phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN HIẾU KHÍ PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ VỎ TRÁI CA CAO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Th.S HUỲNH XUÂN PHONG LÊ THỊ VÂN AN MSSV: 3096805 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Huỳnh Xuân Phong Lê Thị Vân An DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ ---------------------- Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban giám đốc Viện NC PT Công nghệ Sinh học, Quý Thầy Cô tạo điều kiện tốt để em thực đề tài luận văn tốt nghiệp này. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Huỳnh Xuân Phong tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt giúp em rèn luyện suốt trình học tập hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang– cán quản lý phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm, quý Thầy Cô, Anh Chị quản lý phòng thí nghiệm Viện NC PT CNSH hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn đến Anh Chị học viên cao học, bạn sinh viên phòng thí nghiệm CNSH Thực phẩm giúp đỡ em suốt trình thực đề tài. Xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ ủng hộ em suốt trình học tập để em có kết ngày hôm Kính chúc Quý Thầy Cô, Anh Chị bạn dồi sức khỏe, hạnh phúc thành đạt. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quí báo đó! Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Đề tài “Phân lập tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao” tiến hành với nội dung bao gồm phân lập, khảo sát hoạt tính chọn lọc chủng vi khuẩn có khả thuỷ phân vỏ trái ca cao, từ tiến hành đánh giá khả lên men từ dịch thủy phân. Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí phân lập từ vỏ trái ca cao, có 20 chủng vi khuẩn có khả tạo vòng tròn thủy phân môi trường CMC. Hai chủng vi khuẩn PD2 PD5 tạo vòng tròn thủy phân môi trường thạch có đường kính lớn (11,33mm 11mm). Kết khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn PD5 thủy phân vỏ ca cao hiệu với hàm lượng đường khử 2,244 mg/mL sau ngày ủ lắc nhiệt độ phòng (28- 32oC). Hàm lượng protein thu tương thích với thời gian tối ưu 226,19 µg/mL. Kết phân tích PCR cho thấy chủng PD5 thuộc Klebsiella variicola. Nghiên cứu cho thấy trình lên men dịch thủy phân chủng Saccharomyces cerevisiae đạt hiệu suất tốt, đạt đến 85%. Từ khoá: cellulase, đường khử, Saccharomyces cerevisiae, vỏ trái ca cao, vòng tròn thủy phân. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Nội dung Trang PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC . i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG . iv DANH SÁCH HÌNH . v TỪ VIẾT TẮT . vii CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề . 1.2. Mục tiêu nghiên cứu . CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan ca cao thành phần vỏ trái ca cao 2.1.1. Giới thiệu ca cao . 2.1.2. Các thành phần vỏ trái ca cao 2.2. Tổng quan cellulose . 2.2.1. Giới thiệu cellulose . 2.2.2. Giới thiệu nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 10 2.3. Ứng dụng enzyme cellulase thị trƣờng . 12 2.4. Tình hình nghiên cứu nƣớc 13 CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 15 3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm 15 3.1.1. Địa điểm thời gian thực 15 3.1.2. Nguyên vật liệu 15 3.1.3. Hóa chất môi trường . 15 3.1.4. Thiết bị - dụng cụ 16 3.2 Phƣơng pháp thí nghiệm 16 3.2.1. Phân tích hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao . 16 3.2.2. Phân lập chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả phân giải cellulose môi trường CMC. 17 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 3.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose. 18 3.2.4. Khảo sát khả phân giải vỏ trái ca cao. 19 3.2.5. Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose kỹ thuật sinh học phân tử 19 3.2.6. Khảo sát khả lên men ethanol 20 3.2.7. Xử lý số liệu, phân tích thống kê . 20 CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 21 4.1. Kết phân tích hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao . 21 4.2. Kết phân lập chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả phân giải cellulose môi trường CMC. 22 4.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose. 25 4.4. Khả phân giải vỏ trái ca cao. . 27 4.5. Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose kỹ thuật sinh học phân tử . 32 4.6. Khả lên men ethanol 33 CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 35 5.1. Kết luận 35 5.2. Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 36 PHỤ LỤC . 42 Phụ lục 1. Phƣơng pháp vi sinh-sinh hóa Phụ lục 2. Hình ảnh thiết bị sử dụng phòng thí nghiệm Phụ lục 3. Số liệu kết thí nghiệm Phụ lục 4. Kết phân tích thống kê Phụ lục 5. Hình ảnh khuẩn lạc tế bào vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1. Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến Bảng 2. Thành phần môi trường CMC . 15 Bảng 3. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (M1) . 16 Bảng 4. Kết phân tích hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao 21 Bảng 5. Hình dạng đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc 23 chủng vi khuẩn phân giải vỏ trái ca cao . 23 Bảng 6. Kết trình lên men dịch thủy phân vỏ trái ca cao 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Tên hình Trang Hình 1. Cấu tạo phân tử cellulose (dạng mạch thẳng) . Hình 2. Cấu trúc sợi cellulose Hình 3. Các loại đường cấu thành Hemicellulose Hình 4. Các đơn vị lignin . Hình 5. Cơ chế trình thủy phân cellulose Hình 6. Trichoderma . 10 Hình 7. Streptomyces 11 Hình 8. Clostridium 12 Hình 9. Quy trình xác định hàm lượng cellulose vỏ trái ca cao . 17 Hình 10. Đường kính vòng tròn thủy phân sau ngày chủng PD2, PD5, PD6, PD8 PD21 . 25 Hình 11. Đường kính vòng tròn thủy phân 23 chủng vi khuẩn hiếu khí . 26 Hình 12. Hàm lượng protein sinh theo thời gian tương ứng với chủng vi khuẩn . 27 Hình 13. Đường tăng trưởng dòng PD2 . 28 Hình 14. Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hàm lượng glucose sinh 28 Hình 15. Ảnh hưởng chủng vi khuẩn đến hàm lượng glucose sinh 29 Hình 16. Hàm lượng glucose sinh theo thời gian tương ứng với chủng vi khuẩn . 30 Hình 17. Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao chủng vi khuẩn . 31 Hinh 18. Kết tra cứu BLAST N dòng PD5 32 Hình 19 . Kết so sánh BLAST N chủng PD5 so với dòng Klebsiella variicola . 33 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT mL milliliter YEP Yeast extract-Peptone v/v volume/volume w/v weight/volume Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt nam có tiềm phát triển ca cao lớn, ca cao có ưu trội trồng xen với nhiều loại khác, đồng thời có khả chịu hạn, chống xói mòn đất nên thích hợp với điều kiện tự nhiên thổ nhưỡng. Tính đến tháng năm 2013, nước có khoảng 25.000 ca cao, chủ yếu trồng Tây Nguyên, Đông Nam số tỉnh Đồng sông Cửu Long. Dự kiến, đến năm 2015 diện tích trồng ca cao lên đến 60.000 đạt 80.000 vào năm 2020. Sản lượng ca cao dự đoán đạt khoảng 52.000 vào năm 2015 108.000 vào năm 2020 (http://nongnghiep.vn, 18/07/2013). Tuy nhiên sau thu hoạch trái ca cao, phần hạt người nông dân thu lấy phần vỏ sử dụng tới. Một phần vỏ trái ca cao chế biến thành phân bón hữu thức ăn bổ sung cho bò, số khác phơi khô sử dụng để làm nhiên liệu đốt. Tuy nhiên, hộ trồng ca cao quy mô lớn, người ta thường bóc chỗ, đưa hạt đóng bao xưởng xử