng CHO DG44 Từ hàng loạt tế bào bị đột biến dòng CHO K1, dòng thứ cấp (subclone) phân lập mơ tả dịng tế bào CHO DG44[5] So sánh với dòng tế bào CHO K1 ban đầu, tế bào CHO DG44 khiếm khuyết gen mã hóa cho enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) [5] Enzyme đóng vai trị chủ chốt q trình hình thành nên hypoxanthine thymidine[23], vốn quan trọng tăng trưởng phát triển tế bào Trong trình chuyển gen, vector mang gen mục tiêu gen mã hóa cho enzyme DHFR chuyển vào tế bào Những tế bào tăng sinh môi trường khuyết thiếu chất bổ sung hypoxanthine thymidine xem tế bào chuyển gen thành cơng[25] Do đó, sử dụng dịng tạo điều kiện thuận lợi để chọn lọc tế bào chuyển gen thành công tế bào nguyên Bên cạnh đó, tăng số lượng copy gen DHFR có tương quan với tăng số lượng copy gen mục tiêu chuyển vào tế bào, dẫn đến kết tăng lượng protein mục tiêu tế bào chủ sản xuất [25] Vì vậy, DHFR cịn nhân tố khuếch đại gen mục tiêu Để làm điều này, tế bào sau chyển gen bị gây áp lực cách bổ sungmethotrexate (MTX)[25][26] vào môi trường Chất có tác dụng bất hoạt enzyme DHFR buộc tế bào phải sản xuất nhiều enzyme hơn, đồng thời sản xuất nhiều protein mục tiêu hơn[23] Những đặc điểm khiến dòng CHO DG44 ưa chuộng công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp • Các dịng tế bào CHO khác Bên cạnh hai dòng tế bào CHO phổ biến CHO K1 CHO DG44, nhiều dòng khác phát triển cho nhiều mục đích ứng dụng khác Có thể kể đến CHO DUK B11 khiếm khuyết allele DHFR[7], CHO GS tự tổng hợp enzyme glutamine synthase[16], … khuyết dưỡng đặc biệt dòng tế bào sở để chọn lọc nghiên cứu hệ thống biểu chúng Hiện nay, đối tượng nghiên cứu phịng RD cơng ty NANOGEN hai dịng CHO K1 CHO DG44, nên nghiên cứu giới hạn hai dòng tế bào SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 1.2 Phương pháp chuyển gen vào tế bào động vật 1.2.1 Nguyên lý trình chuyển gen Quá trình chuyển gen trình thao tác để đưa đoạn gen mong muốn vào gen tế bào nhận Gen chuyển phải có khả biểu di truyền ổn định hệ sau[8] Để làm điều này, gen chuyển phải vào nhân tế bào nhận phải diễn sát nhập gen tế bào chủ gen chuyển[8][27] Không phải tất tế bào thể tiếp nhận yếu tố lạ, mô khác thể tế bào khác mơ tiếp nhận nhân tố lạ theo cách riêng chúng[8] Điều làm hiệu chuyển gen khác Cùng lúc đó, gen chuyển phải biểu nhân tế bào chủ Đây vấn đề quan trọng sát nhập vào nhiễm sắc thể tế bào chủ gen chuyển có khả biểu không biểu mức độ biểu khác Trong nhiều trường hợp, gen chuyển gây nhiều khó khăn cho chế hoạt động bình thường gen tế bào chủ gây rối loạn chức gen [28] Tổ hợp gen cần chuyển phải chèn xác vào vị trí cần thiết, đồng thời phải khống chế tác động tiêu cực khác[27] 1.2.2 Các phương pháp chuyển gen Để biểu protein khác lồi tế bào chủ gen mã hóa cho protein mục tiêu cần phải chuyển toàn vẹn vào tế bào biểu mà khơng gây hại cho tế bào chủ Có nhiều chiến lược đưa để phục vụ cho mục đích chuyển gen vào tế bào động vật Các phương pháp phân loại theo nhiều cách khác Căn vào tính chất yếu tố chuyển gen, phương pháp chuyển gen chia thành ba loại: phương pháp vật lý, phương pháp sinh học - virus phương pháp hóa học SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX Hình 1.3 Vi tiêm DNA vào tế bào [8] • Phương pháp vật lý Phương pháp vật lý bao gồm kỹ thuật xung điện, bắn gen