3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
1.5.2. Ứng dụng của nuôi cấy invitro trong sản xuất
Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau:
- Tạo ra một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn với diện tích thí nghiệm nhỏ.
- Tạo ra đƣợc nhiều cây con từ mô và cây con của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện đƣợc.
- Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.
- Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học. - Bảo quản nguồn gen quý.
- Sản xuất các hợp chất thứ cấp, các chất có hoạt tính sinh học (Alcaloid, Steroid,…) qua nuôi cấy mô tế bào, một số cây thuốc trên quy mô lớn,… [5], [7].
Trong đó, ứng dụng trong nhân giống cây trồng là lĩnh vực đƣợc quan tâm hơn cả. Nuôi cấy in vitro là một phƣơng pháp nhân giống hữu hiệu nhất trong các phƣơng pháp nhân giống vô tính. Phƣơng pháp này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều, giữ đƣợc đặc tính của cây mẹ, có hệ số nhân giống cao, sớm phát huy đƣợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc, khắc phục đƣợc những điều kiện bất lợi của thời tiết. Phƣơng pháp này đặc biệt tỏ ra hiệu quả hơn với các loài cây khó nhân giống bằng phƣơng pháp hữu tính và các giống quý có số lƣợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh. Theo Murashige (1974) [19], có khoảng 300 loại cây có thể nhân giống bằng các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro. Lợi ích của phƣơng pháp này còn ở chỗ: có thể tạo ra một quần thể với số lƣợng lớn, sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ bị diệt vong, lƣu giữ bảo quản nguồn gen dƣới dạng cây in vitro.
Khả năng ứng dụng dễ thấy nhất của phƣơng pháp nuôi cấy mô thực vật là phục tráng giống cây trồng. Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với
khoai tây, cây ăn quả và nhiều loại cây trồng nhân giống vô tính khác. Đối với khoai tây, bệnh nguy hiểm nhất đó là bệnh virut - một trong những nguyên nhân chính gây nên hiện tƣợng thoái hoá giống. Một số tác giả đã dùng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng tạo đƣợc cây khoai tây không có virut, mang lại hiệu quả rất lớn cho ngành sản xuất khoai tây của thế giới.
Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống đƣợc nâng lên một mức mới khi các nhà khoa học nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách cây nho và cây khoai tây đem cấy chuyển nhiều lần trong ống nghiệm. Việc ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn đã đƣợc thể hiện ở quy mô thƣơng mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao nhƣ chuối, dứa, cà, khoai tây,... và đã có những đóng góp to lớn cho nền nông nghiệp thế giới.
Trong lĩnh vực sản xuất hoa cây cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in vitro và các công nghệ sinh học khác nhƣ: tạo phôi soma, biến dị soma,... đã ngày càng đóng góp rất nhiều vào thị trƣờng Hoa - Cây cảnh trên thế giới. Năm 1985,
kim ngạch của thị trƣờng này ƣớc tính 20 - 25 tỷ USD. Ở Hà Lan, kỹ thuật vi nhân giống trở thành nền tảng của công nghệ hoa và cây cảnh. Năm l987, Thái Lan có 20 công ty tƣ nhân dùng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trên quy môthƣơng mại để sản xuất hoa cắt. Colombia là nƣớc sản xuất hoa Cẩm chƣớng lớn nhất thế giới nhờ công nghệ nuôi cấy in vitro.
Nuôi cấy in vitro đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chọn và nhân giống hiện đại. Bằng phƣơng pháp này, con ngƣời đã xây dựng nên các hệ thống sản xuất giống gốc, cho nhiều loại cây hoàn toàn sạch virut (khoai tây, đu đủ,…)
Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nƣớc đã thành lập và thu đƣợc thành quả đáng kể. Viện Sinh vật - Viện Khoa học Việt Nam đã hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nhƣ lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi,... Tại trƣờng Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây. Tại
hoàn thiện quy trình nhân giống cao su. Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, tế bào trong cả nƣớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa và cây ăn quả.