lý, phần vỏ thường không dùng tới để hoại mục tự nhiên vườn. Việc có lợi giảm công vận chuyển mặt trái tạo môi trường dinh dưỡng cho nhiều loại sâu hại gây bệnh phát triển vỏ trái ca cao giàu dinh dưỡng. Vỏ trái ca cao không gây sức ép nghiêm trọng môi trường xung quanh tận dụng triệt để xem nguồn nguyên liệu sinh học đầy hứa hẹn. Tuy vậy, việc sử dụng nguồn nguyên liệu phụ thuộc lớn vào thủy phân cho loại đường đơn tận dụng được. Cellulose chuyển đổi thành glucose nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hóa học, vật lý enzyme thủy phân. Trong đó, phương pháp xử lý cellulose enzyme có ưu so với phương pháp xử lý acid. Phản ứng thủy phân cellulose với acid cần lượng bazơ để trung hòa, điều làm hao tốn chi phí lên nhiều lần đồng thời phương pháp giải phóng sản phẩm phụ lợi cho môi trường. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu giới cho thấy enzyme cellulase hoạt động có hiệu việc thuỷ phân mạng lưới cellulose giải phóng gốc đường glucose đơn giản. Nhờ mà lượng đường sinh chuyển đổi thành sản phẩm có giá trị butanol, acid amino hay nhiên liệu sinh học ethanol. Ngoài enzyme cellulase sử dụng có hiệu việc chuyển đổi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT tác dụng acid kiềm nên bị phân giải tan vào dung dịch xử lý nguyên liệu. (AOAC, 1955). 7. Phƣơng pháp đinh lƣợng protein phƣơng pháp Bradford (1976). Nguyên tắc: Thuốc thử Bradford hợp chất gồm Coomassie Brilliant Blue (CBB) G250 phosphoric acid hòa tan ethanol/nước cất theo tỷ lệ 1/4. Trong môi trường mang tính acid dung dịch, chưa gắn với protein thuốc nhuộm dạng màu đỏ có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm kết hợp với protein thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dương hấp thụ cực đại bước sóng 595 nm. Vì lượng protein biết cách xác định thuốc nhuộm dạng tích điện âm màu xanh dương đo hấp thụ dung dịch bước sóng 595 nm. Protein mang điện tích âm ổn định liên kết với chất màu tương tác kỵ nước ion (tương tác chủ yếu dựa gốc arginin, mức độ thấp hơn histidine, lysine, thyrosine, tryptophan phenylalanyl. Độ hấp thụ tỷ lệ thuận với hàm lượng protein dung dịch. (Dương Thị Hương Giang, 2007) Các bƣớc tiến hành: Chuẩn bị dung dịch Bradford: hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 50ml ethanol 95%, cho thêm 100ml acid phosphoric 85%, khuấy đều, bổ sung thêm nước cất 1lít. Lọc dung dịch bột giấy Whatman No.1 trữ chai tối nhiệt độ phòng. Xây dựng đường chuẩn : - Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 5, 10, 20, 30 , 50 μg/ml (Thí nghiệm lặp lại lần) - Chuẩn bị ống eppendorf thêm vào chất theo bảng: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 45 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Ống nghiệm Hóa chất Nồng độ BSA (μg/ml) 10 20 30 40 50 Thể tích BSA (μl) 10 20 30 40 50 Thể tích H2O cất (μl) 100 95 90 70 60 50 - Lắc lấy 100 ml dung dịch từ ống nghiệm cho vào dãy ống nghiệm đánh số tương tự - Cho vào ống 2ml thuốc thử, lắc (tránh bọt khí). - Sau 10 phút tiến hành đo OD (bước sóng 595 nm). Ghi nhận lại kết quả. - Tính giá trị trung bình lần lặp lại 8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đƣờng khử hoạt tính enzyme phƣơng pháp DNS (1944). Lập đƣờng chuẩn Ống nghiệm 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ Dd glucose chuẩn 0,1% (ml) 0,8 1,2 1,4 1,6 Nước cất (ml) 3,2 2,8 2,6 2,4 Cglucose (µg/ml) 200 250 300 350 400 Dãy ống nghiệm Hút từ ống 1’,2’,3’,4’,5’ (ml) - Nước cất (ml) - - - - Thuốc thử DNS (ml) M1 M2 - Đun cách thủy ống nghiệm phút Làm nguội ống nghiệm đến nhiệt độ phòng, sau đem đo OD OD540nm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 46 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Phụ lục 2. Hình ảnh thiết bị sử dụng phòng thí nghiệm Kính hiển vi Tủ ủ Cân phân tích Máy vortex Tủ cấy Water - bath Phụ lục 3. Số liệu kết thí nghiệm 1. Kết thí nghiệm 1. Bảng 8. Kết hàm lƣợng chất khô vỏ trái ca cao sau ngày sấy 700C Mẫu Ca cao Số lần Khối lượng mẫu Khối lượng mẫu Phần trăm trọng lượng khô lặp trước sấy (g) sau sấy (g) (%) 22,2 3,7695 16,98 37,5 6,28 16,75 50,0 8,4077 16,82 Bảng 9. Kết hàm lƣợng CF vỏ trái ca cao Mẫu Ca cao Số lần Khối lượng Khối lượng Khối lượng sau Khối lượng CF+ash lặp đầu (M)(g) giấy lọc (g) thủy phân (g) (M1)(g) 1,0001 1,4055 1,8171 0,4116 1,0008 1,4064 1,8155 0,4091 1,0004 1,4025 1,8070 0,4045 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 47 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Bảng 10. Kết hàm lƣợng tro vỏ trái ca cao Mẫu Ca cao Lần lặp Khối lượng mẫu sau TP Khối lượng cốc sau (g) sấy 105 C (g) Khối lượng mẫu+cốc sau sấy 6000C (g) Khối lượng ash (M2) (g) 0,4116g 36,3739 g 36,3976 0,0237 0,4091g 35,3162 g 35,3377 0,0215 0,4045g 35,9077 g 35,9318 0,0241 Bảng 11. Kết phân tích hàm lƣợng cellulose vỏ trái ca cao Mẫu Ca cao Khối lượng Khối lượng mẫu CF+Ash (M)(g) (M1) (g) 1,0001 Số lần lặp Khối lượng Hàm lượng cellulose (%) ash (M2) (g) (M1-M2)*100/M 0,4116 0,0237 38,79 1,0008 0,4091 0,0215 38,73 1,0004 0,4045 0,0241 38,02 2. Kết thí nghiệm 2. Hình 11. Khuẩn lạc PD1 (1) tế bào kính hiển vi X100 (2) Hình 12. Khuẩn lạc PD2 (3) tế bào kính hiển vi X100 (4) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 48 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 13. Khuẩn lạc PD3 (5) tế bào kính hiển vi X100 (6) Hình 14. Khuẩn lạc PD4 (7) tế bào kính hiển vi X100 (8) Hình 15. Khuẩn lạc PD5 (9) tế bào kính hiển vi X100 (10) Hình 16. Khuẩn lạc PD6 (11) tế bào kính hiển vi X100 (12) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 49 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 17. Khuẩn lạc PD7 (13) tế bào kính hiển vi X100 (14) Hình 18. Khuẩn lạc PD8 (15) tế bào kính hiển vi X100 (16) Hình 19. Khuẩn lạc PD9 (17) tế bào kính hiển vi X100 (18) Hình 20. Khuẩn lạc PD10 (19) tế bào kính hiển vi X100 (20) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 50 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 21. Khuẩn lạc PD11 (21) tế bào kính hiển vi X100 (22) Hình 22. Khuẩn lạc PD12 (23) tế bào kính hiển vi X100 (24) Hình 23. Khuẩn lạc PD13 (25) tế bào kính hiển vi X100 (26) Hình 24. Khuẩn lạc PD14 (27) tế bào kính hiển vi X100 (28) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 51 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 25. Khuẩn lạc PD15 (29) tế bào kính hiển vi X100 (30) Hình 26. Khuẩn lạc PD16 (31) tế bào kính hiển vi X100 (32) Hình 27. Khuẩn lạc PD17 (33) tế bào kính hiển vi X100 (34) Hình 28. Khuẩn lạc PD18 (35) tế bào kính hiển vi X100 (36) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 52 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 29. Khuẩn lạc PD19 (37) tế bào kính hiển vi X100 (38) Hình 30. Khuẩn lạc PD20 (39) tế bào kính hiển vi X100 (40) Hình 31. Khuẩn lạc PD21 (41) tế bào kính hiển vi X100 (42) Hình 32. Khuẩn lạc PD22 (43) tế bào kính hiển vi X100 (44) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 53 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Hình 33. Khuẩn lạc PD23 (45) tế bào kính hiển vi X100 (46) 3. Kết thí nghiệm 3. Bảng 12. Đƣờng kính vòng tròn thủy phân vỏ trái ca cao ChủngVK 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Lặp lần 12 12 2 5 Lặp lần 12 3 11 5 4 Lặp lần 3 10 2 10 0 Trung bình 3,33 11,33 2,67 3,67 11,00 6,00 2,00 8,33 4,67 2,67 1,33 2,00 0,67 5,00 0,00 4,00 0,00 4,00 3,00 6,00 2,67 1,00 