vi tiêm trực tiếp[6] Nguyên lý chung kỹ thuật nhằm chọc thủng màng tế bào tạm thời, cho phép DNA vào tế bào Nhược điểm phương pháp vật lý hiệu suất thấp gây tổn thương lớn cho tế bào nhận[27][6], đồng thời đòi hỏi sở vật chất kỹ thuật phức tạp • Phương pháp sử dụng virus Phương pháp chuyển gen virus tận dụng khả tải nạp DNA chứa virus vào tế bào chủ để sát nhập gen chuyển vào gen tế bào Cách làm đem lại hiệu suất chuyển gen cao, lại tiềm ẩn nhiều nguy chưa kiểm soát hết virus[27] nên không sử dụng cách rộng rãi • Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học bao gồm việc sử dụng tác nhân calcium phosphate vô cơ, diethylaminoethyl - DEAE dextran cationic lipid[3][29] Các chất mang hóa học kết hợp với phân tử DNA tạo thành phức hợp theo chế khác Các phức hợp tương tác với màng tế bào vào tế bào theo trình nhập bào (endocytosis)[29] Trong số phương pháp chuyển gen khác sử dụng hóa chất giải pháp an toàn cho tế bào động vật hữu nhũ[29][25] Trong phương pháp chuyển gen qua trung gian cationic lipid phương pháp mới, cho hiệu suất cao, chi phí thấp nên sử dụng rộng rãi Trong nghiên cứu này, phương pháp chuyển gen cationic lipid sử dụng cho trình tạo dòng tế bào động vật biểu gene mục tiêu Cationic lipid sử dụng để tạo phức chuyển gen sản phẩm Lipofectamine đoàn Invitrogen, Carlsbad, CA SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH TM GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May LTX tập TRANG 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX Hình 3.8 Sơ đồ vector pNIC2_MAR_NIVH Hình 3.9 Sơ đồ vector pNIC2_MAR_NIVL SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 40 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 3.2 Kết thăm dò nồng độ kháng sinh chọn lọc Trước tiến hành chọn lọc kháng sinh sau chuyển gen để chọn lọc dòng tế bào biểu ổn định, cần phải xác định nồng độ kháng sinh phù hợp để chọn lọc tế bào chuyển gen kháng kháng sinh Nồng độ phải không cao để độc chết tồn quần thể tế bào, khơng thể thấp để tế bào không chuyển gen thích ứng sống sót [31] Bảng 3.3 Nồng độ G418 thấp để giết chết quần thể tế bào hoàn toàn mật độ khác sau ngày - Thí nghiệm thăm dị nồng độ kháng sinh chọn lọc - Số tế bào giếng Nồng độ G418 thấp để giết chết quần thể tế bào hoàn toàn (mg/mL) 2.000 1.000 500 250 125 63 32 16 DG44 0,8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 K1 0,6 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 DG44 0,6 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 K1 0,8 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Đối với dịng tế bào CHO DG44 CHO K1, thí nghiệm thăm dò nồng độ kháng sinh chọn lọc thực lần với nồng độ tế bào nằm khoảng từ tế bào giếng đến 2.000 tế bào giếng 12 cột nồng độ kháng sinh biến động khoảng từ 0,2 mg/ml đến 1,4 mg/ml hàng giếng, hàng H đóng vai trị đối chứng Kết quan sát nồng độ G418 thấp để giết chết quần thể tế bào hoàn toàn mật độ khác sau ngày trình bày bảng 3.3 Để xác định mức độ sống chết quần thể tế bào, đĩa thí nghiệm quan sát giếng kính hiển vi (độ phóng đại 100 lần) Các tế bào sống có dạng trịn, tế bào chất suốt, màng tế bào mượt Ngược lại, tế bào chết thường xuất vật chất tối màu tế bào chất, màng tế bào lồi lõm khơng đồng đều, chí vỡ thành nhiều mảnh Ở giếng có mật độ tế bào thấp (từ tế bào/giếng