3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.5.ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo:
- Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Thí nghiệm 1.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non và mẫu lá non cây hoa Cúc CN01
* Thí nghiệm 1a. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc CN01
Mẫu cây Cúc CN01 do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp, sau đó đƣợc nhân lên trong môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS để tạo ra nguồn nguyên liệu đủ để thực hiện các thí nghiệm sắp đƣợc tiến hành.
Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúc in vitro đạt chiều cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt lấy chồi đỉnh (chiều dài khoảng 2 - 2,5 cm) cắt loại bỏ lá, thu mẫu đốt thân (mỗi mẫu có chiều dài khoảng 1cm). Sau đó đem mẫu cấy vào môi trƣờng dinh dƣỡng.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân
non câyhoa Cúc nhật CN01
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 0,7 + NAA 0,1 CT3 BAP 0,7 + NAA 0,3 CT4 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10%
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian thí nghiệm kéo dài trong 5 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo.
- Số mẫu không tạo ra mô sẹo.
- Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100.
- Độ xốp của mô sẹo.
* Thí nghiệm 1b. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01
Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúcin vitro cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt đỉnh sinh trƣởng (chiều dài khoảng 2 - 2,5cm) cắt thu mẫu lá (chọn những lá non, gần đỉnh sinh trƣởng, khoảng 3 - 4 lá mới gần đỉnh sinh trƣởng nhất).
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, Ki, 2,4 - D, IAA với nồng độ thay đổi đƣợc thể hiện trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá noncây
hoa Cúc nhật CN01
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 2,4-D 1,0 CT3 2,4-D 2,0 CT4 2,4-D 1,5 CT5 2,4-D 0,5+ Ki 0,2 CT6 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 CT7 2,4-D 1,5 + Ki 0,2 CT8 2,4-D 2,0 + Ki 0,2 CT9 BAP 0,7 +NAA 0,1 CT10 BAP 1,0 +NAA 0,3 CT11 BAP 1,0 +IAA 0,1 CT12 BAP 0,5 CT13 BAP 0,7 CT14 BAP 1,0 Chia làm 4 nhóm:
- Nhóm 1 (N1): Ảnh hƣởng của 2,4 - D đến khả năngcảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 2-4).
- Nhóm 2 (N2): Ảnh hƣởng của 2,4 - D kết hợp với Ki đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 5-8).
- Nhóm 3 (N3): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 9-10).
- Nhóm 4 (N4): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với IAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT11).
- Nhóm 5 (N5): Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 12- 14).
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian nuôi cấy và theo dõi thí nghiệm trong 5 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo.
- Số mẫu không tạo ra mô sẹo.
- Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100.
- Độ xốp của mô sẹo.
- Dạng mô sẹo đƣợc tạo thành.
* Thí nghiệm 2. Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01
Sau khi tạo ra đƣợc các khối mô sẹo, ta tiến hành chọn những khối mô sẹo sinh trƣởng, phát triển nhanh, có màu xanh lá để sử dụng trong thí nghiệm tạo dòng tế bào.
Sử dụng khối mô sẹo vừa đƣợc lựa chọn, loại bỏ hết agar, tách cẩn thận, nhẹ nhàng ra thành những mảnh môcó kích thƣớc nhỏ, đem nuôi trong môi trƣờng lỏng: MS + 30g/l sacharose và có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, nƣớc dừa với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc
nhật CN01
Công thức Nổng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)
CT1 (ĐC) MS
CT2 BAP 0,7
CT3 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT4 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 1,0 + nƣớc dừa 10%
Cần lƣợng mô sẹo khá lớn 2 - 3 g/100ml dung dịch môi trƣờng (Helgeson, 1979). Đặt bình nuôi cấy trên máy lắc, lắc với tốc độ 120 - 150 vòng/phút.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, đánh giá thí nghiệm sau 3 tuần nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Màu sắc tế bào huyền phù
- Sự nhân lên của các tế bào mô sẹo đƣợc nuôi trong dung dich huyền phù.
* Lƣu ý: thể tích dịch nuôi cấy trong bình chỉ chiếm khoảng 20% tổng thể tích bình.
* Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào)
Sau khi tạo đƣợc dòng tế bào huyền phù, tiến hành thu nhận các tế bào, khối tế bào trong dung dịch huyền phù. Chọn lấy những khối tế bào có màu xanh, đem nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung một số chất điều
hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, Ki, NAA, IAA với nồng độ thay đổi nhƣ trong bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù
(tế bào, cụm tế bào)
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,1 CT3 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,3 CT4 BAP 1,0 + Ki 0,2 + IAA 0,2 CT5 BAP 0,7 + Ki 0,2 + IAA 0,2 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình 5 mẫu. đánh giá thí nghiệm sau 20 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Màu sắc mô sẹo
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. CẢM ỨNG TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU ĐỐT THÂN NON VÀ MẪU LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để có thể tạo dòng tế bào huyền phù, nguồn nguyên liệu không thể thiếu là mô sẹo. Vì vậy, trƣớc tiên, ta tiến hành thí nghiệm nghiên cứu tìm ra môi trƣờng thích hợp để tạo ra nguồn nguyên liệu này, tiến hành trên hai đối tƣợng đó là: mẫu thân non, và mẫu lá non cây hoa cúc nhật CN01.