4. Kết thí nghiện 4. Bảng 13. Mật số chủng vi khuẩn ngày nuôi cấy (log (số tế bào/mL)) Chủng VK PD2 NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY NGÀY 5,318759 6,360151 6,952227 7,352183 7,318759 6,88696 5,716699 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học NGÀY NGÀY 54 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 PD5 PD6 PD8 PD21 5,464887 5,432702 5,432702 5,432702 6,39794 6,379457 6,360151 6,379457 Trường ĐHCT 6,981517 7,39794 7,360151 6,88696 5,640978 6,981517 7,344065 7,232573 6,837273 5,522879 6,920819 7,367977 7,243038 6,898542 5,574031 6,981517 7,335792 7,263241 6,88696 5,574031 Bảng 14. Phƣơng trình đƣờng chuẩn Loại đường chuẩn Phương trình đường chuẩn Hàm lượng glucose y=1382,5x + 0,0027 (R2=0,9989) Hàm lượng protein y=0,0021x + 0,0064 (R2=0,9997) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 55 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT Bảng 15. Hàm lƣợng glucose sinh 11 ngày CHỦNG Hàm lượng Glucose (% g/ml) Ngày Ngày Ngày 0,1749 0,2676 0,1724 Ngày 0,0616 Ngày 11 0,023 Chủng PD2 Ngày 0,009 Chủng PD5 0,010 0,1795 0,3042 0,2041 0,0615 0,020 Chủng PD6 0,010 0,166 0,2336 0,1406 0,0452 0,015 Chủng PD8 0,013 0,1719 0,2602 0,184 0,0593 0,017 Chủng PD21 0,008 0,1564 0,2254 0,1665 0,0402 0,014 Bảng 16. Hàm lƣợng protein sinh 11 ngày CHỦNG Chủng PD3 Chủng PD5 Chủng PD6 Chủng PD8 Chủng PD21 Ngày 0,48 2,38 1,91 0,95 1,91 Hàm lượng Protein (µg/ml) Ngày Ngày Ngày 13,33 201,43 72,38 31,43 226,19 64,76 19,52 153,33 66,19 12,38 189,05 47,62 20,00 144,76 74,29 Ngày 61,43 55,71 46,19 43,33 22,86 Ngày 11 39,52 30,00 26,19 29,52 8,10 Bảng 17. Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao chủng vi khuẩn Chủng PD PD PD PD PD 21 Khối lượng vỏ Khối lượng vỏ Hiệu suất thủy phân Hiệu suất ban đầu(g) sau thủy phân (g) vật chất khô (%) trung bình 1,0001 0,8376 16,25 1,0001 0,8399 16,02 1,0002 0,8402 16,00 1,0001 0,7799 22,02 1,0001 0,7874 21,27 1,0001 0,7994 20,07 1,0001 0,8489 15,12 1,0001 0,8466 15,35 1,0001 0,8541 14,60 1,0001 0,8374 16,27 1,0001 0,8321 16,80 1,0001 0,8314 16,87 1,0001 0,8516 14,85 1,0001 0,8388 16,13 1,0001 0,8506 14,95 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 56 16,09 21,12 15,02 16,65 15,31 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 5. Kết thí nghiệm Bảng 18. Hàm lƣợng đƣờng khử trƣớc sau lên men Mẫu Hàm lượng Glucose trước lên men (% w/v) Hàm lượng Glucose trước lên men (% w/v) Hàm lượng ethanol (% v/v) 0,155 0,156 0,009 0,009 0,0943 0,0984 0,156 0,011 0,0948 Phụ lục 4. Kết phân tích thống kê 1. Kết thí nghiệm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 57 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 2. Kết thí nghiệm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 58 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường ĐHCT 59 Viện NC PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trường ĐHCT 60 Viện NC PT Công nghệ Sinh học [...]... trong vỏ trái ca cao 2.1.1 Giới thiệu cây ca cao Cây ca cao (Theobroma cacao) có nguồn gốc hoang dại trong các khu rừng nhiệt đới Trung và Nam châu Mỹ Ca cao là loại cây thường xanh ở tầng trung, cao từ 4-8 m, ưa bóng rợp, có khả năng chịu bóng tốt nên thường được trồng xen dưới tán cây khác Nguồn gốc của cây ca cao là từ Trung Mỹ và Mexico, được những người Aztec và Maya bản xứ khám phá Các loài ca cao. .. kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 18 Vi n NC và PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT 3.2.4 Khảo sát khả năng phân giải vỏ trái ca cao Mục đích: Đánh giá hiệu quả thuỷ phân vỏ trái ca cao của các chủng vi khuẩn trên cơ chất vỏ trái ca cao Tiến hành thí nghiệm: Sử dụng 100 mL môi trường M1 lỏng (1 g vỏ trái ca cao khô/ 100 mL môi... Trường ĐHCT 4.2 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ vỏ trái ca cao hoại mục tự nhiên tại huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ và được kiển tra sơ bộ bằng cách cấy trải trên môi trường CMC Mẫu được ủ ở 30oC, theo dõi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc khác nhau... phẩm phụ từ vỏ trái ca cao Greenwood-Barton (1965) trong nghiên cứu ứng dụng bổ sung vỏ trái ca cao vào khẩu phần ăn của gia súc đã xác định vỏ ca cao chiếm khoảng 75% trọng lượng quả, thành phần chính vỏ trái ca cao gồm 33,1939,45% xơ, 8,83-10,18% tro và 5,69- 9,69% protein thô Năm 1967, Bateman và Fresnille cũng tiến hành một nghiên cứu tương tự như trên và công bố thành phần vỏ trái ca cao gồm có 35,4%... giờ và đem cân Hình 9 Quy trình xác định hàm lƣợng cellulose vỏ trái ca cao Khối lượng cellulose được tính theo công thức: (W2- W1) % Cellulose = x 100 W Trong đó: W khối lượng mẫu trước khi thủy phân (g) W1 khối lượng mẫu sau khi thủy phân (g) W2 khối lượng mẫu sau khi tro hóa (g) 3.2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC Mục đích: Phân lập. .. cellulose từ vỏ trái ca cao 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí có khả năng tổng hợp cellulase trên cơ chất là vỏ trái ca cao và khảo sát khả năng lên men ethanol từ nguồn nguyên liệu này Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Vi n NC và PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây ca cao và thành phần... nhóm vi sinph vật phân giải cellulose Trong tự nhiên, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose gồm các nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn Chúng ta có thể tìm thấy chúng trong đất, phân ủ Tuỳ theo tính chất của chúng, có thể xếp vào 2 nhóm như sau: a Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện hiếu khí Ở đất thoáng khí, nấm là thành phần quan trọng trong các vi sinh vật phân giải cellulose, ... 20 Vi n NC và PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao Vỏ trái ca cao có nguồn gốc từ huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ Vỏ trái ca cao được nghiền mịn và sấy khô ở 70oC trong 3 ngày được sử dụng để xác định hàm lượng cellulose Kết quả sau khi xử lý mẫu bằng kiềm và. .. phẩm và trong nông nghiệp thành sản phẩm có giá trị (Bothast và Saha, 1997) Một số nghiên cứu đã cho thấy, tại nơi tiến hành thu hoạch nguyên liệu, nơi mà nguyên liệu tự rã mục và tiếp xúc với đất đã tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phân giải cellulose phát triển tốt (Baig et al., 2003) Đây cũng chính là tiền đề cho nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái. .. http://web.mst.edu, ngày 04/08/2013) b Vi sinh vật phân giải cellulose trong đều kiện yếm khí Ở điều kiện yếm khí, vai trò của nấm và xạ khuẩn không quan trọng, còn vi khuẩn chiếm ưu thế trong điều kiện này Các loại nấm phân giải mạnh cellulose là các giống: Neocallimastix, Piromyces, Caecomyces, Orpimomyces và Anaeromyces (Lee, 1997) Các vi khuẩn phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí phần lớn thuộc chi Clostridium, . trong vỏ trái ca cao 21 Bảng 5. Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn phân giải vỏ trái ca cao 23 Bảng 6. Kết quả quá trình lên men dịch thủy phân vỏ trái ca cao 33. quả phân tích hàm lượng cellulose trong vỏ trái ca cao 21 4.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC. 22 4.3. Tuyển chọn vi. cho vi khuẩn phân giải cellulose phát triển tốt (Baig et al., 2003). Đây cũng chính là tiền đề cho nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn hiếu khí phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao .