3.2.1. Phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao
Nguyên tắc: Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền nhiệt của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và base mạnh. Các chất khác thường đi kèm theo cellulose là hemicellulose, lignin, tinh bột,… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu (AOAC, 1995).
Cân cốc phân tích sau khi sấy ở 105oC, 24 giờ Cân 1 g bột vỏ trái ca cao để vào cốc phân tích Cẩn thận lắp cốc vào máy phân tích hàm lượng xơ
Thêm 150 mL dung dịch H2SO4 1,25% Thêm vào 2-3 giọt dung dịch n- octanol, đun 30 phút
Rút hết dịch trong cốc
Lọc và rửa cặn bằng nước nóng 2-3 lần, rút hết dịch
Thêm 150 mL dung dịch NaOH 1,25% Thêm vào 2-3 giọt dung dịch n- octanol, đun 30 phút
Rút hết dịch trong cốc
Lọc và rửa cặn bằng nước nóng 2-3 lần, rút hết dịch
Lọc, tro hóa ở 550-600oC, 24 giờ và đem cân
Hình 9. Quy trình xác định hàm lƣợng cellulose vỏ trái ca cao
Khối lượng cellulose được tính theo công thức: (W2- W1)
% Cellulose = x 100 W
Trong đó: W khối lượng mẫu trước khi thủy phân (g) W1 khối lượng mẫu sau khi thủy phân (g) W2 khối lượng mẫu sau khi tro hóa (g)
3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC cellulose trên môi trƣờng CMC
Mục đích: Phân lập được những chủng vi khuẩn hiếu khí trên vỏ trái ca cao có khả năng phát triển trên môi trường CMC.
Tiến hành thí nghiệm:
- Ngâm vỏ trái ca cao trong nước cất đã được khử trùng. Lấy 0,01 mL các dung dịch mẫu tiến hành trải trên đĩa chứa môi trường CMC, lật ngược các đĩa, ủ trong 30o
C cho đến khi xuất hiện những khuẩn lạc.
- Quan sát và chọn những khuẩn lạc tiêu biểu tiến hành cấy chuyền vi khuẩn sang đĩa môi trường CMC. Quá trình cấy chuyển trên đĩa môi trường thạch được lặp lại nhiều lần cho đến độ thuần vi khuẩn được xác định.
- Sau khi được tách ròng, tiến hành kiển tra và mô tả đặc điểm hình thái của từng loại khuẩn lạc, đồng thời kiểm tra sơ bộ hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học. Mẫu vi khuẩn được hòa vào nước cất vô trùng, đặt trên miếng lam đã khử trùng bằng cồn 96o thực hiện quan sát mẫu dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100.
- Sau khi tạo được dòng thuần từ nguồn phân lập, tiến hành nhuộm Gram, thử catalase, thử oxydase, nhuộm bào tử và phương thức di chuyển.
3.2.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân
Mục đích: So sánh hoạt tính thủy phân của các chủng vi khuẩn được phân lập.
Tiến hành thí nghiệm:
- Dùng que cấy đã khử trùng chấm vào một khuẩn lạc trên đĩa petri.
- Dùng pipette man khuấy trộn đều vi khuẩn trong 300 μL nước cất vô trùng.
- Cho 25 μL dịch vi khuẩn vào lỗ đục đã khoét sẵn trên đĩa petri và chờ cho đến khi vi khuẩn đã ngấm hoàn toàn vào môi trường, đậy nắp đĩa và ủ ở 30oC cho đến khi vi khuẩn phát triển tốt.
- Nhuộm đĩa bằng thuốc thử Congo red.
- Xác định đường kính vòng tròn thủy phân của vi khuẩn.
3.2.4. Khảo sát khả năng phân giải vỏ trái ca cao
Mục đích:Đánh giá hiệu quả thuỷ phân vỏ trái ca cao của các chủng vi khuẩn trên cơ chất vỏ trái ca cao.
Tiến hành thí nghiệm:
Sử dụng 100 mL môi trường M1 lỏng (1 g vỏ trái ca cao khô/ 100 mL môi trường Delafield). Nguồn giống chủng được nuôi trong môi trường CMC lỏng trong 3 ngày, chủng với tỉ lệ 2%, tiến hành ủ ở 30oC. Ngoài khả năng phân giải tốt cellulose, vi khuẩn cũng cần phải đạt được hiệu quả sản sinh glucose nhất định, vì vậy quá trình đánh giá hiệu quả phân giải dựa vào 2 yếu tố trên được tiến hành sau 0, 3, 5, 7, 9 và 11 ngày.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Hàm lượng enzyme ngoại bào đo bằng phương pháp Bradford. - Hoạt tính vi khuẩn đo bằng phương pháp DNS.
- Phần chất rắn còn lại sau khi thủy phân.
3.2.5. Định danh chủng vi khuẩn phân giải cellulose bằng kỹ thuật sinh học phân tử tử
Chủng vi khuẩn phân giải cellulose từ kết quả thí nghiệm 3.2.4 được chọn để tiến hành định danh ở cấp độ loài.
Tóm tắt các bước để định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử:
- Ly trích DNA vi khuẩn.
- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ và điện di trên gel agarose 0,8%.
- Khuếch đại vùng gene mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi tổng hiệu.
- Kiểm tra hàm lượng và chất lượng sản phẩm sau khuếch đại bằng phương pháp quang phổ và điện di trên gel agarose 2%.
- Giải trình tự để định danh đến cấp loài.
- Dựa vào phần mềm BLAST để so sánh mức độ tương đồng với dữ liệu trên ngân hàng gene của NCBI (National Center for Biotechnology Information) trên trang
3.2.6. Khảo sát khả năng lên men ethanol
Mục đích: Xác định khả năng ứng dụng lên men ethanol từ dịch phân giải vỏ trái ca cao bằng vi khuẩn.
Tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành với chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose tốt nhất trong các thí nghiệm trên. Nguồn giống chủng Sacharomyces cerevisiae 2.1 được nuôi trong môi trường YEP (5 g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L glucose) ở 30oC. Sau khi đạt được mật số cần thiết: 108 tế bào/mL, chủng nấm được chuyển sang bình 100 mL chứa môi trường dịch thủy phân vi khuẩn có bổ sung Yeast extract, K2HPO4, MgSO4, chủng với tỷ lệ 1%. Bình nuôi cấy được giữ ở nhiệt độ phòng và lắc liên tục trong 5 ngày, pH ban đầu là 6,0.
Chỉ tiêu đánh giá:
- Hàm lượng glucose mất đi. - Lượng ethanol sinh ra.
- Hiệu suất lên men theo thời gian.
3.2.7. Xử lý số liệu, phân tích thống kê: Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV, USA. Microsoft Office Excel 2010 và Statgraphics Centurion XV, USA.
CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao
Vỏ trái ca cao có nguồn gốc từ huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ. Vỏ trái ca cao được nghiền mịn và sấy khô ở 70oC trong 3 ngày được sử dụng để xác định hàm lượng cellulose. Kết quả sau khi xử lý mẫu bằng kiềm và acid theo phương pháp Crube fibre (AOAC, 1995). Kết quả thu được hàm lượng cellulose có hàm lượng từ 38,02- 38,79% trọng lượng khô vỏ quả.
Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao (% trọng lƣợng khô)
Mẫu Lần lặp Khối lượng mẫu trước khi xử lý (g) Hàm lượng cellulose (%) Vỏ trái ca cao 1 1,0001 38,79 2 1,0008 38,73 3 1,0004 38,02 TB 1,0004 38,51
Kết quả trên phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây trong nền công nghiệp tái sử dụng các sản phẩm phụ từ vỏ trái ca cao. Greenwood-Barton (1965) trong nghiên cứu ứng dụng bổ sung vỏ trái ca cao vào khẩu phần ăn của gia súc đã xác định vỏ ca cao chiếm khoảng 75% trọng lượng quả, thành phần chính vỏ trái ca cao gồm 33,19- 39,45% xơ, 8,83-10,18% tro và 5,69- 9,69% protein thô. Năm 1967, Bateman và Fresnille cũng tiến hành một nghiên cứu tương tự như trên và công bố thành phần vỏ trái ca cao gồm có 35,4% xơ, 9,7% tro và 6,8% protein thô. Những nghiên cứu trên khẳng định rằng việc sử dụng vỏ trái ca cao đã được chú ý từ rất lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ đi sâu nghiên cứu việc sử dụng vỏ trái ca cao làm nguồn thức ăn bổ sung vào khẩu phần ăn của các loại gia súc. Thời gian gần đây, vỏ trái ca cao còn được chú ý tới như một nguồn nguyên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn. Một trong những nghiên cứu phải kể đến là của Samah et al. (2011) đã thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid chlohydric 1,0M. Kết quả thu được lượng đường có nồng độ 30,7% w/v, sau khi tiến hành lên men lượng ethanol thu được là 17,3% v/v. Với thành phần cellulose trung bình khoảng 38,51% và những thành phần hữu cơ khác thì vỏ trái ca cao là một nguồn dinh dưỡng tốt cho vi khuẩn phân hủy cellulose sinh sống.
4.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC cellulose trên môi trƣờng CMC
Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ vỏ trái ca cao hoại mục tự nhiên tại huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ và được kiển tra sơ bộ bằng cách cấy trải trên môi trường CMC. Mẫu được ủ ở 30oC, theo dõi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc khác nhau tiếp tục cấy truyền cho đến khi có chủng thuần. Kết quả cho thấy rằng những chủng vi khuẩn này đểu phát triển tốt sau 48 giờ ủ. Nhìn chung, 23 chủng vi khuẩn này có sự khác biệt tương đối về màu sắc, hình dạng và kích thước với nhau. Kết quả cho thấy có 15 chủng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn- màu trắng (PD1, PD2, PD4, PD5, PD6, PD7, PD9, PD10, PD11, PD12, PD13, PD14, PD15, PD19 và PD21), 1 chủng có dạng tròn- màu xám (PD8), 2 chủng có dạng hình tròn- màu vàng (PD20 và PD23), 1 chủng có dạng hình thoi- màu xám (PD3) và 4 dạng khuẩn lạc hình thoi- màu vàng (PD16, PD17, PD18 và PD22). Về độ nổi khuẩn lạc, thì có 17 chủng dạng bề mặt lài, 1 chủng có dạng bề mặt nổi gò và 5 chủng dạng bề mặt mô (Bảng 5). Tất cả các chủng vi khuẩn đều dương tính với thuốc thử catalase, có 4 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc màu vàng dương tính với thuốc thử oxydase, 19 chủng còn lại âm tính với loại thuốc thử này. Kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn có cả Gram âm và Gram dương. Đa số vi khuẩn ở dạng kết đôi hoặc kết chuỗi. Có một số ít chủng có khả năng chuyển động, các chủng còn lại không có khả năng chuyển động.
Bảng 5. Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn phân giải vỏ trái ca cao
STT Chủng Hình dạng, đặc tính khuẩn lạc
Hình dạng, đặc tính
vi khuẩn Gram Catalase Oxidase Bào
tử
1 PD1
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,4 mm.
Que ngắn đôi,
chuyển động + + _ _
2 PD2
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _
3 PD3
Hình thoi, màu trắng đục, bề mặt nổi gò, bìa
gợn sóng, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ -
4 PD4
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _
5 PD5
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,6 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _
6 PD6
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,0 mm.
