Chủng PD5 được chọn để ly trích DNA, khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng
cặp mồi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’, 1492R: 5’-
GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ (Akasaka et al., 2002) và định danh bằng kỹ thuật giải trình tự DNA vùng gen 16S rRNA. Sau đó, dùng chương trình BLAST N để so sánh trình tự đoạn DNA của dòng vi khuẩn với trình tự DNA của các loài vi khuẩn có trong ngân hàng dữ liệu NCBI, nhận diện từng dòng vi khuẩn.
Trong kết quả giải trình tự, đối với dòng PD5, tổng số nucleotide được giải là 1442, cụ thể: GGGGACCGGGTGACGCTACACATGACAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGC GGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACC GCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTG GTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTG AGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCAT GCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCT CATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCA AGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTC AACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAA AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCC TTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAA TGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGT CTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGG CCGGGAACTCAAAGGAAACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT ACGACCAGGGCTAACCACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAACGACCTCCCCAAGACAACCGACCTCATT AAGTTGTTCTTATCCCGGAT
Hình 19. Kết quả so sánh trên BLAST N của chủng PD5 so với chủng
Klebsiella variicola
Kết quả khi tra cứu trên BLAST N cho thấy chủng PD5 có trình tự tương đồng với trình tự của chủng vi khuẩn Klebsiella variicola với mức độ đồng hình là 99% (1243/1261) và có tỷ lệ khoảng trống (gaps) là 7/1261 (0%). Suen et al. (2010) đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải cellulose là
Klebsiella variicola và Pantoea sp. Kết quả phân tích bộ gene của cả 2 chủng này đều có chứa đoạn mã hóa cho enzyme phân giải các polymer ở thực vật, bao gồm: cellulases (β-1,4-glucanase; GH8), β-galactosidase (GH2), chitinase (GH18), α-xylosidase (GH31), α-mannosidase (GH47), α-rhamnosidase (GH78), và pectinesterase (CE8).
4.6.Khảo sát khả năng lên men ethanol
Chủng vi khuẩn 5 được chọn để tiến hành quá trình thủy phân vỏ ca cao. Sau 5 ngày thủy phân bằng vi khuẩn, dịch thủy phân được tiếp tục lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae (2.1). Mật số nấm men được chọn là 106 CFU/mL, pH là 6,0. Sau 5 ngày lên men, lượng ethanol thu được là 0,17% (v/v).
Bảng 6. Kết quả quá trình lên men dịch thủy phân vỏ trái ca cao
Lần lặp
Hàm lượng glucose trước lên men
(% w/v)
Hàm lượng glucose sau lên men
(% w/v) Hàm lượng ethanol (% v/v) 1 0,2343 0,009 0,1179 2 0,2345 0,009 0,1220 3 0,2394 0,011 0,1183
Phản ứng hóa học tổng quát quá trình lên men có thể viết tóm tắt như sau: C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2. Với khối lượng đường khử trước thủy phân là 2,244 g/100mL và thể tích ethanol thực tế thu được là 0,119 mL/100 mL, ta tính được hiệu suất lên men ethanol đạt tới 85%. Hiệu suất lên men khá cao, nhưng do lượng glucose ban đầu thấp nên lượng ethanol thu được thấp. Vậy, sản phẩm từ quá trình thủy phân vỏ trái ca cao bằng chủng vi khuẩn PD5 cho khả năng lên men ethanol và điều này góp phần làm phong phú nguồn ethanol sinh học ở Việt Nam.
CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Trong vỏ trái ca cao được khảo sát, thành phần cellulose chiếm 38,51%.
- Phân lập được 23 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển được trên môi trường CMC từ nguồn vỏ trái ca cao mục tự nhiên.
- Trong số 23 dòng vi khuẩn phân lập, chỉ có 20 chủng vi khuẩn phân giải CMC tạo vòng tròn đường kính thủy phân, trong đó các chủng PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 thể hiện hoạt tính mạnh nhất (6-11,33mm).
- Trên môi trường vỏ trái ca cao lỏng, hàm lượng đường khử do chủng vi khuẩn PD5 sinh ra ở ngày thứ 5 đạt giá trị cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với 4 chủng vi khuẩn còn lại với giá trị là 2,244 mg/mL và hàm lượng protein sinh ra là 226,19µg/mL. Hiệu suất thủy phân sau 11 ngày là 28,07%. Kết quả định danh cho thấy chủng vi khuẩn PD5 là Klebsiella variicola.
- Hiệu suất lên men đạt 85%.
5.2. Đề nghị
- Tối ưu hóa điều kiện để làm tăng khả năng sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, các acid amin và một số chất cảm ứng).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết. 2003. Thí nghiệm Công nghệ Sinh học T2. Thí nghiệm Vi sinh vật học. NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.