3.1.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01
Sau 2 tuần nuôi cấy, đoạn thân bắt đầu cảm ứng hình thành mô sẹo ở tại vị trí vết cắt tiếp xúc với môi trƣờng, sau đó mô sẹo bắt đầu phát triển rộng ra tạo thành một khối có màu vàng nhạt, cứng.
Kết quả theo dõi cho thấy ở thời điểm 3 tuần sau khi cấy, sự bổ sung BAP và NAA, cũng nhƣ tƣơng tác giữa các nồng độ BAP và nƣớc dừa có hiệu quả khác biệt rõ lên sự tạo mô sẹo từ đoạn thân non cây cúc CN01. Tỷ lệ tạo mô sẹođạt 100% không khác biệt giữa các công thức bổ sung BAP nồng độ 0,7 mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l và 0,3 mg/l, nhƣng có sự khác biệtso với các công thức khác. Môi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 0,5 - 0,7 mg/l kết hợp với nƣớc dừa 10% có sự tạo mô sẹo nhƣng với tỷ lệ thấp hơn, và ở môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS thì không có sự cảm ứng tạo mô sẹo.
A. BAP 0,7 + NAA 0,1 B. BAP 0,7 + NAA 0,3
C. BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% D. BAP 0,7 + nƣớc dừa 10%
E. MS
Hình 3.1. Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng lên khảnăng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3
Bảng3.1. Ảnh hưởng của sự kết hợp một số chất điều hòa sinh trưởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu thân non cây hoa Cúc nhật CN01 sau 3 tuần
nuôi cấy
Công thức
Nồng độ phối hợp của các chất điều
hòa sinh trưởng (mg/l) Số mẫu cấy Môi trường nuôi cấy tạo ra mô sẹo Số mẫu tạo mô sẹo Số mẫu không tạo mô sẹo Hiệu quả tạo mô sẹo (%) Độ xốp của mô sẹo CT1( ĐC) MS 30 - 0 30 0 * CT2 BAP 0,7 + NAA 0,1 30 + 30 0 100 Hơi
xốp CT3 BAP 0,7 + NAA 0,3 30 + 30 0 100 Hơi xốp CT4 BAP 0,5 + nƣớc dừa
10% 30 + 10 20 33,33 Cứng CT5 BAP 0,7 + nƣớc dừa
10% 30 + 12 18 40 Cứng
Ghi chú:(*): Không tạo mô sẹo nên không đánh giá độ xốp của mô sẹo.
Qua bảng 3.1 ta thấy ở CT2, CT3 có sự phối hợp giữa BAP nồng độ 0,7 mg/l và NAA nồng độ 0,1 - 0,3 mg/l cho hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu cấy đoạn thân non cây hoa Cúc nhật CN01 cao, đạt tỷ lệ tối đa tới 100% sau 3 tuần nuôi cấy. Mô sẹo có màu vàng nhạt, thành khối, cứng (hình 3.1.A - 3.1.B)
Tuy nhiên, qua quá trình tiếp tục nuôi cấy và theo dõi ở 2 tuần tiếp theo nhận thấy: một số mô sẹo đƣợc tạo thành ở CT2 và CT3 có sự phát triển
hơi xốp (hình 3.1 - 3.2) và ở CT3 có số lƣợng mô sẹo trên nhiều hơn. Nhƣ vậy, ta có thể sử dụng BAP (0,7 mg/l) kết hợp với NAA (0,1 mg/l) để tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây Cúc CN01.
Hình 3.2. Một số hình ảnh mô sẹo được tạo thành ở môi trường BAP 0,7 + NAA 0,1 sau 5 tuần nuôi cấy
Bƣớc sang tuần thứ 6, các mô sẹo đƣợc tạo ra có hiện tƣợng già hóa, khối tế bào màu vàng nhạt chuyển dần sang vàng đậm, tiếp đến hóa nâu rồi chết (hình 3.3).