Que ngắn đôi,
không chuyển động _ + _ +
7 PD7
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ -
8 PD8
Hình tròn, màu xám, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d
= 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _
9 PD9
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 0,75 mm
Chuỗi cầu, không
10 PD10
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,3 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _ 11 PD11 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm Que ngắn đôi, không chuyển động _ + _ _ 12 PD12 Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm. Que ngắn, không chuyển động _ + _ _ 13 PD13 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _ 14 PD14 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm. Que ngắn đôi, không chuyển động + + _ _ 15 PD15 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _ 16 PD16 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 1,5 mm Que ngắn đôi, chuyển động _ + + + 17 PD17 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 3,0 mm Que ngắn, chuyển động _ + + _ 18 PD18 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 1,75 mm
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + + + 19 PD19 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm Que ngắn, chuyển động _ + _ _ 20 PD20 Hình tròn, màu vàng,
d = 1,5 mm. chuyển động
21 PD21
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _ 22 PD22 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 2,0 mm Que ngắn đôi, chuyển động _ + + + 23 PD23 Hình tròn, màu vàng, bề mặt mô, bìa nguyên,
d = 1,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _
4.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose
Hai mươi ba chủng vi khuẩn hiếu khí được nuôi tăng sinh trong môi trường CMC lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sử dụng phương pháp nhỏ giọt trên lỗ thạch đường kính 4-5 mm để xác định khả năng thủy phân bằng cách nhuộm với thuốc thử congo red 0,1% (w/v) (Hình 34).
Hình 10. Đƣờng kính vòng tròn thủy phân sau 3 ngày của chủng PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21
Hình 11. Đƣờng kính vòng tròn thủy phân của 23 chủng vi khuẩn hiếu khí
Ghi chú: Các giá trị có cùng chữ khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu trong bảng là gí trị của ba lần lặp lại
Kết quả cho thấy có 20 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân môi trường CMC sau 3 ngày ủ ở 30oC, 3 chủng (PD10, PD16 và PD18) không có khả năng thủy phân tạo vòng tròn thủy phân rõ rệt, chúng chỉ tạo ra vòng tròn thủy phân ngay tại nơi khuẩn lạc bám. Nhìn chung, đa số các dòng vi khuẩn này đều có hoạt tính thấp với biểu hiện là đường kính vòng tròn thủy phân nhỏ hơn 10 mm. Trong đó, một số dòng vi khuẩn cũng sinh tổng hợp enzyme cellulase khá tốt với đường kính thủy phân lớn hơn 10 mm như dòng PD2 và PD5 tương ứng là 11 và 11,33 mm và khác biệt ý nghĩa với các dòng còn lại với độ tin cậy 95%. Từ kết quả trên, ta chọn được 5 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân CMC cho đường kính vòng tròn thủy phân cao nhất và khác biệt có ý nghĩa ở mức
độ 5% trong số 23 chủng bao gồm PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 để tiến hành thí nghiệm sau. Tuy nhiên, kết quả này vẫn còn tương đối thấp khi so sánh với nhiều nghiên cứu trên thế giới, ví dụ như đường kính thủy phân của Bacillus subtilis là 22 mm (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010).
4.4.Khả năng phân giải vỏ trái ca cao
Để đánh giá khả năng phân giải vỏ trái ca cao, 5 chủng vi khuẩn PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 được nuôi cấy trong môi trường M1 lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng (28- 31oC.
4.4.1. Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
Kết quả cho thấy lượng protein sinh ra của năm chủng vi khuẩn tăng tuyến tính từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm mạnh ở những ngày tiếp theo (Hình 36).Điều này là do cả 5 chủng vi khuẩn đều đạt mật số cao nhất ở ngày 4 và bắt đầu bước vào pha ổn định ở ngày 5 (Hình 37).
Hình 12. Hàm lƣợng protein sinh ra theo thời gian tƣơng ứng với 5 chủng vi khuẩn
Trong ngày 5, vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường và đạt mật số cao, do đó vi khuẩn cần tiết nhiều enzyme thủy phân cơ chất để tạo nguồn dinh dưỡng, kết hợp với lượng enzyme sinh ra ở ngày 4 nên hàm lượng protein sinh ra đạt giá trị cao. Hình 37 cho thấy vào ngày 5, chủng PD5 có hàm lượng protein cao nhất là 226,19 µg/mL, cũng