Nguyễn Thị Thanh Trúc. 2010. Tuyển chọn và khảo sát điều kiện nuôi cấy dòng vi khuẩn hiếu khí có khả năng thủy phân bã mía. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại Học Cần thơ
Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy. 2010. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng.
Văn Hữu Lộc. 2010.Tối ưu điều kiện nuôi cấy một số dòng vi khuẩn kỵ khí trên cơ chất vỏ trấu. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Viện NC và PT Công Nghệ Sinh Học. Trường Đại Học Cần thơ
Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose. Tạp chí khoa học2011:18a 177-184.
Tiếng Anh
Akasaka, H., T. Izawa, K. Ueki and A. Ueki. 2002. Phylogeny of numerically abundant culturable anaerobic bacteria associated with degradation of rice plant residue in Japanese paddy feld soil. Faculty of Agriculture, Yamagata University, Tsuruoka. 997-8555
Akhtar, M., Attridge, M. C., Myers, G. C., Kirk, T. K., and Blanchette, R. A. 1992. Biomechanical pulping of loblolly pine wih different strains of the white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora.
AOAC. 1955. Official Methods of Analysis (8th ed). Association of Agricultural Chemist, Washing, DC.
Baig, M. M. V., Baig, M. L. B., Baig, M. I. A., and Yasmeen, M. 2005. Saccharification of banana agro-waste by cellulolytic enzymes. African journal of Biotechnology,
3(9), 447-450.
Baig, M. M., Mane, V. P., More, D. R., Shinde, L. P., and Baig, M. I. 2003. Utilization of banana agricultural waste: production of cellulases by soil fungi. Journal of
environmental biology/Academy of Environmental Biology, India, 24(2), 173.
Barbesgaard, P. O., Jensen, G. W., and Holm, P. 1984. U.S. Patent No. 4,435,307. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.
Belghith, H., Ellouz-Chaabouni, S., and Gargouri, A. 2001. Biostoning of denims by< i> Penicillium occitanis</i>(Pol6) cellulases. Journal of biotechnology, 89(2), 257- 262.
Betts, W. B., Dart, R. K., Ball, A. S., and Pedlar, S. L. 1991. Biosynthesis and structure of lignocellulose. In Biodegradation (pp. 139-155). Springer London.
Boer, W. D., Folman, L. B., Summerbell, R. C., and Boddy, L. 2005. Living in a fungal world: impact of fungi on soil bacteria niche development. FEMS Microbiology Reviews 29 (4), 795-811.
Boerjan, W., Ralph, J., and Baucher, M. 2003. Lignin biosynthesis. Annual review of plant biology, 54(1), 519-546.
Bon EPS and Ferrara MA. 2007. Bioethanol production via enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. http://www.fao.org/biotech/seminaroct2007.html.
Bothast, R. J., and Saha, B. C. 1997. Ethanol production from agricultural biomass substrates. Advances in applied microbiology, 44, 261-286.
Bradford, M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72: 142-146,
Brown Jr, R. M., and Saxena, I. M. 2000. Cellulose biosynthesis: a model for understanding the assembly of biopolymers. Plant Physiology and Biochemistry,
38(1), 57-67.
Çinar, I. 2005. Effects of cellulase and pectinase concentrations on the colour yield of enzyme extracted plant carotenoids. Process Biochemistry, 40(2), 945-949.
Clarkson, K. A., Larenas, E., Shoemaker, S., and Weiss, G. L. 2000. U.S. Patent No. 6,162,782. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.
Cortez, J. M., Ellis, J., and Bishop, D. P. 2001. Cellulase finishing of woven, cotton fabrics in jet and winch machines. Journal of biotechnology, 89(2), 239-245.
Dam JV, Gosselnk R and Jong E 2008. Lignin applications.
Galante YM, De Conti A, Monteverdi R . 1998. Application of Trichoderma enzymes in the food and feed industries. In: Harman GE, Kubicek CP (eds) Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis, London, pp 327–342
Greenwood-Barton, L. H. .1965. Utilization of cocoa by-products. Fd Mf. 40 (5), 52-56. Hatakka AI .1983. Biological pretreatment of lignocellulose. Applied Microbiol.
Biotechnol. 18:350-357.
Haq-Ikram-ul, M. M. J., Khan, T. S., and Siddiq, Z. 2005. Cotton saccharifying activity of cellulases produced by co-culture of Aspergillus niger and Trichoderma viride. Res. J. Agric and Biol. Sci, 1(3), 241-245.
Howard, R. L., Abotsi, E., Van Rensburg, E. J., and Howard, S. 2004. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal of Biotechnology, 2(12), 602-619.
Hsu, J. C., and Lakhani, N. N. 2002. U.S. Patent No. 6,413,363. Washington, DC: U.S. Patent and Trade
Kottwitz, B., and Schambil, F. 2004. U.S. Patent Application 10/897,898.