Nuôi cấy mô thực vật hiện nay đƣợc đƣa vào trong các chƣơng trình chọn giống và nhân giống hiện đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và thực tiễn nông nghiệp. Mở ra mộthƣớng đi mới cho nghiên cứu di truyền học, sinh hoá, sinh lý thực vật. Đặc biệt đem lại những ứng dụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu cây hoa Cúc CN01(Chrysanthmum maximum Seiun – 3)do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN,Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp.
Hình 2.1. Mẫu cây hoa Cúc nhật CN01(Chrysanthmum maximum Seiun – 3)
* Vài nét về giống hoa Cúc nhật CN01
CN01 là giống cúc đơn (Chrysanthmum maximum Seiun – 3). Đây là giống nhập nội của Nhật Bản, đƣợc đƣa ra từ Trung tâm Hoa - Cây cảnh - Viện Di truyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001.
Giống có đặc điểm:
- Thân: cao 70 - 75 cm, cứng, mập, thẳng.
- Bộ lá gọn, dày, màu xanh đậm, có từ 32 - 34 lá.
- Hoa: kép to, màu vàng cam, đƣờng kính hoa từ 10 - 11cm.
- Mật độ: 500.000 - 550.000 cây/ha; khoảng cách: 13×14 cm - 12×14 cm.
- Độ bền hoa cắt: 10 - 12 ngày.
Giống hoa Cúc này đã đƣợc đƣa vào sản xuất thử tại một số vùng trồng hoa ở Hà Nội nhƣ: Phú Thƣợng, Tây Tựu, Quảng An, Vĩnh Phúc một số tỉnh phía Bắc khác nhƣ: Thái Nguyên, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Lào Cai,... Thực tế sản xuất cho thấy: giống CN01 ổn định, sinh trƣởng phát triển tốt, chịu nóng, cho năng suất cao và chất lƣợng tốt, đƣợc các vùng trồng hoa rất ƣa chuộng với diện tích trồng đến năm 2006 là 16,2 ha, mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần chuyển đổi cơ cấu cây trồng một cách bền vững. Tháng 9 năm 2007, giống cúc CN01 đã đƣợc Hội đồng khoa học phê duyệt và đề nghị Bộ Nông nghiệp - Phát triển Nông thôn công nhận chính thức để mở rộng diện tích trong sản xuất, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nƣớc và hƣớng tới xuất khẩu.
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 từ ngày 25/06/2014 - 03/2015.
2.3. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 2.3.1. Dụng cụ thí nghiệm 2.3.1. Dụng cụ thí nghiệm
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi ninon, bình tam giác, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy...
2.3.2. Thiết bị
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Cân kĩ thuật GM612, Đức
Máy đo pH HM30G/TOA, Đức
Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAYAMA, Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan
Máy cất nƣớc hai lần Trung Quốc
Buồng cấy vô trùng AV - 110/TELSTAR Máy khuấy từ gia nhiệt ARE/VELP, Italia Cân phân tích CP224S, Đức
Tủ ấm UNIVERSAL 320R/HETTICH, Đức
2.4. Môi trường nuôi cấy
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) [14]: MS + 30g/l đƣờng sacharose + 7 g/l agar và các chất điều hòa sinh trƣởng. Riêng đối với môi trƣờng lỏng thì không bổ sung agar còn các thành phần dinh dƣỡng khác vẫn giữ nguyên.
- pH môi trƣờng: 5,8.
- Môi trƣờng đƣợc khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1170C trong 15 phút.
2.5. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
Các thí nghiệm đều đƣợc thực hiện trong điều kiện nhân tạo:
- Ánh sáng: các mẫu đều đƣợc nuôi cấy với cƣờng độ chiếu sáng 3000 lux.
- Quang kì: 16 giờ/ngày.
2.6. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
* Thí nghiệm 1.Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non và mẫu lá non cây hoa Cúc CN01
* Thí nghiệm 1a. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc CN01
Mẫu cây Cúc CN01 do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 cung cấp, sau đó đƣợc nhân lên trong môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản MS để tạo ra nguồn nguyên liệu đủ để thực hiện các thí nghiệm sắp đƣợc tiến hành.
Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúc in vitro đạt chiều cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt lấy chồi đỉnh (chiều dài khoảng 2 - 2,5 cm) cắt loại bỏ lá, thu mẫu đốt thân (mỗi mẫu có chiều dài khoảng 1cm). Sau đó đem mẫu cấy vào môi trƣờng dinh dƣỡng.
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân
non câyhoa Cúc nhật CN01
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 0,7 + NAA 0,1 CT3 BAP 0,7 + NAA 0,3 CT4 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10%
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian thí nghiệm kéo dài trong 5 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo.
- Số mẫu không tạo ra mô sẹo.
- Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100.
- Độ xốp của mô sẹo.
* Thí nghiệm 1b. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá non cây hoa Cúc nhật CN01
Sau khi nuôi cấy cây hoa Cúcin vitro cao khoảng 3 - 4 cm ta tiến hành cắt đỉnh sinh trƣởng (chiều dài khoảng 2 - 2,5cm) cắt thu mẫu lá (chọn những lá non, gần đỉnh sinh trƣởng, khoảng 3 - 4 lá mới gần đỉnh sinh trƣởng nhất).
Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng cơ bản: MS + 30 g/l sacharose và 7 g/l agar có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, Ki, 2,4 - D, IAA với nồng độ thay đổi đƣợc thể hiện trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá noncây
hoa Cúc nhật CN01
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 2,4-D 1,0 CT3 2,4-D 2,0 CT4 2,4-D 1,5 CT5 2,4-D 0,5+ Ki 0,2 CT6 2,4-D 1,0 + Ki 0,2 CT7 2,4-D 1,5 + Ki 0,2 CT8 2,4-D 2,0 + Ki 0,2 CT9 BAP 0,7 +NAA 0,1 CT10 BAP 1,0 +NAA 0,3 CT11 BAP 1,0 +IAA 0,1 CT12 BAP 0,5 CT13 BAP 0,7 CT14 BAP 1,0 Chia làm 4 nhóm:
- Nhóm 1 (N1): Ảnh hƣởng của 2,4 - D đến khả năngcảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 2-4).
- Nhóm 2 (N2): Ảnh hƣởng của 2,4 - D kết hợp với Ki đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 5-8).
- Nhóm 3 (N3): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với NAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 9-10).
- Nhóm 4 (N4): Ảnh hƣởng của BAP kết hợp với IAA đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT11).
- Nhóm 5 (N5): Ảnh hƣởng của BAP đến khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ lá (CT 12- 14).
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu. Thời gian nuôi cấy và theo dõi thí nghiệm trong 5 tuần.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Môi trƣờng tạo ra mô sẹo (+), môi trƣờng không tạo ra mô sẹo (-). - Số mẫu tạo ra mô sẹo.
- Số mẫu không tạo ra mô sẹo.
- Hiệu quả tạo mô sẹo (%): (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ tổng số mẫu cấy) × 100.
- Độ xốp của mô sẹo.
- Dạng mô sẹo đƣợc tạo thành.
* Thí nghiệm 2. Tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc nhật CN01
Sau khi tạo ra đƣợc các khối mô sẹo, ta tiến hành chọn những khối mô sẹo sinh trƣởng, phát triển nhanh, có màu xanh lá để sử dụng trong thí nghiệm tạo dòng tế bào.
Sử dụng khối mô sẹo vừa đƣợc lựa chọn, loại bỏ hết agar, tách cẩn thận, nhẹ nhàng ra thành những mảnh môcó kích thƣớc nhỏ, đem nuôi trong môi trƣờng lỏng: MS + 30g/l sacharose và có bổ sung một số chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, NAA, nƣớc dừa với nồng độ thay đổi thể hiện trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo dòng tế bào huyền phù cây hoa Cúc
nhật CN01
Công thức Nổng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)
CT1 (ĐC) MS
CT2 BAP 0,7
CT3 BAP 0,5 + nƣớc dừa 10% CT4 BAP 0,7 + nƣớc dừa 10% CT5 BAP 1,0 + nƣớc dừa 10%
Cần lƣợng mô sẹo khá lớn 2 - 3 g/100ml dung dịch môi trƣờng (Helgeson, 1979). Đặt bình nuôi cấy trên máy lắc, lắc với tốc độ 120 - 150 vòng/phút.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại, đánh giá thí nghiệm sau 3 tuần nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Màu sắc tế bào huyền phù
- Sự nhân lên của các tế bào mô sẹo đƣợc nuôi trong dung dich huyền phù.
* Lƣu ý: thể tích dịch nuôi cấy trong bình chỉ chiếm khoảng 20% tổng thể tích bình.
* Thí nghiệm 3: Tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù (tế bào, cụm tế bào)
Sau khi tạo đƣợc dòng tế bào huyền phù, tiến hành thu nhận các tế bào, khối tế bào trong dung dịch huyền phù. Chọn lấy những khối tế bào có màu xanh, đem nuôi cấy trên môi trƣờng dinh dƣỡng có bổ sung một số chất điều
hòa sinh trƣởng nhƣ BAP, Ki, NAA, IAA với nồng độ thay đổi nhƣ trong bảng 2.4.
Bảng 2.4: Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ dung dịch huyền phù
(tế bào, cụm tế bào)
Công thức Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) CT1 (ĐC) MS CT2 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,1 CT3 BAP 1,0 + Ki 0,2 + NAA 0,3 CT4 BAP 1,0 + Ki 0,2 + IAA 0,2 CT5 BAP 0,7 + Ki 0,2 + IAA 0,2 Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 6 bình, mỗi bình 5 mẫu. đánh giá thí nghiệm sau 20 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Màu sắc mô sẹo
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. CẢM ỨNG TẠO MÔ SẸO TỪ MẪU ĐỐT THÂN NON VÀ MẪU LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01 LÁ NON CÂY HOA CÚC NHẬT CN01
Để có thể tạo dòng tế bào huyền phù, nguồn nguyên liệu không thể thiếu là mô sẹo. Vì vậy, trƣớc tiên, ta tiến hành thí nghiệm nghiên cứu tìm ra môi trƣờng thích hợp để tạo ra nguồn nguyên liệu này, tiến hành trên hai đối tƣợng đó là: mẫu thân non, và mẫu lá non cây hoa cúc nhật CN01.
3.1.1. Cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu đốt thân non cây hoa Cúc nhật CN01
Sau 2 tuần nuôi cấy, đoạn thân bắt đầu cảm ứng hình thành mô sẹo ở tại vị trí vết cắt tiếp xúc với môi trƣờng, sau đó mô sẹo bắt đầu phát triển rộng ra tạo thành một khối có màu vàng nhạt, cứng.
Kết quả theo dõi cho thấy ở thời điểm 3 tuần sau khi cấy, sự bổ sung BAP và NAA, cũng nhƣ tƣơng tác giữa các nồng độ BAP và nƣớc dừa có hiệu quả khác biệt rõ lên sự tạo mô sẹo từ đoạn thân non cây cúc CN01. Tỷ lệ tạo mô sẹođạt 100% không khác biệt giữa các công thức bổ sung BAP nồng độ 0,7 mg/l kết hợp với NAA nồng độ 0,1 mg/l và 0,3 mg/l, nhƣng có sự khác biệtso với các công thức khác. Môi trƣờng có bổ sung BAP nồng độ 0,5 - 0,7