đến 1.000 tế bào/giếng), quan sát tế bào sống nồng độ kháng sinh thấp 0,2mg/ml Kết thăm dò cho thấy nồng độ G418 thấp để giết chết quần thể tế bào chết hoàn toàn sau ngày 0,8mg/ml.Như đề cập Chương 3, nồng độ kháng sinh phù hợp dùng cho trình chọn lọc nồng độ G418 giếng cao giếng có quần thể tế bào chết hoàn toàn bậc Dựa sở này, kết luận mơi trường SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 41 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX chọn lọc phù hợp để chọn lọc sau chuyển gen mơi trường có bổ sung 1,0mg/ml G418 3.3 Kết xây dựng qui trình chuyển gen vào tế bào CHO Lipofectamine 3.3.1 Kết so sánh môi trường phục hồi Như đề cập, việc sử dụng huyết động vật nuôi cấy tế bào không khuyến khích nhiều tác động tiêu cực Vì lý đó, nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm tìm kiếm giải pháp để loại bỏ hồn tồn việc sử dụng huyết mà nuôi cấy tế bào với hiệu cao Trong thời gian gần đây, dịch môi trường nuôi cấy tế bào (Conditioned Medium - CM) thử nghiệm sử dụng ni cấy tế bào qui mơ phịng thí nghiệm thay cho huyết động vật môi trường không huyết thương mại khác[34] Trong nghiên cứu này, mơi trường có bổ sung 10% CM so sánh với mơi trường có bổ sung 20% huyết thai bò - FBS khả phục hồi tế bào sau chuyển gen Quần thể tế bào chuyển gen plasmid control pEGFP_N1 mang gen mã hóa cho protein GFP gen kháng kháng sinh G418 theo qui trình tương tự Kết theo dõi tỉ lệ sống 23 ngày quần thể tế bào CHO DG44 CHO K1 sau chuyển gen trình bày hình 3.10 3.11 100% 80% 60% FBS 40% CM 20% 0% day day 15 day 17 day 23 Hình 3.10 Tỉ lệ sống quần thể tế bào CHO DG44 sau chuyển gen - Thí nghiệm so sánh môi trường phục hồi SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 42 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 100% 80% 60% FBS 40% CM 20% 0% day day 15 day 17 day 23 Hình 3.11 Tỉ lệ sống quần thể tế bào CHO K1 sau chuyển gen - Thí nghiệm so sánh mơi trường phục hồi Kết theo dõi tỉ lệ sống tế bào cho thấy hiệu phục hồi tổn thương sau chuyển gen trì sống loại mơi trường tương đương dịng tế bào CHO DG44 CHO K1 Để kiểm tra ảnh hưởng môi trường phục hồi đến tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào sau chuyển gen, mẫu dịch tế bào kiểm tra FACS sau thời gian phục hồi (ngày thứ 7) sau kết thúc giai đoạn chọn lọc (ngày thứ 22) Kết kiểm tra tỉ lệ tế bào biểu hiệnGFP quần thể tế bào trình bày hình 3.12 3.13 100% 90% 80% 63.16% 70% 58.17% 60% 50% FBS 40% 30% C.M 20.24% 21.51% 20% 10% 0% day7 day22 Hình 3.12 Tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào DG 44 - Thí nghiệm so sánh môi trường phục hồi SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 43 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 50% 45% 38.36% 40% 35% 30% 28.45% 25.97% 26.25% 25% FBS 20% C.M 15% 10% 5% 0% day7 day22 Hình 3.13 Tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào CHO K1 - Thí nghiệm so sánh mơi trường phục hồi Kết kiểm tra cho thấy tương đồng tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào CHO phục hồi môi trường bổ sung CM FBS hai dòng tế bào Tuy khơng có nhiều khác biệt so sánh loại môi trường phục hồi, tỉ lệ sống quần thể tế bào CHO DG44 lại giảm dần theo thời gian, tỉ lệ sống quần thể tế bào CHO K1 tiếp tục tăng đến kết thúc chọn lọc Tuy nhiên, quần thể tế bào CHO DG44 có tỉ lệ tế bào cịn sống sót thấp (khoảng 60%) lại có lượng lớn (63,16%) tế bào biểu thành công gen GFP Hiện tượng diễn quần thể tế bào phục hồi môi trường bổ sung CM FBS nên nguyên nhân khó liên quan đến thành phần môi trường phục hồi Trong trình chọn lọc, xuất tế bào hệ sau biểu gen GFP không biểu gen kháng kháng sinh nên bị đào thải môi trường chọn lọc, dẫn đến tỉ lệ sống quần thể giảm dần Đến cuối q trình chọn lọc, quần thể có tỉ lệ tế bào sống không lý tưởng, tế bào cịn sống sót khẳng định tế bào biểu protein mục tiêu ổn định Từ kết này, kết luận mơi trường bổ sung 10% CM có hiệu phục hồi tương đương với môi trường bổ sung 20% FBS khơng có ảnh hưởng tiêu cực đến hiệu biểu gen quần thể tế bào Dựa vào sở này, việc sử dụng môi trường bổ sung CM sử dụng thay cho mơi trường bổ sung FBS để phục hồi tế bào Kết đáp ứng kỳ vọng ban đầu, tiền đề để xây dựng qui trình chuyển gen ni cấy tế bào không sử dụng huyết động vật SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 44 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp 3.3.2 Kết so sánh Tỉ lệ Lipofectamine LTX:DNA liều lượng DNA Như đề cập, q trình chuyển gen dù hay nhiều có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe tế bào chủ Sử dụng Lipofectamine làm nhân tố chuyển gen cần phải khống chế lượng Lipofectamine vừa đủ để không đầu độc khiến quần thể tế bào khơng thể sống sót sau chuyển gen Bên cạnh đó, lượng Lipofectamine sử dụng cho phản ứng phụ thuộc vào liều lượng DNA sử dụng Quá DNA cho tế bào không bảo đảm hiệu chuyển gen tốt Trong đó, nhiều DNA cải thiện tỉ lệ tế bào chuyển gen quần thể, chạm mức bão hòa tạp áp lực lên quần thể tế bào, đồng thời khơng có lợi kinh tế Vì lý đó, việc thiết kế qui trinh chuyển gen, cần xác định rõ liều lượng DNA nhỏ nên sử dụng cho tế bào, với tỉ lệ Lipofectamine :DNA hợp lý để đạt hiệu chuyển gen cao mà khơng lãng phí DNA Lipofectamine, đồng thời có quần thể tế bào sau chuyển gen khỏe mạnh Để chọn tỉ lệ tối thích cho trình chuyển gen hiệu quả, thực phản ứng chuyển gen plasmid control pEGFP_N1 với liều lượng DNA tỉ lệ Lipofectamine khác Liều lượng DNA sử dụng cho giếng thử nghiệm so sánh 0,5g DNA, 1g DNA 2g DNA Song song đó, tỉ lệ Lipofectamine LTX:DNA khác 2:1 3:1 so sánh 40% 31.05% 35% 24.17% Day2 DG44 30% Day2 CHOK1 25% 20.48% 24.03% 17.47% 20% 10.87% 10.08% 15% 10% 5% 24.32% 2.89% 2.36% 4.47% 2.58% 0% DNA (μg) 0,5 0,5 1 2 LTX (μl) 1,5 6 Tỉ lệ LTX:DNA 2:1 3:1 2:1 3:1 2:1 3:1 Hình 3.14 Tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào sau ngày -Thí nghiệm chọn lọc tỉ lệ Lipofectamine LTX:DNA liều lượng DNA SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 40% 35% Day6 DG44 30% Day6 CHOK1 25% 19.59% 16.60% 14.54% 16.11% 20% 15% 10% 5% 1.77%1.78% 11.00% 7.24% 2.29%2.94% 17.83% 10.14% 0% DNA (μg) 0,5 0,5 1 2 LTX (μl) 1,5 6 Tỉ lệ LTX:DNA 2:1 3:1 2:1 3:1 2:1 3:1 Hình 3.15 Tỉ lệ biểu GFP quần thể tế bào sau ngày -Thí nghiệm chọn lọc tỉ lệ Lipofectamine LTX:DNA liều lượng DNA Thí nghiệm thực lần Có thể nhận thấy hiệu chuyển gen GFP giảm đáng kể thời gian từ ngày phục hồi sau chuyển gen đến ngày phục hồi Đây kết việc gen GFP biểu tạm thời không di truyền cho tế bào hệ sau Cùng với tăng sinh quần thể tế bào giai đoạn phục hồi, tỉ lệ tế bào hệ sau khả sản xuất GFP tăng dần theo thời gian, tỉ lệ tế bào biểu protein GFP lúc giảm Từ biểu đồ trên, xu hướng phát triển chung tỉ lệ tế bào biểu GFP sau chuyển gen ngày ngày mẫu tế bào CHO DG44 quan sát thấy Tỉ lệ đạt mức cao mẫu số 4, sau giảm dần mẫu số số Đối với tế bào CHO K1, vào ngày thứ tỉ lệ mẫu số đạt mức cao Đến ngày thứ 6, tỉ lệ tế bào biểu GFP mẫu số lại cao Từ kết thí nghiệm, kết luận để đạt hiệu chuyển gen GFP cao tế bào DG44, tỉ lệ phù hợp 1g DNA : 3l LipofectamineTM LTX cho giếng có mật độ chuyển gen 200.000 tế bào Đối với tế bào CHO K1, tỉ lệ phù hợp 2g DNA : 4l LipofectamineTM LTXcho giếng mật độ chuyển gen 200.000 tế bào SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 46 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 3.3.3 Kết xây dựng qui trình chuyển gen Như vậy, dựa sở kết thí nghiệm trên, qui trình chuyển gen xây dựng để ứng dụng vào cơng tác tạo dịng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab sau: - - Với 200.000 tế bào giếng đĩa 24 giếng, sử dụng 300l dịch tế bào 1g DNA l Lipofectamine giếng tế bào CHO DG44; 2g DNA 4l Lipofectamine giếng tế bào CHO K1 Với môi trường phục hồi môi trường dinh dưỡng bổ sung 10% Conditioned medium đặc dụng cho dòng tế bào, phục hồi tế bào sau chuyển gen ngày Sau phục hồi, tế bào chọn lọc môi trường chọn lọc bổ sung 1mg/ml G418 Có vector có chất lượng chuyển gen tốt sở để thu quần - thể tế bào có tỉ lệ biểu kháng thể cao Việc so sánh chứng thực hiệu phục hồi mơi trường có bổ sung dịch môi trường nuôi cấy sở để thay hồn tồn FBS dịch mơi trường ni cấy 3.4 Kết tạo dịng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab Đoạn gen mã hóa chuỗi nhẹ Plasmid Plasmid pNIC2_MAR_GFP (clone 6) pNIC2_MAR_GFP (clone 6) Phản ứng cắt nối DNA Phản ứng cắt nối DNA pNIC2_MAR_NIVL Đoạn gen mã hóa chuỗi nặng pNIC2_MAR_NIVH Đồng chuyển gen Tế bào CHO Phục hồi ngày chọn lọc kháng sinh 12 ngày Dòng tế bào CHO biểu ổn định kháng thể Nivolumab Hình 3.16 Sơ đồ tạo dòng tế bào CHO biểu ổn định kháng thể Nivolumab SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 47 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX Dựa theo kết chọn lọc điều kiện tối thích trên, sử dụng vector pNIC2_MAR_NIVH pNIC2_MAR_NIVL áp dụng qui trình chuyển gen hoàn thiện xây dựng để chuyển gen kháng thể Nivolumab nhằm tăng khả biểu sản xuất kháng thể Nivolumab Để tế bào biểu kháng thể Nivolumab hồn chỉnh, vector chuyển lúc vào quần thể tế bào sử dụng phương pháp đồng chuyển với tỉ lệ Q trình tạo dịng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab trình bày hình 3.16 Đến thời điểm tại, quần thể tế bào CHO K1 CHO DG44 mang gen sản xuất kháng thể Nivolumab vượt qua trình chọn lọc kéo dài 12 ngày Những tế bào cịn sống sót khỏe mạnh giữ mơi trường dinh dưỡng có nồng độ kháng sinh thấp (0,1mg/ml G418) để trì áp lực chọn lọc SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 48 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Trong phạm vi đề tài, kết đạt gồm có: • Thiết kế biểu thành công plasmid tái tổ hợp pNIC2_MAR_GFP có cài đoạn trình tự MAR Plasmid thể hiệu chuyển gen cao plasmid gốc pNIC2_GFP, chứng minh tác dụng nâng cao hiệu chuyển gen chuỗi trình tự MAR • Sử dụng plasmid pNIC2_MAR_GFP để thiết kế thành công vector chuyển gen kháng thể Nivolumab, gồm có vector: pNIC2_MAR_NIVH mang gen chuỗi nặng pNIC2_MAR_NIVL mang gen chuỗi nhẹ • So sánh chọn lọc điều kiện chuyển gen vào tế bào CHO sau: − Với 200.000 tế bào/300l dịch tế bào giếng đĩa 24 giếng, sử dụng 1g DNA l Lipofectamine giếng tế bào CHO DG44 2g DNA l Lipofectamine giếng tế bào CHO K1 − Sử dụng mơi trường có bổ sung 10% môi trường nuôi cấy để phục hồi tế bào sau chuyển gen • Ứng dụng kết để chuyển gen Nivolumab cho dòng CHO DG44 CHO K1, thành công tạo quần thể tế bào CHO biểu ổn định kháng thể Nivolumab 4.2 Đề nghị Đề tài dừng lại bước biểu ổn định kháng thể Nivolumab quần thể tế bào sau chọn lọc Để tiếp tục phát triển kết đạt được, đề nghị tiến hành kiểm tra định lượng kháng thể Nivolumab ELISA, nhuộm kháng thể huỳnh quang, … Sau định lượng, xác định quần thể có sản lượng sản xuất kháng thể cao (tính tế bào) Tiếp sau cơng tác tạo dịng đơn phương pháp pha lỗng tới hạn để đạt dịng đơn bào sản xuất kháng thể đơn dòng Sau đạt dòng tế bào sản xuất kháng thể Nivolumab đơn dòng, tiếp tục q trình tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào môi trường, chất bổ sung, nhiệt độ, điều kiện lắc, … để đạt hiệu suất sản xuất cao Công tác cuối thiết SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 49 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX lập qui trình tinh kháng thể từ dịch ni tế bào Bên cạnh đó, qui trình chuyển gen phát triển cho việc tạo dịng tế bào sản xuất kháng thể Nivolumab thử nghiệm ứng dụng cho tạo dòng biểu protein kháng thể khác SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 50 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] J.-L Adrio and A L Demain, “Recombinant organisms for production of [2] industrial products.,” Bioengineered bugs, vol 1, no 2, pp 116–31, 2010 R Kunert and D Reinhart, “Advances in recombinant antibody manufacturing.,” Applied microbiology and biotechnology, vol 100, no 8, pp 3451–61, Apr 2016 [3] R M Bill, “Playing catch-up with Escherichia coli: using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments,” Frontiers in [4] Microbiology, vol 5, p 85, Mar 2014 G T Wurz, C.-J Kao, and M W DeGregorio, “Novel cancer antigens for personalized immunotherapies: latest evidence and clinical potential,” [5] Therapeutic Advances in Medical Oncology, vol 8, no 1, pp 4–31, 2015 M Derouazi et al., “Genetic characterization of CHO production host DG44 and derivative recombinant cell lines,” Biochemical and Biophysical Research [6] [7] [8] Communications, vol 340, no 4, pp 1069–1077, Feb 2006 Invitrogen, “Cell Culture Basics Handbook,” ThermoFisher Scientific Inc., pp 1–61, 2010 J.-M Kim et al., “Improved recombinant gene expression in CHO cells using matrix attachment regions.,” Journal of biotechnology, vol 107, no 2, pp 95– 105, 2004 S C Makrides, Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier Science, 2003 S M Browne and M Al-Rubeai, “Selection methods for high-producing mammalian cell lines,” Trends in Biotechnology, vol 25, no 9, pp 425–432, 2007 [10] S Sou, K Polizzi, and C Kontoravdi, “Evaluation of transfection methods for transient gene expression in Chinese hamster ovary cells,” Advances in Bioscience and …, vol 4, no December, pp 1013–1019, 2013 [11] J Sunshine and J M Taube, “PD-1/PD-L1 inhibitors,” Current Opinion in Pharmacology, vol 23, pp 32–38, 2015 [9] [12] S Viteri, M González-Cao, F Barrón, A Riso, and R Rosell, “Results of clinical trials with anti-programmed death 1/programmed death ligand inhibitors in lung cancer.,” Translational lung cancer research, vol 4, no 6, pp SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 51 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX 756–62, 2015 [13] A Swaika, W A Hammond, and R W Joseph, “Current state of anti-PD-L1 and anti-PD-1 agents in cancer therapy,” Molecular Immunology, vol 67, no 2, pp 4–17, 2015 [14] P N Nelson, G M Reynolds, E E Waldron, E Ward, K Giannopoulos, and P G Murray, “Monoclonal antibodies.,” Molecular pathology : MP, vol 53, no 3, pp 111–7, Jun 2000 [15] R A Weinberg, “The Biology and Genetics of Cells and Organisms,” The Biology of Cancer, 2013 [16] S Schlatter, S H Stansfield, D M Dinnis, A J Racher, J R Birch, and D C James, “On the optimal ratio of heavy to light chain genes for efficient recombinant antibody production by CHO cells,” Biotechnol Prog, vol 21, no 1, pp 122–133, 2005 [17] G Köhler and C Milstein, “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.,” Nature, vol 256, no 5517, pp 495–7, Aug 1975 [18] M Clark, S Cobbold, and G Hale, “Advantages of rat monoclonal antibodies,” Immunology today, 1983 [19] R A Weinberg, “Cellular oncogenes,” Trends in Biochemical Sciences, vol 9, no 4, pp 131–133, 1984 [20] M Hejmadi, Introduction to Cancer Biology 2010 [21] S Muenst, H L??ubli, S D Soysal, A Zippelius, A Tzankov, and S Hoeller, “The immune system and cancer evasion strategies: Therapeutic concepts,” Journal of Internal Medicine, vol 279, no 6, pp 541–562, 2016 [22] A Swaika, W A Hammond, and R W Joseph, “Current state of anti-PD-L1 and anti-PD-1 agents in cancer therapy,” Molecular Immunology, vol 67, no 2, pp 4–17, 2015 [23] Z Betts and A J Dickson, “Assessment of UCOE on Recombinant EPO Production and Expression Stability in Amplified Chinese Hamster Ovary Cells,” Molecular Biotechnology, vol 57, no 9, pp 846–858, 2015 [24] N E Lewis et al., “Genomic landscapes of Chinese hamster ovary cell lines as revealed by the Cricetulus griseus draft genome,” Nature Biotechnology, vol 31, no 8, pp 759–765, Jul 2013 [25] S Sou, K Polizzi, and C Kontoravdi, “Evaluation of transfection methods for transient gene expression in Chinese hamster ovary cells,” Advances in SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 52 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX Bioscience and …, vol 4, no December, pp 1013–1019, 2013 [26] S C G Brezinsky et al., “A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity,” Journal of Immunological Methods, vol 277, no 1–2, pp 141–155, 2003 [27] M Hyv, “Guide to expression construct cloning,” pp 1–16, 2004 [28] M A Hunt, M J Currie, B A Robinson, and G U Dachs, “Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents.,” Journal of biomolecular techniques : JBT, vol 21, no 2, pp 66–72, Jul 2010 [29] C Masson, V Escriou, M Bessodes, and D Scherman, “Lipid reagents for DNA transfer into mammalian cells,” New Comprehensive Biochemistry, vol 38, pp 279–289, 2003 [30] Bio-Rad, “Transfection Methods Overview,” Bio-Rad Laboratories, pp 1–41, 2013 [31] Lonza, “Guideline for Generation of Stable Cell Lines Technical Reference