Lee, S. S., Ha, J. K., Kang, H. S., Mcallister, T. A., and Cheng, K. J. 1997. Overview of energy metabolism, substrate utilization and fermentation characteristics of ruminal anaerobic fungi. Korean Journal of Animal Nutrition and Feedstuffs, 21.
Lee, R. L., P. J. Weimer, W. H. Zyl and I. S. Pretorius. 2002. Microbial Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular biology reviews.506–577.
Lewis, N. G., and Yamamoto, E. 1990. Lignin: occurrence, biogenesis and biodegradation. Annual review of plant biology, 41(1), 455-496.
Lynd, L. R., Weimer, P. J., Van Zyl, W. H., and Pretorius, I. S. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiology and molecular biology reviews, 66(3), 506-577.
McCarter, J. D., and Stephen Withers, G. 1994. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Current opinion in structural biology, 4(6), 885-892.
McCrady, E. 1991. The nature of lignin. Alkaline Paper Advocate, 4(4), 33-34.
Miettinen-Oinonen, A. 2004. Trichoderma reesei strains for production of cellulases for the textile industry.
Miller, G. L. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical chemistry, 31(3), 426-428.
Miyamoto, K. (Ed.). 1997. Renewable biological systems for alternative sustainable energy production (Vol. 128). FAO.
modification of the properties of natural fibres. Biotechnology and Molecular Biology Review, September, 1(3), 76-86.
Öhgren, K., Bengtsson, O., Gorwa-Grauslund, M. F., Galbe, M., Hahn-Hägerdal, B., and Zacchi, G. 2006. Simultaneous saccharification and co-fermentation of glucose and xylose in steam-pretreated corn stover at high fiber content with< i> Saccharomyces cerevisiae</i> TMB3400. Journal of Biotechnology, 126(4), 488- 498.
Olson, L. A. 1990. U.S. Patent No. 4,912,056. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.
Pajunen, E. 1986. Optimal use of-glucanases in wort production. In EBC-Symposium on wort production, Monograph XI, Maffliers, France (pp. 137-48).
Pizzi A and Eaton N. 1985. The structure of cellulose by conformational analysis: The cellulose polymer chain. J. Macromol. Sci. Chem. 22:105-137
Prasad, D. Y., Heitmann, J. A., and Joyce, T. W. 1992. Enzyme deinking of black and white letterpress printed newsprint waste. Progress in Paper Recycling, 1(3), 21-30. Rajesh, R., Arthe, R., Rajesh, E. M., Rajendran, R., and Jeyachandran, S. 2008.
Production of bio-ethanol from cellulosic cotton waste through microbial extracellular enzymatic hydrolysis and fermentation. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 7(6), 2948-2958
Rani, K. S., Swamy, M. V., and Seenayya, G.. 1997. Increased ethanol production by metabolic modulation of cellulose fermentation in Clostridium thermocellum. Biotechnology letters, 19(8), 819-823.
Richard, T. 1996. The effect of lignin on biodegradability. Cornell composting.
Ryckeboer, J., J. Megaert, J. Coosemans, K. Deprins, J. Swings. 2003. Microbiological aspects of biowaste during composting in a monitored compost bin. J. Appl Microbiol. 94: 127 – 137
Samah, O. A., Sias, S., Hua, Y. G., and Hussin, N. N. 2011. Production of Ethanol from Cocoa Pod Hydrolysate. ITB Journal of Science, 43 (2), 87-94.
Scherrer, R. 1984. Gram's staining reaction, Gram types and cell walls of bacteria.
Trends in Biochemical Sciences, 9(5), 242-245.
Schwarz, W. 2001. The cellulosome and cellulose degradation by anaerobic bacteria.
Singh, A., and Hayashi, K. 1995. Microbial cellulases: protein architecture, molecular properties, and biosynthesis. Advances in applied microbiology, 40, 1-44.
Singh, A., N. Singh., N.R. Bishnoi. 2009. Production of Cellulases by Aspergillus Heteromorphus from Wheat Straw under Submerged Fermentation. International Journal of Civil and Environmental Engineering 1:1.
Sjostrom, E. 1993. Wood chemistry: fundamentals and applications. Access Online via Elsevier.
Suen, G., Scott, J. J., Aylward, F. O., Adams, S. M., Tringe, S. G., Pinto-Tomás, A. A., ... and Currie, C. R. 2010. An insect herbivore microbiome with high plant biomass- degrading capacity. PLoS genetics, 6(9), e1001129.
Sukumaran, R. K., Singhania, R. R., and Pandey, A. 2005. Microbial cellulases- Production, applications and challenges. Journal of Scientific and Industrial Research, 64(11), 832.
Sun, Y., and Cheng, J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource technology, 83(1), 1-11.