3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp của một số chất điều hòa sinh trưởng lên hiệu quả tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01
sau 5 tuần nuôi cấy
Công thức
Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng
(mg/l) Số mẫu cấy Môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo Số mẫu tạo mô sẹo Số mẫu không tạo mô sẹo Hiệu quả tạo mô sẹo (%) Độ xốp của mô sẹo Dạng mô sẹo hình thành CT1 (ĐC) MS 30 - 0 30 0 * * CT2 2,4-D 1,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT3 2,4-D 2,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT4 2,4-D 1,5 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT5 2,4-D 0,5+ Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT6 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT7 2,4-D 1,5 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT8 2,4-D 2,0 + Ki 0,2 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT9 BAP0,7 +NAA 0,1 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT10 BAP 0,7 +NAA 0,3 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT11 BAP 0,7 +IAA 0,1 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo rễ CT12 BAP 0,5 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT13 BAP 0,7 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn CT14 BAP 1,0 30 + 30 0 100 Cứng Mô sẹo nhỏ gọn
Đối với thí nghiệm này tôi đã thử trên rất nhiều công thức khác nhau, nhƣng chƣa tìm đƣợc môi trƣờng thích hợp cho việc tạo ra mô sẹo với các đặc điểm: sinh trƣởng phát triển nhanh, có màu xanh, hơi xốp. Để phù hợp cho việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01. Kết quả thể hiện cụ
Qua bảng 3.2 và thực tế quan sát, theo dõi mẫu trong quá trình nuôi cấy nhận thấy:
- Ở môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản CT1, không có sự cảm ứng tạo mô sẹo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ở các công thức còn lại (từ CT2 đến CT14) có sự hình thành khối mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy, cùng là mô sẹo cứng. Tuy nhiên, ở mỗi sự phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau, mô sẹo đƣợc hình thành cũng có những đặc điểm khác nhau:
+ Ở N1: Ảnh hƣởng của 2,4 - D cảm ứng tạo mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3, và sau 4 tuần nuôi cấy thì mô sẹo rễ xuất hiện ở tất cả các công thức thí nghiệm thuộc N1 (hình 3.4 - H). Đặc biệt chú ý tới CT4: Trong quá trình hình thành mô sẹo rễ, ở tuần nuôi cấy thứ 3, thứ 4 diện tích lá cũng nhƣ thể tích khối mô sẹo tăng nhanh, có màu xanh lá, tuy nhiên khối mô sẹo cứng (hình 3.4-B).
+ Ở N2: Môi trƣờng có bổ sung 2,4 - D và Ki cảm ứng tạo mô sẹo nhỏ gọn,với kích thƣớc nhỏ và nhanh chóng chuyển vào giai đoạn già hóa ngay sau khi mô sẹo đƣợc hình thành (hình 3.4 - C). Nhƣ vậy, sự kết hợp của 2,4 - D và Ki dƣờng nhƣ không thích hợp cho việc cảm ứng tạo mô sẹo từ lá.
+ Ở N3: Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung BAP (0,7 mg/l) và NAA (0,1-0,3 mg/l) cảm ứng tạo mô sẹo nhỏ gọn, cứng (hình 3.4 - A).
+ Ở N4: Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BAP (0,7 mg/l) và IAA (0,1 mg/l) cảm ứng tạo mô sẹo bắt đầu ở tuần nuôi cấy thứ 3 (hình 3.4 - E), sau 5 tuần nuôi cấy phát hiện thấy hầu hết trên mỗi khối mô sẹo xuất hiện 1 rễ kéo dài (hình 3.4 - F)
+ Ở N5: Môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung BAP (0,5 - 0,7 - 1,0 mg/l) cảm ứng hình thành mô sẹo ở tuần nuôi cấy thứ 3 (hình 3.4 - D), bƣớc sang
tuần thứ 4 các khối mô sẹo đi vào giai đoạn già hóa, chuyển màu nâu đen và chết dần ở tuần thứ 5 (hình 3.4-G).
A. BAP 0,7 + NAA 0,3 (3 tuần) B. 2,4-D 1,5 (tuần 3)
C. 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 (tuần 3) D. BAP 1,0 (3 tuần)
G. BAP 1,0 (5 tuần) H. 2,4-D 1,0 (4 tuần)
Hình 3.4. Một số hình ảnh trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo từ lá non cây hoa Cúc nhật CN01
3.2. TẠO DÒNG TẾ BÀO HUYỀN PHÙ CÂY HOA CÚC NHẬT CN01
Nhằm mục tiêu chủ động nhân nhanh sinh khối tế bào, nhu cầu nuôi cấy mô sẹo cũng nhƣ dịch huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01 vô cùng cấp thiết. Mặt khác, mô sẹo thƣờng có biểu hiện già hóa nhanh khi nuôi cấy trong môi trƣờng thạch trong thời gian dài. Biểu hiện của già hóa là tế bào chuyển màu vàng nhạt, sang màu vàng đậm, tiếp theo là nâu hóa rồi chết. Hơn nữa, tốc độ tăng sinh khối trên môi trƣờng đặc chậm. Để khắc phục tình trạng này, ta tiến hành tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01.
Sau khi tạo đƣợc mô sẹo, tôi tiến hành lựa chọn những khối mô sẹo có sức sinh trƣởng phát triển nhanh, kích thƣớc tế bào to, có màu xanh lá, hơi xốp để tiến hành sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào này.
Ở giai đoạn này tôi sử dụng môi trƣờng có bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng BAP, BAP kết hợp với nƣớc dừa với các nồng độ khác nhau. Tiến hành thí nghiệm trên môi trƣờng lỏng, lắc nhằm mục đích tạo ra dòng tế bào
chất dinh dƣỡng dễ dàng, vừa có sự trao đổi khí tốt hơn nên trọng lƣợng tế bào tăng rất nhanh, đồng thời đƣợc tách thành những cụm tế bào và tế bào rời trong dung dịch nuôi cấy. Đây chính là dạng khởi đầu của dịch huyền phù tế bào (hình 3.5 - A). Thời gian nuôi cấy và theo dõi trên môi trƣờng lỏng lắc 2 -