Để đánh giá khả năng phân giải vỏ trái ca cao, 5 chủng vi khuẩn PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 được nuôi cấy trong môi trường M1 lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng (28- 31oC.
4.4.1. Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
Kết quả cho thấy lượng protein sinh ra của năm chủng vi khuẩn tăng tuyến tính từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm mạnh ở những ngày tiếp theo (Hình 36).Điều này là do cả 5 chủng vi khuẩn đều đạt mật số cao nhất ở ngày 4 và bắt đầu bước vào pha ổn định ở ngày 5 (Hình 37).
Hình 12. Hàm lƣợng protein sinh ra theo thời gian tƣơng ứng với 5 chủng vi khuẩn
Trong ngày 5, vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường và đạt mật số cao, do đó vi khuẩn cần tiết nhiều enzyme thủy phân cơ chất để tạo nguồn dinh dưỡng, kết hợp với lượng enzyme sinh ra ở ngày 4 nên hàm lượng protein sinh ra đạt giá trị cao. Hình 37 cho thấy vào ngày 5, chủng PD5 có hàm lượng protein cao nhất là 226,19 µg/mL, cũng có thể kết luận rằng hoạt tính enzyme sinh ra cũng đạt giá trị cao nhất ở ngày 5. Khi đo ở ngày 0, vẫn xuất hiện protein, điều này có được là do trong vỏ trái ca cao có khoảng 5,69-9,69% hàm lượng protein thô (Greenwood-Barton,1965). Hàm lượng protein tăng nhẹ từ ngày 1 đến ngày 3, do trong giai đoạn này vi khuẩn chưa thích nghi tốt, đồng thời
mật số chưa cao. Từ ngày 3 đến ngày 5, hàm lượng protein tăng khoảng 3 lần là do vi khuẩn đã đạt được mật số cao nhất trong ngày 4 và vi khuẩn cũng đã thích nghi với môi trường mới nên lượng enzyme sinh ra nhiều làm cho hàm lượng protein có sự tăng mạnh. Các ngày sau đó hàm lượng protein giảm mạnh là do đây là thời kỳ vi khuẩn chết dần, đồng thời lượng protein giảm còn có thể do protein bị biến tính nên đã bám vào cơ chất làm cho kết quả xác định protein giảm chỉ còn khoảng 27 µg/mL. Khi so sánh kết quả thu được với hàm lượng protein sinh ra bởi dòng vi khuẩn Acinetobacter phân lập (Văn Hữu Lộc, 2010) sau 5 ngày là 190 µg/mL và chủng vi khuẩn 22 (Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2010) là 141,56 µg/mL thì kết quả trong thí nghiệm thu được tốt hơn.
Hình 13. Đƣờng tăng trƣởng của dòng PD2
4.4.2. Khảo sát lượng đường khử sinh ra bằng phương pháp DNS
Hình 14. Ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng glucose sinh ra
Kết quả thống kê theo từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng glucose sinh ra là có ý nghĩa ở mức độ 5%. Theo đó, khi thời gian ủ tăng lên từ 0-
5 ngày, hàm lượng glucose cũng tăng lên tương ứng từ 0,01- 0,201% (w/v). Tuy nhiên, trong khoảng thời gian từ 5-11 ngày, lượng glucose được ghi nhận có xu hướng giảm liên tục từ 0,201- 0,018% (w/v) (Hình 38). Điều này được giải thích dựa trên tỷ lệ giữa lượng glucose sinh ra và lượng bị tiêu thụ bởi vi khuẩn. Theo đó, trong 5 ngày đầu, cơ chất còn mới, phần lớn carbohydrate trong vỏ và một phần glucose sinh ra bị vi khuẩn sử dụng để tăng sinh khối nhưng do hoạt động phân giải cellulose diễn ra mạnh nên lượng glucose vẫn đạt mức cao. Tuy nhiên, ở những khoảng thời gian sau đó, carbohydrate bị tiêu thụ gần hết, cấu trúc cellulose chỉ còn lại những thành phần khó bị phân giải dẫn đến sự giảm hiệu suất sản sinh glucose.
Hình 15. Ảnh hƣởng của chủng vi khuẩn đến hàm lƣợng glucose sinh ra
Kết quả thống kê theo nhân tố loại vi khuẩn chỉ ra rằng chủng PD5 cho hoạt tính phân giải cellulose cao nhất tương ứng với lượng glucose sinh ra là 0,091% (w/v) (Hình 39). Điều này có thể được lý giải thông qua khả năng phát triển nhanh và thích ứng với môi trường mới, đồng thời khả năng di chuyển cũng là một điểm mạnh của chủng PD5.
Hình 16. Hàm lƣợng glucose sinh ra theo thời gian tƣơng ứng với 5 chủng vi khuẩn
Nhìn chung, biểu đồ thể hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử của 5 chủng vi khuẩn qua 11 ngày nuôi cấy phù hợp với hàm lượng protein có trong dịch thủy phân (Hình 40).Hàm lượng đường khử đo được qua các ngày cho thấy hoạt tính enzyme tăng từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm mạnh. Ở ngày 0 vẫn xác định được một lượng đường khử thấp, lượng đường khử này chính là glucose có sẵn trong vỏ trái ca cao do trong thành phần vỏ trái ca cao có khoảng 1,16- 3,92% (w/w) glucose (Greenwood-Barton, 1965). Lượng đường khử này tăng dần cho đến ngày thứ 5 thì cao nhất do đây là giai đoạn phát triển mạnh nhất của vi khuẩn. Tại ngày 5, chủng vi khuẩn PD5 thủy phân vỏ trái ca cao cho ra lượng đường khử cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các chủng khác với giá trị là 2,244 mg/mL, hiệu suất sinh đường khử tương ứng là 0,2244% (w/v). Những ngày sau đó, lượng đường khử giảm dần và còn rất thấp ở ngày 11 là 0,2 mg/mL. Nguyên nhân có sự sụt giảm trên là do hoạt tính thủy phân của enzyme giảm, vi khuẩn không thể tiêu thụ được cellulose nữa nên đã tiêu thụ phần đường khử sinh ra (Laurent et al., 2000). Sự giảm hoạt tính sau 5 ngày có thể là do sự tích lũy các phân tử cellobiose, được công bố là gây nên sự ức chế hoạt động của cả endoglucanase và β- glucosidase (Singh et al., 1995). Theo Hatakka (1983), sự hình thành của các hợp chất vòng thơm hấp thụ nước cũng ngăn chặn hoạt động thuỷ phân cellulose của enzyme.
Chủng PD5 được chọn là chủng vi khuẩn thủy phân cơ chất cho ra lượng đường khử cao nhất so với các chủng khác với thời gian thích hợp là 5 ngày, đạt 2,244 mg/mL. Kết quả đưa ra từ thí nghiệm này tương đương với nghiên cứu của Singh et al. (2009) khi tiến hành thủy phân rơm từ cây lúa mỳ bằng chủng Aspergillus heteromorphus và thu được lượng đường khử cao nhất là 1,407 mg/mL sau 5 ngày nuôi cấy. Baig et al. (2005) đã tiến hành thủy phân các sản phẩm phụ từ cây chuối bằng chủng nấm mốc
Trichoderma lignorum, lượng đường khử sinh ra bằng 1,34mg/mL sau 24 giờ thủy phân.
Hình 17. Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao của 5 chủng vi khuẩn
Ghi chú: Các giá trị có cùng chữ khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu trong bảng là gí trị của ba lần lặp lại
Hiệu suất thủy phân của 5 chủng vi khuẩn sau 11 ngày thủy phân được thể hiện ở Hình 41. Chủng PD5 thủy phân vỏ trái ca cao hiệu quả nhất và có giá trị khác biệt có ý nghĩa ở mức độ thống kê 5% so với 4 chủng vi khuẩn được chọn và có giá trị là 28,07% trọng lượng khô vỏ quả. Nghiên cứu của Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) đã tiến hành thủy phân rơm rạ bằng 2 chủng vi khuẩn yếm khí được phân lập từ dạ cỏ bò, Cellulomonas flavigena và chủng Bacillus megaterium,kết quả cho thấy, sau 10 ngày hiệu suất thủy phân từ 53,6-55,93% .
Kết quả hiệu suất thủy phân nêu trên cho thấy chủng vi khuẩn PD5 có tiềm năng trong việc phân giải vỏ trái ca cao. Đồng thời lượng chất khô mất đi sau quá trình thủy phân (28,07%) lớn hơn lượng glucose ghi nhận được (22,44%). Điều này có thể khẳng định rằng một phần đường khử sinh ra đã bị tiêu thụ ngược bởi vi khuẩn. Nguyên nhân có sự chênh lệch này là do một phần vật chất phi-cellulose của vỏ trái ca cao (chủ yếu là carbohydrate) đã bị tiêu thụ, đồng thời glucose sinh ra cũng được dùng để cung cấp dinh dưỡng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.