Uhlig, H. 1998. Industrial enzymes and their applications (p. 435). New York: Wiley. Videbaek, T, and Andersen, L. 1993. A process for defuzzing and depilling cellulosic
fabrics. Pat. WO, 93, 20278.
Wilson, J. C., Newstead, S. L., Potter, J. A., Xu, G., Chien, C. H., Watts, A. G., ... and Taylor, G. L. 2008. The structure of Clostridium perfringens NanI sialidase and its catalytic intermediates. Journal of Biological Chemistry, 283(14), 9080-9088.
Wyman, C. E., Bain, R. L., Hinman, N. D., and Stevens, D. J. 1993. Renewable Energy: Sources for fuels and electricity.
Xia, L., and Cen, P. 1999. Cellulase production by solid state fermentation on lignocellulosic waste from the xylose industry. Process Biochemistry, 34(9), 909- 912.
Trang web
http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/2/2/80305/Phat-trien-cay-ca-cao-VN-Can-day-
manh-giai-phap-ky-thuat.aspx (Ngày 18/07/2013)
http://www.nhandan.org.vn/tinbai/?top=38&sub=131& article= 62100 (Ngày 24/11/2009)
http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose (Ngày 06/08/2013) http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulase (Ngày 06/08/2013) http://www.duoclieu.org/2012/01/cellulose.html (Ngày 06/08/2013) http://www2.ac- lyon.fr/enseigne/biotech/galerie/champignons/tableau/champignons.html (Ngày 04/08/2013) http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Clostridium(Ngày 04/08/2013) http://web.mst.edu/~microbio/BIO221_2010/S_plantensis.html (Ngày 04/08/2013) http://www.bio.miami.edu/dana/226/226F07_3.html (Ngày 06/08/2013) http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/FUNDAMNT/hemicel.gif (Ngày 06/08/2013)
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Phƣơng pháp vi sinh- sinh hóa
1. Phương pháp pha loãng vi sinh vật: việc pha loãng mẫu được thực hiện bằng nước cất. Khi pha loãng, cần đưa ống chứa mẫu lên máy vortex để trộn đều mẫu.
Nguyên tắc: dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần phải pha loãng mẫu. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml (Nguyễn Đức Lượng, 2003).
2. Phƣơng pháp mô tả khuẩn lạc:
Mục tiêu: mô tả một số đặc điểm hình thái của khuẩn lạc bao gồm: độ nổi, dạng bìa, màu sắc, kích thước khuẩn lạc.
Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, nước vô trùng, kính lúp.
Các bước tiến hành:
- Cấy vi khuẩn lên đĩa petri có môi trường rắn, vi khuẩn sẽ phát triển thành những hình dạng đặc biệt gọi là khuẩn lạc. Khuẩn lạc là tập đoàn vi khuẩn sinh ra từ một tế bào hay một bào tử có trước. Tùy theo cách phát triển của từng nhóm vi sinh vật mà khuẩn lạc có độ nổi, hình dạng, màu sắc, kích thước khác nhau. Dựa vào đặc điểm đó, ta có thể mô tả khuẩn lạc dưới kính lúp:
- Hình dang: dạng tròn đều, dạng thoi, rễ cây, rễ cây dạng sợi.
- Độ nổi: dạng phẳng, dạng mô, dạng lài, dạng nổi gò, dạng nổi bướu, dạng nổi hố.
- Dạng bìa: bìa nguyên, bìa gợn sóng, bìa răng cưa, bìa sợi.
- Màu sắc: trắng trong, trắng đục, vàng, xám, đỏ, lục.
- Kích thước: khi bắt đầu hình thành thì có thể bằng đầu kim (1-2mm) và phát triển ngày càng rộng ra có thể chiếm hết dĩa petri.
3. Phƣơng pháp mô tả khuẩn lạc bằng kính hiển vi quang học.
Mục tiêu: mô tả một số đặc điểm hình thái của vi khuẩn bao gồm hình dạng (cầu, que, xoắn, dấu phẩy), kích thước (0,2 đến 2 μm), trạng thái ( đơn lẻ, kết đôi, kết chuỗi, kết chùm), khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, nước vô trùng, kính lúp.
Các bước tiến hành:
- Nhỏ một giọt nước cất lên kính mang vật. - Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn.
- Chấm đầu kim cấy vào khuẩn lạc, hòa vi khuẩn vào nước cất trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước ở kính mang vật sao cho không có bọt khí..
- Quan sát hình dạng, trạng thái, sự chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 10X rồi vật kính 40X và 100X.
- Đo kích thước vi khuẩn bằng thước trắc vi thị kính và trắc vi vật kính. - Quan sát sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt.
4. Phƣơng pháp nhuộm Gram vi khuẩn.
Mục đích: Xác định loại Gram của vi khuẩn theo phương pháp nhuộm Gram của (Scherrer, 1984)
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau
- Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này là vi khuẩn gram dương.
- Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi