phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao

TÓM LƢỢC Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao” được tiến hành với các nội dung bao gồm phân lập, khảo sát hoạt tính và chọn lọc chủng v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN HIẾU KHÍ PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ VỎ TRÁI CA CAO

MSSV: 3096805

LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, Tháng 12/2013

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Huỳnh Xuân Phong Lê Thị Vân An

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

- -

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban giám đốc Viện NC và PT Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này

Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em rèn luyện trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang– cán

bộ quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm, quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm của Viện NC và PT CNSH đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này Em xin được gửi lời cảm ơn đến các Anh Chị học viên cao học, các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm đã giúp đỡ

em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và ủng hộ em trong suốt quá trình học tập để em có kết quả như ngày hôm nay

Kính chúc Quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp

đỡ quí báo đó!

TÓM LƢỢC

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái

ca cao” được tiến hành với các nội dung bao gồm phân lập, khảo sát hoạt tính và chọn lọc chủng vi khuẩn có khả năng thuỷ phân vỏ trái ca cao, từ đó tiến hành đánh giá khả năng lên men từ dịch thủy phân Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ vỏ trái ca cao, trong đó có 20 chủng vi khuẩn có khả năng tạo vòng tròn thủy phân trên môi trường CMC Hai chủng vi khuẩn PD2 và PD5 tạo vòng tròn thủy phân trên môi trường thạch có đường kính lớn nhất (11,33mm và 11mm) Kết quả khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn PD5 thủy phân vỏ ca cao hiệu quả nhất với hàm lượng đường khử là 2,244 mg/mL sau 5 ngày ủ lắc ở nhiệt độ phòng (28- 32 o C) Hàm lượng protein thu được tương thích với thời gian tối ưu là 226,19 µg/mL Kết quả phân tích PCR cho thấy chủng PD5 thuộc Klebsiella variicola Nghiên cứu cũng cho thấy quá trình lên men dịch thủy phân bằng chủng Saccharomyces cerevisiae đạt hiệu suất tốt, đạt đến 85%

Từ khoá: cellulase, đường khử, Saccharomyces cerevisiae, vỏ trái ca cao, vòng tròn

thủy phân

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM LƯỢC i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH v

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây ca cao và thành phần chính trong vỏ trái ca cao 3

2.1.1 Giới thiệu cây ca cao 3

2.1.2 Các thành phần chính trong vỏ trái ca cao 4

2.2 Tổng quan về cellulose 8

2.2.1 Giới thiệu về cellulose 8

2.2.2 Giới thiệu các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 10

2.3 Ứng dụng enzyme cellulase trên thị trường 12

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 13

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Phương tiện thí nghiệm 15

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 15

3.1.2 Nguyên vật liệu 15

3.1.3 Hóa chất và môi trường 15

3.1.4 Thiết bị - dụng cụ 16

3.2 Phương pháp thí nghiệm 16

3.2.1 Phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 16

3.2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC 17

3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose 18

3.2.4 Khảo sát khả năng phân giải vỏ trái ca cao 19

3.2.5 Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật sinh học phân tử 19

3.2.6 Khảo sát khả năng lên men ethanol 20

3.2.7 Xử lý số liệu, phân tích thống kê 20

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 21

4.2 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC 22

4.3 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose 25

4.4 Khả năng phân giải vỏ trái ca cao 27

4.5 Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật sinh học phân tử 32

4.6 Khả năng lên men ethanol 33

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 42

Phụ lục 1 Phương pháp vi sinh-sinh hóa

Phụ lục 2 Hình ảnh các thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm

Phụ lục 3 Số liệu kết quả thí nghiệm

Phụ lục 4 Kết quả phân tích thống kê

Phụ lục 5 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn

DANH SÁCH BẢNG

Tên bảng Trang

Bảng 1 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông

nghiệp phổ biến 6

Bảng 2 Thành phần môi trường CMC 15

Bảng 3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (M1) 16

Bảng 4 Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 21

Bảng 5 Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn phân giải vỏ trái ca cao 23

Bảng 6 Kết quả quá trình lên men dịch thủy phân vỏ trái ca cao 33

DANH SÁCH HÌNH

Tên hình Trang

Hình 1 Cấu tạo phân tử cellulose (dạng mạch thẳng) 4

Hình 2 Cấu trúc sợi cellulose 5

Hình 3 Các loại đường cấu thành Hemicellulose 7

Hình 4 Các đơn vị cơ bản của lignin 8

Hình 5 Cơ chế quá trình thủy phân cellulose 9

Hình 6 Trichoderma 10

Hình 7 Streptomyces 11

Hình 8 Clostridium 12

Hình 9 Quy trình xác định hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao 17

Hình 10 Đường kính vòng tròn thủy phân sau 3 ngày của chủng PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 25

Hình 11 Đường kính vòng tròn thủy phân của 23 chủng vi khuẩn hiếu khí 26

Hình 12 Hàm lượng protein sinh ra theo thời gian tương ứng với 5 chủng vi khuẩn 27

Hình 13 Đường tăng trưởng của dòng PD2 28

Hình 14 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng glucose sinh ra 28

Hình 15 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hàm lượng glucose sinh ra 29