Guide,” Bioresearch, vol 49, no 0, pp 1–8, 2004 [32] Y Lim, N S C Wong, Y Y Lee, S C Y Ku, D C F Wong, and M G S Yap, “Engineering mammalian cells in bioprocessing - current achievements and future perspectives.,” Biotechnology and applied biochemistry, vol 55, no 4, pp 175–89, Apr 2010 [33] G Gstraunthaler, “Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture.,” ALTEX, vol 20, no 4, pp 275–81, 2003 [34] Z Hannoun et al., “The Comparison between Conditioned Media and SerumFree Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation,” Cellular Reprogramming (Formerly “Cloning and Stem Cells”), vol 12, no 2, pp 133–140, Apr 2010 [35] P Dowling and M Clynes, “Conditioned media from cell lines: A complementary model to clinical specimens for the discovery of disease-specific biomarkers,” PROTEOMICS, vol 11, no 4, pp 794–804, Feb 2011 [36] M R Soboleski, J Oaks, and W P Halford, “Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells.,” FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, vol 19, no 3, pp 440–2, Mar 2005 [37] Y W Chu, R Wang, I Schmid, and K M Sakamoto, “Analysis with flow cytometry of green fluorescent protein expression in leukemic cells.,” SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 53 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX Cytometry, vol 36, no 4, pp 333–9, 1999 [38] N V H Nguyễn Hải Hà, Lê Thị Thu Hiền, “Biểu protein huỳnh quang xanh (GFP) tế bào động vật có vú ni cấy,” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, vol 7, no 3, pp 313–318, 2009 [39] N Harraghy, A Regamey, P.-A Girod, and N Mermod, “Identification of a potent MAR element from the mouse genome and assessment of its activity in stable and transient transfections,” Journal of Biotechnology, vol 154, no 1, pp 11–20, 2011 [40] P.-A Girod and N Mermod, “Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production,” New Comprehensive Biochemistry, vol 38, pp 359–379, 2003 [41] K Petersen, R Leah, S Knudsen, and V Cameron-Mills, “Matrix attachment regions (MARs) enhance transformation frequencies and reduce variance of transgene expression in barley.,” Plant molecular biology, vol 49, no 1, pp 45– 58, May 2002 [42] BD Biosciences Singapore, “BD FACSCaliburTM | Cell Analyzer | BD Biosciences.” [Online] Available: http://www.bdbiosciences.com/sg/instruments/facscalibur/index.jsp [Accessed: 06-May-2017] [43] S Tanaka, S Mitsuda, N Shimizu, K Aoyagi, and M Nishigaki, “How a Replication Origin and Matrix Attachment Region Accelerate Gene Amplification under Replication Stress in Mammalian Cells,” PLoS ONE, vol 9, no 7, p e103439, Jul 2014 SVTH: Trương Thị Thùy Châu - 12SH GVHD: ThS Nguyễn Mai Khôi; TS.Bruce May TRANG 54 ... NGHIỆP: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX TÓM TẮT Tên đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX - Ứng dụng tạo dòng tế bào. .. Nivolumab 2) Xây dựng qui trình chuyển gen tế bào CHO sử dụng LipofectamineTM LTX có hiệu chuyển gen cao 3) Ứng dụng vector tạo qui trình xây dựng để tạo dòng tế bào CHO biểu kháng thể Nivolumab. .. qui trình chuyển gen tế bào CHO LipofectamineTM LTX THĂM DÒ NỒNG ĐỘ KHÁNG SINH CHỌN LỌC TẠO DÒNG PLASMID MANG GEN KHÁNG THỂ NIVOLUMAB XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO CHO ỨNG DỤNG TẠO DÒNG