Hình 16 Hàm lượng glucose sinh ra theo thời gian tương ứng với 5 chủng vi khuẩn 30

Hình 17 Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao của 5 chủng vi khuẩn 31

Hinh 18 Kết quả tra cứu trên BLAST N của dòng PD5 32

Hình 19 Kết quả so sánh trên BLAST N của chủng PD5 so với dòng Klebsiella variicola 33

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt nam có tiềm năng phát triển cây ca cao rất lớn, cây ca cao có ưu thế nổi trội là

có thể trồng xen với nhiều loại cây khác, đồng thời có khả năng chịu hạn, chống xói mòn đất nên rất thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng Tính đến tháng 5 năm

2013, cả nước có khoảng 25.000 ha ca cao, chủ yếu được trồng tại Tây Nguyên, Đông Nam bộ và một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Dự kiến, đến năm 2015 diện tích trồng ca cao sẽ lên đến 60.000 ha và đạt 80.000 ha vào năm 2020 Sản lượng ca cao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015 và 108.000 tấn vào năm 2020 (http://nongnghiep.vn, 18/07/2013) Tuy nhiên sau khi thu hoạch trái ca cao, ngoài phần hạt được người nông dân thu lấy thì phần vỏ ít được sử dụng tới Một phần vỏ trái ca cao này sẽ được chế biến thành phân bón hữu cơ và thức ăn bổ sung cho bò, số ít khác được phơi khô và sử dụng để làm nhiên liệu đốt Tuy nhiên, đối với những hộ trồng ca cao ở quy mô lớn, người ta thường bóc quả tại chỗ, chỉ đưa hạt đóng bao về xưởng xử

lý, phần vỏ thường không được dùng tới và để hoại mục tự nhiên tại vườn Việc này có lợi là giảm công vận chuyển nhưng mặt trái của nó là tạo môi trường dinh dưỡng cho nhiều loại sâu hại gây bệnh phát triển vì vỏ trái ca cao khá giàu dinh dưỡng Vỏ trái ca cao không gây sức ép nghiêm trọng đối với môi trường xung quanh nhưng nếu được tận dụng triệt để thì đây có thể được xem là một nguồn nguyên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn

Tuy vậy, việc sử dụng nguồn nguyên liệu này còn phụ thuộc rất lớn vào sự thủy phân của nó cho ra những loại đường đơn có thể tận dụng được Cellulose có thể được chuyển đổi thành glucose bằng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hóa học, vật lý hoặc enzyme thủy phân Trong đó, phương pháp xử lý cellulose bằng enzyme có

ưu thế hơn so với phương pháp xử lý bằng acid Phản ứng thủy phân cellulose với acid cần một lượng bazơ để trung hòa, điều này làm hao tốn chi phí lên nhiều lần đồng thời phương pháp này còn giải phóng ra các sản phẩm phụ không có lợi cho môi trường Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng enzyme cellulase hoạt động rất có hiệu quả trong việc thuỷ phân mạng lưới cellulose này và giải phóng ra những gốc đường glucose đơn giản Nhờ đó mà lượng đường sinh ra có thể được chuyển đổi thành những sản phẩm có giá trị như butanol, acid amino hay nhiên liệu sinh học như ethanol Ngoài ra enzyme cellulase được sử dụng rất có hiệu quả trong việc chuyển đổi những

chất thải trong các ngành công nghiệp thực phẩm và trong nông nghiệp thành sản phẩm

có giá trị (Bothast và Saha, 1997) Một số nghiên cứu đã cho thấy, tại nơi tiến hành thu hoạch nguyên liệu, nơi mà nguyên liệu tự rã mục và tiếp xúc với đất đã tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phân giải cellulose phát triển tốt (Baig et al., 2003) Đây cũng

chính là tiền đề cho nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí có khả năng tổng hợp cellulase trên cơ chất là vỏ trái ca cao và khảo sát khả năng lên men ethanol từ nguồn nguyên liệu này

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây ca cao và thành phần chính trong vỏ trái ca cao

2.1.1 Giới thiệu cây ca cao

Cây ca cao (Theobroma cacao) có nguồn gốc hoang dại trong các khu rừng nhiệt

đới Trung và Nam châu Mỹ Ca cao là loại cây thường xanh ở tầng trung, cao từ 4-8 m,

ưa bóng rợp, có khả năng chịu bóng tốt nên thường được trồng xen dưới tán cây khác Nguồn gốc của cây ca cao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những người Aztec và Maya bản xứ khám phá Các loài ca cao được trồng rộng rãi trên thế giới là Crillo và Forastero nhưng thường gặp nhất là Trinitario là loài được lai tạo từ 2 loài trên

Hạt ca cao sử dụng làm nguyên liệu chế biến ra các sản phẩm cao cấp như Sô cô

la Ca cao còn là đồ uống thông dụng vì có chất kích thích nhưng lượng caffein thấp hơn

cà phê rất nhiều Vỏ trái sau khi lấy hạt có thể phơi khô xay làm thức ăn cho gia súc Cây không cạnh tranh về đất nhiều vì có thể trồng xen trong các vườn cây có sẵn giúp tăng hiệu quả sử dụng đất

Ở Việt Nam, ca cao được du nhập vào rất sớm, theo chân các nhà truyền giáo phương Tây Hiện tại, cây được trồng rộng rãi ở nhiều nơi, vùng Tây Nguyên vẫn được đánh giá là có điều kiện lý tưởng nhất cho phát triển cây ca cao Ở đây, theo nghiên cứu thống kê thì cây ra hoa cho quả quanh năm, sản lượng bình quân đạt 3 kg hạt khô / 1 cây 5 năm tuổi

Việt Nam có nhiều tiềm năng phát triển cây ca cao do cây ca cao có ưu thế nổi trội

là có thể trồng xen với nhiều loại cây như dừa, điều, hồ tiêu, cà phê, chuối, đồng thời có khả năng chịu hạn, chống xói mòn đất nên rất thích hợp với điều kiện tự nhiên và thổ nhưỡng ở các tỉnh phía Nam và Tây Nguyên Đến cuối năm 2006, diện tích trồng xen cây ca cao đạt hơn 7.300 ha, chủ yếu tập trung ở các tỉnh Bến Tre, Tiền Giang, Bà Rịa - Vũng Tàu, Đắc Lắc, Đắc Nông và Bình Phước Hiện tại, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Việt Nam đã thay đổi kế hoạch trồng ca cao lên đến 60.000 ha vào năm 2015

và 80.000 ha vào năm 2020 Chính phủ đã cam kết đầu tư 40 tỉ đồng để phát triển thị trường ca cao Sản lượng ca cao dự đoán sẽ đạt được khoảng 52.000 tấn vào năm 2015

và 108.000 tấn vào năm 2020 Kế hoạch này sẽ giúp Việt Nam trở thành một trong những nước sản xuất ca cao lớn nhất ở khu vực Đông Nam Á với tổng thu nhập hàng năm xấp xỉ 120 triệu USD vào khoảng năm 2020 (http://www.nhandan.org.vn/, 24/11/2009)

2.1.2 Các thành phần chính trong vỏ trái ca cao

Cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử phổ biến nhất trên trái đất, được tìm thấy chủ yếu

ở vách tế bào thực vật (Wyman et al., 1993) Các hợp chất cao phân tử cellulose có cấu

trúc tinh thể, không phân nhánh và mức độ polymer hóa rất cao từ 2.000 đến 27.000 đơn

vị glucose/phân tử, và được nối với nhau bằng liên kết ß-1,4-glycoside (Sjostrom, 1993) Cellulose không tan trong nước ngay cả khi đun nóng và các dung môi hữu cơ thông thường Tan trong một số dung dịch acid vô cơ mạnh như: HCl, HNO3, một số dung dịch muối: ZnCl2, PbCl2 (www.vi.wikipedia.org, 06/08/2013)

Trong gỗ chứa khoảng 50% cellulose, trong sợi bông vải 97-98%; sợi lanh, sợi gai 81-90%, sợi đay 75%, thân cây họ Cói và họ Lúa khoảng 30-40%

Hình 1 cấu tạo phân tử cellulose (dạng mạch thẳng)

(*Nguồn: http://www.duoclieu.org , ngày 06/08/2013)

Cellulose có cấu tạo dạng sợi, các sợi này liên kết lại với nhau để hình thành một cấu trúc phức tạp gọi là protofibril, các phân tử protofibrin lại kết hợp tạo thành bó microfibril, sau đó các bó microfibril kết hợp với nhau để tạo thành các sợi fiber (Brown

và Saxena, 2000) Các phân tử cellulose trong các protofibril liên kết chặt chẽ với nhau nhờ có rất nhiều liên kết hydro nên cấu trúc phân tử cellulose rất cứng Vì vậy cellulose

là một hợp chất rất khó phân giải (Miettinen-Oinnen, 2004; Pizzi và Eaton, 1985)

Hình 2 Cấu trúc sợi cellulose

(*Nguồn: http://www.bio.miami.edu/ , ngày 06/08/2013)

Trong tự nhiên, hàm lượng cellulose trong các chất khác nhau thì rất khác nhau, không giống như tinh bột, cellulose có cấy trúc dạng tinh thể (Lynd et al., 2002) Các vi sợi cellulose thường không đồng nhất, chúng chia thành 2 vùng chính: vùng kết tinh và vùng vô định hình Vùng kết tinh là vùng có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác động của điều kiện bên ngoài Enzyme cellulase chỉ tác dụng lên bề mặt hệ sợi vùng này Ngược lại, vùng vô định hình lại có cấu trúc không chặc và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ tác động làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của vùng này Bên cạnh dạng cấu trúc tinh thể và

vô định hình, cellulose còn ở dạng sắp xếp không đồng đều Khi đó, sợi cellulose sắp xếp không theo hình dạng nhất định, như thắt nút, xoắn hay tạo ra những lỗ nhỏ làm cho diện tích bề mặt chúng lớn hơn (Lynd et al., 2002; Miettinen-Oinonen, 2004)

Bảng 1 Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp

phổ biến (Betts et al., 1991; Sun và Cheng, 2002)

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)

Hemicellulose

Hemicellulose là polysacaride thường gặp trong vách tế bào thực vật Thông thường, hemicellulose chiếm tỷ trọng khoảng 11-37% trong lượng khô (Sjostrom, 1993) Khác với cellulose, mức độ polymer hóa của hemicellulose thường thấp hơn, khoảng 200 gốc đường nối với nhau, bao gồm β- D glucan, polygalacturonan và một số loại đường đa như galactose, mannose, arabinoglucurono và xylose (Howard et al., 2004) Các loại đường có trong hemicellulose gồm đường 6 carbon: D- glucose, D- galactose, D- glucuronic, acid 4-O-methyl-d-glucuronic, acid D- galacturonic và mannose; đường 5 carbon gồm xylose và L- arabinose, L-rhamnose, L- fucose và các loại đường có nhóm O-methyl (Howard et al., 2004; Obembe et al., 2006; Ohgren et al., 2006; Richard, 1996)

Hình 3 Các loại đường cấu thành hemicellulose

(http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/FUNDAMNT/hemicel.gif)

Do không ở dạng cấu trúc tinh thể, độ polymer thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý cũng thấp hơn Chính vì vậy mà hemicellulose dễ dàng bị thủy phân bằng acid và base loãng hơn cellulose (Howard et al., 2003)

Lignin

Lignin chiếm khoảng 30% lượng carbon trong khí quyển và là hợp chất polymer sinh học lớn thứ hai trên trái đất Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm

thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật (Boerjan et al., 2003; Dam et al., 2008) Lignin có chức năng là nâng đỡ thành tế bào, giữ cho chúng khỏi bị sụp đổ Số lượng và thành phần của lignin trong tế bào phụ thuộc nhiều vào mức độ tiến hóa, loại tế bào, giai đoạn phát triển và môi trường xung quanh (Howard et al., 2003; Lewis và Yamonoto, 1990)

Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình (McCrady, 1991; Richard, 2008) Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene nối với nhau bởi liên kết C-C Các đơn vị cấu trúc điển hình của lignin là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Lewis và Yamonoto, 1990; Howard et al., 2003)

Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của

nó trong gỗ (Howard et al., 2003; Lewis và Yamonoto, 1990) Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin Ở cây hai lá mầm, những loài gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, loài gỗ cứng chứa chủ yếu guaiacyl và syringyl Cây một lá mầm có hàm lượng p-hydroxylphenyl cao hơn ở cây hai lá mầm (Lewis và Yamonoto, 1990; Howard et al., 2003)

Hình 4 Các đơn vị cơ bản của lignin (Boerjan et al., 2003) 2.2 Tổng quan về cellulase

2.2.1 Giới thiệu về cellulase

Cellulase là định nghĩa chung để chỉ tất cả những enzyme có hoạt tính thủy phân cellulose thành các đơn vị monomeric Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ enzyme có khả năng thủy phân cellulose thì cũng có hoạt tính tương tự như đối với hemicellulose (Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002) Cellulase phân cắt các liên kết β-1,4-

glucosidases của mạng lưới cellulose theo cơ chế thủy phân acid (cho và nhận proton)

Hệ thống enzyme cellulase được chấp nhận rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt động của các loại enzyme sau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose và cellulose phosphorylase (http://en.wikipedia.org, 06/08/2013)

Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Mỗi một loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần phân tử cellulose

Hình 5 Cơ chế quá trình thủy phân cellulose

(*Nguồn: http://en.wikipedia.org/ , ngày 06/08/2013)

Endoglucanases thủy phân các liên kết β-glucosidases của mạng lưới cellulose một cách ngẫu nhiên để sản xuất chuỗi mới Exoglucanases phân cắt những phân tử cellulose được tổng hợp từ enzyme endoglucanases tại các vị trí đầu chuỗi giải phóng ra những phân tử glucose hoặc cellobiose β- glucosidases thủy phân các phân tử cellodextrins và cellobiose thành glucose (Lynd et al., 2002; Howard et al., 2003; Miyamoto, 1997) Oxidative cellulose cắt phân tử cellulose bằng những phản ứng tạo ra các gốc tự do

Cellulose phosphorylase phân cắt các phân tử cellulose thành các monomer bằng cách sử dụng phosphate thay vì sử dụng nước (http://en.wikipedia.org, 06/08/2013)

2.2.2 Giới thiệu các nhóm vi sinph vật phân giải cellulose

Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose gồm các nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn Chúng ta có thể tìm thấy chúng trong đất, phân ủ Tuỳ theo tính chất của chúng, có thể xếp vào 2 nhóm như sau:

a Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện hiếu khí

Ở đất thoáng khí, nấm là thành phần quan trọng trong các vi sinh vật phân giải cellulose, nhất là ở đất ẩm Với xấp xỉ 700 loài nấm Zygomycete, nhưng chỉ một vài

loài thuộc giống Mucor cho thấy có hoạt tính thủy giải cellulose Trái lại, lớp nấm nang,

nấm đảm và nấm bất toàn, mỗi ngành có hơn 15.000 loài, thủy giải mạnh cellulose Nhiều giống nấm thu hút nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ

như: Chaetomium và Helotium (lớp nấm nang); Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và Serpula (nấm đảm); Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (nấm bất toàn) (Lynd et al., 2002; Miyamoto, 1997; Boer et al., 2005) Trong đó, Trichoderma reese

được đánh giá là một trong những loài nấm có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất

và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme cellulose thương phẩm (Bon và

Ferrara, 2007; Rajesh et al., 2008; Haq et al., 2005)

Hình 6 Trichoderma

(*Nguồn: http://www2.ac-lyon.fr/, ngày4/08/2013) Một số vi khuẩn hiếu khí như Cellulomonas, Cellovibrio và Cytophaga có khả

năng phân thủy cellulose cao (Lynd et al., 2002) Xạ khuẩn không giữ vai trò quan trọng

trong quá trình phân giải cellulose, tuy nhiên một số loài trong các chi Streptomyces, Actinomucor cũng có khả năng này (Sukumaran et al., 2005)

Hình 7 Streptomyces

(*Nguồn: http://web.mst.edu , ngày 04/08/2013)

b Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện yếm khí

Ở điều kiện yếm khí, vai trò của nấm và xạ khuẩn không quan trọng, còn vi khuẩn chiếm ưu thế trong điều kiện này Các loại nấm phân giải mạnh cellulose là các giống:

Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces, Orpimomyces và Anaeromyces (Lee, 1997)

Các vi khuẩn phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí phần lớn thuộc chi

Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Butyrivibrio, Acetivibrio và Fibrobacter Các vi khuẩn này thường có khả năng hình thành nội bào tử và chịu được

nhiệt độ cao (McCarter và Whithers, 1994; Wilson, 2008) Hệ thống enzyme phân giải celllulose của vi khuẩn sống kị khí thuộc loại phức tạp (cellulosomes) Cellulsomes hình thành tạo những vị trí nhô lên trên thành tế bào vi khuẩn và chúng là những phức hệ enzyme rất bền vững (Schwarz, 2001)

(*Nguồn: http://microbewiki.kenyon.edu/ , ngày 04/08/2013)

Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải cellulose Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng

độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn kỵ khí sử

dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gen cellulosome không được biểu hiện

do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum (Schwarz,

2001)

2.3 Ứng dụng enzyme cellulase trên thị trường

Cellulase đã được phát hiện và sử dụng nhiều thập niên qua Cellulase được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, thực phẩm, dệt, chất tẩy rửa và trong công nghiệp sản xuất giấy (Xia và Cen, 1999) Với sự cạn kiệt của nguồn nhiên liệu hóa thạch và gia tăng nhu cầu tìm nguồn nhiên liệu thay thế, cellulase ngày càng thu hút được sự chú ý của các nhà nghiên cứu nhằm chuyển hóa phần chất thải chứa cellulose khổng lồ này thành năng lượng có thể sử dụng được

Công nghệ dệt

Cellulase được dùng để làm mềm vải và tạo vẻ bạc màu cho những loại quần áo

vải bông thay vì sử dụng đá bọt theo phương pháp truyền thống (Belghith, 2001)

Chúng hoạt động trên các sợi cellulose để làm giảm độ đậm màu do thuốc nhuộm chàm trên vải Cellulase còn được sử dụng để phân hủy phần vải dư để tạo sản phẩm hoàn chỉnh, đồng thời làm mềm vải và tạo vùng nhiều màu cho vải (Olson, 1990; Cortez et al., 2001; Videbaek, 2000)

Công nghiệp nhuộm

Cellulase là một trong ba nhóm enzyme được ứng dụng nhiều nhất trong công nghiệp dệt Chúng giúp cho vải bông mềm và sáng màu hơn thay thế cho đá bột được dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi

(Belghith, 2001)

Công nghiệp tẩy rửa

Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI thường được dùng làm sạch vải sợi (Clarkson

et al., 2000) Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm mốc: Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum, Humicola insolens,… hoạt động trong

môi trường kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa (Kottwitz và Schambil, 2005) Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy (Uhlig, 1998)

Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc

Cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong dịch chiết dầu oliu (Galante et al., 1998) Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch nha trong sản xuất bia rượu (Barbesgaard et al., 1984) Cellulase cũng được dùng trong dịch chiết carotenoid cho sản xuất chất màu thực phẩm (Pajunen, 1986) Sự điều chế phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và pectinase cải thiện chất lượng dinh dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi (Cinar, 2005)

Công nghiệp sản xuất giấy

Cellulase và hemicellulase đã được sử dụng chuyển đổi bột gỗ thô thành bột gỗ

mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ thống thoát nước trong các nhà máy bột

gỗ (Akhtar, 1994; Prasad et al., 1992) Chúng cũng được dùng sản xuất bột giấy mềm làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh (Hsu và Lakhani, 2002)

Sản xuất nhiên liệu sinh học

Có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của cellulase hiện nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật thành đường glucose và các đường khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng như là nguồn cơ chất sản xuất ethanol và protein đơn bào Hiện nay, sản xuất ethanol từ sinh khối thực vật trải qua quá trính gồm nhiều bước: tiền xử lý loại bỏ lignin, thủy giải cellulose thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 50oC và cuối cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol (Rani et al., 1997)

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Enzyme cellulase đóng vai trò rất quan trọng trong công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm như: thủy phân các nguyên liệu rơm rạ, mạt cưa, vỏ trấu,… để sản xuất glucose, giải quyết ô nhiễm môi trường, sản xuất nhiên liệu sinh học Hiện nay việc sử dụng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để sản xuất phân hữu cơ từ các phụ phẩm nông và công nghiệp đang phát triển mạnh Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước

về vi sinh vật sản sinh cellulase

2.4.1 Trong nước

Ở Việt Nam, có thể kể đến một số nghiên cứu điển hình như: Trịnh Đình Khá et al

(2007) đã tiến hành tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên

khả năng sinh tổng hợp cellulose của chủng Penicilium sp DTQ-HK1 Kết quả cho thấy

sau 120 giờ lên men chìm ở pH 5,5, nhiệt độ 30oC, nuôi lắc 200 vòng/phút trong môi trường CPY sẽ thu được cellulse có hoạt tính mạnh nhất Nguyễn Hữu Quân (2009) đã

tuyển chọn được chủng nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp

glucanase và xác định tính chất lý hóa của enzyme này Đề tài cho thấy glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính cao trong pH 6,0 Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu như đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase Lê Hương Thuỷ et al (2010) đã tiến hành sàng lọc chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng

endo-β-1,4-trong thủy phân bã thải agar Kết quả đã sàng lọc được hai chủng B505 (Bacillus subtilis B-505) và Li (Bacillus lichenformis Li) có hoạt tính phân giải cellulose cao từ 17 chủng

vi sinh vât ban đầu Đồng thời enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng này còn có khả năng thủy phân bã agar rất tốt và mạnh hơn 18% so với chế phẩm cellulase thương mại Đến 2011, họ đã nghiên cứu nghiên cứu tối ưu hoá các điều kiện sinh cellulase ngoại bào trên môi trường lên men công nghiệp đối với 2 giống trên

2.4.2 Ngoài nước

Một số nghiên cứu điển hình về cellulase trên thế giới có thể kể đến bao gồm: Bravery (1968) khảo sát khả năng thủy phân cellulose của vi khuẩn với các nguồn carbon khác nhau như DL-asparagine và dịch trích nấm men trên môi trường cellulose-agar Eriksson và Hollmark (1969) nghiên cứu về động học của enzyme cellulase trên

cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) Baig et al (2005) đã tận dụng những phụ phẩm của cây chuối sau khi thu hoạch (lá, thân), tiến hành thủy phân nguồn phụ phẩn

này thành đường khử bằng cách sử dụng enzyme cellulase từ nấm Trichoderma lignorum Bakare et al (2005) đã phân lập và định tính enzyme cellulase từ một chủng hoang dại và hai chủng đã được gây đột biến của Pseudomonas fluorescens Động lực

học enzyme của ba loại enzyme trên ở pH 6,5-7,0, 35oC lần lượt là 3,6; 3,1 và 5,3 mg/mL Othman et al (2011) đã tiến hành thủy phân vỏ trái ca cao thành ethanol nhiên liệu Kết quả thu được cao nhất khi thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid HCl ở 75oC trong

4 giờ Lượng đường sinh ra sau quá trình thủy phân được lên men bằng nấm men

Saccharomyces cerevisiae ở 30oC Lượng ethanol thu được là 17,3% sau thời gian lên men là 26 giờ

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm CNSH Thực Phẩm và phòng Thí nghiệm Sinh Hóa Viện NC và PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Thời gian thực hiện: từ tháng 07/2013 đến tháng 12/2013

3.1.2 Nguyên vật liệu

- Trái ca cao được thu từ vườn trồng ca cao ở xã Mỹ Ái, huyện Phong Điền, TP Cần Thơ

- Chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae 2.1 (Phòng thí nghiệm CNSH Thực

phẩm, Viện NC và PT Công nghệ Sinh học)

3.1.3 Hóa chất và môi trường: Carboxymethyl cellulose, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, dung dịch glucose, DNS, BSA, acid dichromate,…

Môi trường CMC

Bảng 2 Thành phần môi trường CMC Tên hóa chất Hàm lượng (g/L) Đơn vị

Môi trường Delafield

Bảng 3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (M1) Tên hóa chất Hàm lượng (g/L) Đơn vị

- Dụng cụ: Đĩa petri, ống đong, que cấy, pippet, các loại ống nghiệm, giá để ống

nghiệm, đèn cồn, bình tam giác

- Thiết Bị:

 Nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbi- international, Đức)

 Tủ cấy vô trùng (Microflow, Pháp)

 pH kế (Schott, Đức)

 Tủ ủ vi sinh vật (Inculell 111, Đức)

 Máy đo OD (Hitachi, Nhật)

 Máy vortex (HEIPOLPH, Đức)

 Tủ lạnh (Sanyo, Nhật) và một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao

Nguyên tắc: Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt của

cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh Các chất khác thường đi kèm theo cellulose là hemicellulose, lignin, tinh bột,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid

và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu (AOAC, 1995)

Các bước tiến hành:

Cân cốc phân tích sau khi sấy ở 105oC, 24 giờ Cân 1 g bột vỏ trái ca cao để vào cốc phân tích Cẩn thận lắp cốc vào máy phân tích hàm lượng xơ

Thêm 150 mL dung dịch H2SO4 1,25%

Thêm vào 2-3 giọt dung dịch n- octanol, đun 30 phút

Rút hết dịch trong cốc Lọc và rửa cặn bằng nước nóng 2-3 lần, rút hết dịch

Thêm 150 mL dung dịch NaOH 1,25%

Thêm vào 2-3 giọt dung dịch n- octanol, đun 30 phút

Rút hết dịch trong cốc Lọc và rửa cặn bằng nước nóng 2-3 lần, rút hết dịch

Lọc, tro hóa ở 550-600oC, 24 giờ và đem cân

Hình 9 Quy trình xác định hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao

Khối lượng cellulose được tính theo công thức:

(W2- W1)

% Cellulose = x 100

W Trong đó: W khối lượng mẫu trước khi thủy phân (g)

W1 khối lượng mẫu sau khi thủy phân (g) W2 khối lượng mẫu sau khi tro hóa (g)

3.2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC

Mục đích: Phân lập được những chủng vi khuẩn hiếu khí trên vỏ trái ca cao có khả

năng phát triển trên môi trường CMC

Tiến hành thí nghiệm:

- Chuẩn bị môi trường thạch CMC

- Ngâm vỏ trái ca cao trong nước cất đã được khử trùng Lấy 0,01 mL các dung dịch mẫu tiến hành trải trên đĩa chứa môi trường CMC, lật ngược các đĩa, ủ trong 30o

C cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc

- Quan sát và chọn những khuẩn lạc tiêu biểu tiến hành cấy chuyền vi khuẩn sang đĩa môi trường CMC Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường thạch được lặp lại nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định

- Sau khi được tách ròng, tiến hành kiển tra và mô tả đặc điểm hình thái của từng loại khuẩn lạc, đồng thời kiểm tra sơ bộ hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lam đã khử trùng bằng cồn 96o thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100

- Sau khi tạo được dòng thuần từ nguồn phân lập, tiến hành nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, nhuộm bào tử và phương thức di chuyển

3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân

Mục đích: So sánh hoạt tính thủy phân của các chủng vi khuẩn được phân lập

Tiến hành thí nghiệm:

- Dùng que cấy đã khử trùng chấm vào một khuẩn lạc trên đĩa petri

- Dùng pipette man khuấy trộn đều vi khuẩn trong 300 μL nước cất vô trùng

- Cho 25 μL dịch vi khuẩn vào lỗ đục đã khoét sẵn trên đĩa petri và chờ cho đến khi vi khuẩn đã ngấm hoàn toàn vào môi trường, đậy nắp đĩa và ủ ở 30oC cho đến khi vi khuẩn phát triển tốt

- Nhuộm đĩa bằng thuốc thử Congo red

- Xác định đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn

Chỉ tiêu theo dõi: đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn

3.2.4 Khảo sát khả năng phân giải vỏ trái ca cao

Mục đích: Đánh giá hiệu quả thuỷ phân vỏ trái ca cao của các chủng vi khuẩn trên

cơ chất vỏ trái ca cao

Tiến hành thí nghiệm:

Sử dụng 100 mL môi trường M1 lỏng (1 g vỏ trái ca cao khô/ 100 mL môi trường Delafield) Nguồn giống chủng được nuôi trong môi trường CMC lỏng trong 3 ngày, chủng với tỉ lệ 2%, tiến hành ủ ở 30oC Ngoài khả năng phân giải tốt cellulose, vi khuẩn cũng cần phải đạt được hiệu quả sản sinh glucose nhất định, vì vậy quá trình đánh giá hiệu quả phân giải dựa vào 2 yếu tố trên được tiến hành sau 0, 3, 5, 7, 9 và 11 ngày

Chỉ tiêu theo dõi:

- Hàm lượng enzyme ngoại bào đo bằng phương pháp Bradford

- Hoạt tính vi khuẩn đo bằng phương pháp DNS

- Phần chất rắn còn lại sau khi thủy phân

3.2.5 Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật sinh học phân

- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ và điện

di trên gel agarose 0,8%

- Khuếch đại vùng gene mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng hiệu

- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng sản phẩm sau khuếch đại bằng phương pháp quang phổ và điện di trên gel agarose 2%

- Giải trình tự để định danh đến cấp loài

- Dựa vào phần mềm BLAST để so sánh mức độ tương đồng với dữ liệu trên

ngân hàng gene của NCBI (National Center for Biotechnology Information) trên trang

web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ và xác định loài của chủng vi khuẩn

3.2.6 Khảo sát khả năng lên men ethanol

Mục đích: Xác định khả năng ứng dụng lên men ethanol từ dịch phân giải vỏ trái

ca cao bằng vi khuẩn

Tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành với chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose

tốt nhất trong các thí nghiệm trên Nguồn giống chủng Sacharomyces cerevisiae 2.1

được nuôi trong môi trường YEP (5 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L glucose) ở

30oC Sau khi đạt được mật số cần thiết: 108 tế bào/mL, chủng nấm được chuyển sang bình 100 mL chứa môi trường dịch thủy phân vi khuẩn có bổ sung Yeast extract,

K2HPO4, MgSO4, chủng với tỷ lệ 1% Bình nuôi cấy được giữ ở nhiệt độ phòng và lắc liên tục trong 5 ngày, pH ban đầu là 6,0

Chỉ tiêu đánh giá:

- Hàm lượng glucose mất đi

- Lượng ethanol sinh ra

- Hiệu suất lên men theo thời gian

3.2.7 Xử lý số liệu, phân tích thống kê: Số liệu được xử lý bằng chương trình

Microsoft Office Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV, USA

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao

Vỏ trái ca cao có nguồn gốc từ huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ Vỏ trái ca cao được nghiền mịn và sấy khô ở 70oC trong 3 ngày được sử dụng để xác định hàm lượng cellulose Kết quả sau khi xử lý mẫu bằng kiềm và acid theo phương pháp Crube fibre (AOAC, 1995) Kết quả thu được hàm lượng cellulose có hàm lượng từ 38,02- 38,79% trọng lượng khô vỏ quả

Bảng 4 Kết quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao

(% trọng lượng khô)

Mẫu Lần lặp Khối lượng mẫu trước khi xử lý (g) Hàm lượng

cellulose (%)

Vỏ trái ca cao

ăn bổ sung vào khẩu phần ăn của các loại gia súc Thời gian gần đây, vỏ trái ca cao còn được chú ý tới như một nguồn nguyên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn Một trong những nghiên cứu phải kể đến là của Samah et al (2011) đã thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid chlohydric 1,0M Kết quả thu được lượng đường có nồng độ 30,7% w/v, sau khi tiến hành lên men lượng ethanol thu được là 17,3% v/v Với thành phần cellulose trung bình khoảng 38,51% và những thành phần hữu cơ khác thì vỏ trái ca cao là một nguồn dinh dưỡng tốt cho vi khuẩn phân hủy cellulose sinh sống

4.2 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC

Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ vỏ trái ca cao hoại mục

tự nhiên tại huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ và được kiển tra sơ bộ bằng cách cấy trải trên môi trường CMC Mẫu được ủ ở 30oC, theo dõi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc khác nhau tiếp tục cấy truyền cho đến khi có chủng thuần Kết quả cho thấy rằng những chủng vi khuẩn này đểu phát triển tốt sau 48 giờ ủ Nhìn chung, 23 chủng vi khuẩn này có sự khác biệt tương đối về màu sắc, hình dạng và kích thước với nhau Kết quả cho thấy có 15 chủng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn- màu trắng (PD1, PD2, PD4, PD5, PD6, PD7, PD9, PD10, PD11, PD12, PD13, PD14, PD15, PD19 và PD21), 1 chủng có dạng tròn- màu xám (PD8), 2 chủng có dạng hình tròn- màu vàng (PD20 và PD23), 1 chủng có dạng hình thoi- màu xám (PD3) và 4 dạng khuẩn lạc hình thoi- màu vàng (PD16, PD17, PD18 và PD22) Về độ nổi khuẩn lạc, thì có 17 chủng dạng bề mặt lài, 1 chủng có dạng bề mặt nổi gò và 5 chủng dạng bề mặt mô (Bảng 5) Tất cả các chủng vi khuẩn đều dương tính với thuốc thử catalase, có 4 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc màu vàng dương tính với thuốc thử oxydase, 19 chủng còn lại âm tính với loại thuốc thử này Kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn có cả Gram âm và Gram dương Đa số vi khuẩn ở dạng kết đôi hoặc kết chuỗi Có một số ít chủng có khả năng chuyển động, các chủng còn lại không có khả năng chuyển động

Bảng 5 Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn

phân giải vỏ trái ca cao

Que ngắn đôi,

2 PD2

Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm

Chuỗi cầu, không

3 PD3

Hình thoi, màu trắng đục, bề mặt nổi gò, bìa gợn sóng, d = 2,0 mm

Chuỗi cầu, không

4 PD4

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm

Chuỗi cầu, không

5 PD5

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,6 mm

Chuỗi cầu, chuyển

6 PD6

Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,0 mm

Que ngắn đôi,

7 PD7

Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,5 mm

Chuỗi cầu, không

8 PD8

Hình tròn, màu xám, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d

Chuỗi cầu, không

10 PD10

Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,3 mm

Chuỗi cầu, chuyển

11 PD11

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm

Que ngắn đôi,

12 PD12

Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm

Que ngắn, không

13 PD13

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,5 mm

Chuỗi cầu, không

14 PD14

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm

Que ngắn đôi,

15 PD15

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm

Chuỗi cầu, chuyển

16 PD16

Hình thoi, màu vàng,

bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 1,5 mm

Chuỗi cầu, chuyển

19 PD19

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm

d = 1,5 mm chuyển động

21 PD21

Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 2,0 mm

Chuỗi cầu, không

22 PD22

Hình thoi, màu vàng,

bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 2,0 mm

4.3 Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose

Hai mươi ba chủng vi khuẩn hiếu khí được nuôi tăng sinh trong môi trường CMC lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Sử dụng phương pháp nhỏ giọt trên lỗ thạch đường kính 4-5 mm để xác định khả năng thủy phân bằng cách nhuộm với thuốc thử congo red 0,1% (w/v) (Hình 34)

Hình 10 Đường kính vòng tròn thủy phân sau 3 ngày của chủng

PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21