CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao
Vỏ trái ca cao có nguồn gốc từ huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ. Vỏ trái ca cao được nghiền mịn và sấy khô ở 70oC trong 3 ngày được sử dụng để xác định hàm lượng cellulose. Kết quả sau khi xử lý mẫu bằng kiềm và acid theo phương pháp Crube fibre (AOAC, 1995). Kết quả thu được hàm lượng cellulose có hàm lượng từ 38,02- 38,79% trọng lượng khô vỏ quả.
Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lƣợng cellulose trong vỏ trái ca cao (% trọng lƣợng khô)
Mẫu Lần lặp Khối lượng mẫu trước khi xử lý (g) Hàm lượng cellulose (%) Vỏ trái ca cao 1 1,0001 38,79 2 1,0008 38,73 3 1,0004 38,02 TB 1,0004 38,51
Kết quả trên phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây trong nền công nghiệp tái sử dụng các sản phẩm phụ từ vỏ trái ca cao. Greenwood-Barton (1965) trong nghiên cứu ứng dụng bổ sung vỏ trái ca cao vào khẩu phần ăn của gia súc đã xác định vỏ ca cao chiếm khoảng 75% trọng lượng quả, thành phần chính vỏ trái ca cao gồm 33,19- 39,45% xơ, 8,83-10,18% tro và 5,69- 9,69% protein thô. Năm 1967, Bateman và Fresnille cũng tiến hành một nghiên cứu tương tự như trên và công bố thành phần vỏ trái ca cao gồm có 35,4% xơ, 9,7% tro và 6,8% protein thô. Những nghiên cứu trên khẳng định rằng việc sử dụng vỏ trái ca cao đã được chú ý từ rất lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ đi sâu nghiên cứu việc sử dụng vỏ trái ca cao làm nguồn thức ăn bổ sung vào khẩu phần ăn của các loại gia súc. Thời gian gần đây, vỏ trái ca cao còn được chú ý tới như một nguồn nguyên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn. Một trong những nghiên cứu phải kể đến là của Samah et al. (2011) đã thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid chlohydric 1,0M. Kết quả thu được lượng đường có nồng độ 30,7% w/v, sau khi tiến hành lên men lượng ethanol thu được là 17,3% v/v. Với thành phần cellulose trung bình khoảng 38,51% và những thành phần hữu cơ khác thì vỏ trái ca cao là một nguồn dinh dưỡng tốt cho vi khuẩn phân hủy cellulose sinh sống.
4.2. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn từ vỏ trái ca cao có khả năng phân giải cellulose trên môi trƣờng CMC cellulose trên môi trƣờng CMC
Tổng cộng có 23 chủng vi khuẩn hiếu khí được phân lập từ vỏ trái ca cao hoại mục tự nhiên tại huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ và được kiển tra sơ bộ bằng cách cấy trải trên môi trường CMC. Mẫu được ủ ở 30oC, theo dõi cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc khác nhau tiếp tục cấy truyền cho đến khi có chủng thuần. Kết quả cho thấy rằng những chủng vi khuẩn này đểu phát triển tốt sau 48 giờ ủ. Nhìn chung, 23 chủng vi khuẩn này có sự khác biệt tương đối về màu sắc, hình dạng và kích thước với nhau. Kết quả cho thấy có 15 chủng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc hình tròn- màu trắng (PD1, PD2, PD4, PD5, PD6, PD7, PD9, PD10, PD11, PD12, PD13, PD14, PD15, PD19 và PD21), 1 chủng có dạng tròn- màu xám (PD8), 2 chủng có dạng hình tròn- màu vàng (PD20 và PD23), 1 chủng có dạng hình thoi- màu xám (PD3) và 4 dạng khuẩn lạc hình thoi- màu vàng (PD16, PD17, PD18 và PD22). Về độ nổi khuẩn lạc, thì có 17 chủng dạng bề mặt lài, 1 chủng có dạng bề mặt nổi gò và 5 chủng dạng bề mặt mô (Bảng 5). Tất cả các chủng vi khuẩn đều dương tính với thuốc thử catalase, có 4 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc màu vàng dương tính với thuốc thử oxydase, 19 chủng còn lại âm tính với loại thuốc thử này. Kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn có cả Gram âm và Gram dương. Đa số vi khuẩn ở dạng kết đôi hoặc kết chuỗi. Có một số ít chủng có khả năng chuyển động, các chủng còn lại không có khả năng chuyển động.
Bảng 5. Hình dạng và đặc tính vi khuẩn, khuẩn lạc của 23 chủng vi khuẩn phân giải vỏ trái ca cao
STT Chủng Hình dạng, đặc tính khuẩn lạc
Hình dạng, đặc tính
vi khuẩn Gram Catalase Oxidase Bào
tử
1 PD1
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,4 mm.
Que ngắn đôi,
chuyển động + + _ _
2 PD2
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _
3 PD3
Hình thoi, màu trắng đục, bề mặt nổi gò, bìa
gợn sóng, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ -
4 PD4
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _
5 PD5
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,6 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _
6 PD6
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,0 mm.
Que ngắn đôi,
không chuyển động _ + _ +
7 PD7
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 3,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ -
8 PD8
Hình tròn, màu xám, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d
= 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _
9 PD9
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 0,75 mm
Chuỗi cầu, không
10 PD10
Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,3 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _ 11 PD11 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm Que ngắn đôi, không chuyển động _ + _ _ 12 PD12 Hình tròn, màu trắng trong, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 1,5 mm. Que ngắn, không chuyển động _ + _ _ 13 PD13 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,5 mm.
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _ 14 PD14 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm. Que ngắn đôi, không chuyển động + + _ _ 15 PD15 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 1,0 mm.
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + _ _ 16 PD16 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 1,5 mm Que ngắn đôi, chuyển động _ + + + 17 PD17 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 3,0 mm Que ngắn, chuyển động _ + + _ 18 PD18 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 1,75 mm
Chuỗi cầu, chuyển
động _ + + + 19 PD19 Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt lài, bìa nguyên, d = 2,0 mm Que ngắn, chuyển động _ + _ _ 20 PD20 Hình tròn, màu vàng,
d = 1,5 mm. chuyển động
21 PD21
Hình tròn, màu trắng đục, bề mặt mô, bìa nguyên, d = 2,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động + + _ _ 22 PD22 Hình thoi, màu vàng, bề mặt lài, bìa gợn sóng, d = 2,0 mm Que ngắn đôi, chuyển động _ + + + 23 PD23 Hình tròn, màu vàng, bề mặt mô, bìa nguyên,
d = 1,0 mm
Chuỗi cầu, không
chuyển động _ + _ _
4.3. Tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính thủy phân cellulose
Hai mươi ba chủng vi khuẩn hiếu khí được nuôi tăng sinh trong môi trường CMC lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sử dụng phương pháp nhỏ giọt trên lỗ thạch đường kính 4-5 mm để xác định khả năng thủy phân bằng cách nhuộm với thuốc thử congo red 0,1% (w/v) (Hình 34).
Hình 10. Đƣờng kính vòng tròn thủy phân sau 3 ngày của chủng PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21
Hình 11. Đƣờng kính vòng tròn thủy phân của 23 chủng vi khuẩn hiếu khí
Ghi chú: Các giá trị có cùng chữ khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu trong bảng là gí trị của ba lần lặp lại
Kết quả cho thấy có 20 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân môi trường CMC sau 3 ngày ủ ở 30oC, 3 chủng (PD10, PD16 và PD18) không có khả năng thủy phân tạo vòng tròn thủy phân rõ rệt, chúng chỉ tạo ra vòng tròn thủy phân ngay tại nơi khuẩn lạc bám. Nhìn chung, đa số các dòng vi khuẩn này đều có hoạt tính thấp với biểu hiện là đường kính vòng tròn thủy phân nhỏ hơn 10 mm. Trong đó, một số dòng vi khuẩn cũng sinh tổng hợp enzyme cellulase khá tốt với đường kính thủy phân lớn hơn 10 mm như dòng PD2 và PD5 tương ứng là 11 và 11,33 mm và khác biệt ý nghĩa với các dòng còn lại với độ tin cậy 95%. Từ kết quả trên, ta chọn được 5 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân CMC cho đường kính vòng tròn thủy phân cao nhất và khác biệt có ý nghĩa ở mức
độ 5% trong số 23 chủng bao gồm PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 để tiến hành thí nghiệm sau. Tuy nhiên, kết quả này vẫn còn tương đối thấp khi so sánh với nhiều nghiên cứu trên thế giới, ví dụ như đường kính thủy phân của Bacillus subtilis là 22 mm (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010).
4.4.Khả năng phân giải vỏ trái ca cao
Để đánh giá khả năng phân giải vỏ trái ca cao, 5 chủng vi khuẩn PD2, PD5, PD6, PD8 và PD21 được nuôi cấy trong môi trường M1 lỏng, lắc ủ ở nhiệt độ phòng (28- 31oC.
4.4.1. Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
Kết quả cho thấy lượng protein sinh ra của năm chủng vi khuẩn tăng tuyến tính từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm mạnh ở những ngày tiếp theo (Hình 36).Điều này là do cả 5 chủng vi khuẩn đều đạt mật số cao nhất ở ngày 4 và bắt đầu bước vào pha ổn định ở ngày 5 (Hình 37).
Hình 12. Hàm lƣợng protein sinh ra theo thời gian tƣơng ứng với 5 chủng vi khuẩn
Trong ngày 5, vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường và đạt mật số cao, do đó vi khuẩn cần tiết nhiều enzyme thủy phân cơ chất để tạo nguồn dinh dưỡng, kết hợp với lượng enzyme sinh ra ở ngày 4 nên hàm lượng protein sinh ra đạt giá trị cao. Hình 37 cho thấy vào ngày 5, chủng PD5 có hàm lượng protein cao nhất là 226,19 µg/mL, cũng có thể kết luận rằng hoạt tính enzyme sinh ra cũng đạt giá trị cao nhất ở ngày 5. Khi đo ở ngày 0, vẫn xuất hiện protein, điều này có được là do trong vỏ trái ca cao có khoảng 5,69-9,69% hàm lượng protein thô (Greenwood-Barton,1965). Hàm lượng protein tăng nhẹ từ ngày 1 đến ngày 3, do trong giai đoạn này vi khuẩn chưa thích nghi tốt, đồng thời
mật số chưa cao. Từ ngày 3 đến ngày 5, hàm lượng protein tăng khoảng 3 lần là do vi khuẩn đã đạt được mật số cao nhất trong ngày 4 và vi khuẩn cũng đã thích nghi với môi trường mới nên lượng enzyme sinh ra nhiều làm cho hàm lượng protein có sự tăng mạnh. Các ngày sau đó hàm lượng protein giảm mạnh là do đây là thời kỳ vi khuẩn chết dần, đồng thời lượng protein giảm còn có thể do protein bị biến tính nên đã bám vào cơ chất làm cho kết quả xác định protein giảm chỉ còn khoảng 27 µg/mL. Khi so sánh kết quả thu được với hàm lượng protein sinh ra bởi dòng vi khuẩn Acinetobacter phân lập (Văn Hữu Lộc, 2010) sau 5 ngày là 190 µg/mL và chủng vi khuẩn 22 (Nguyễn Thị Thanh Trúc, 2010) là 141,56 µg/mL thì kết quả trong thí nghiệm thu được tốt hơn.
Hình 13. Đƣờng tăng trƣởng của dòng PD2
4.4.2. Khảo sát lượng đường khử sinh ra bằng phương pháp DNS
Hình 14. Ảnh hƣởng của thời gian đến hàm lƣợng glucose sinh ra
Kết quả thống kê theo từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng glucose sinh ra là có ý nghĩa ở mức độ 5%. Theo đó, khi thời gian ủ tăng lên từ 0-
5 ngày, hàm lượng glucose cũng tăng lên tương ứng từ 0,01- 0,201% (w/v). Tuy nhiên, trong khoảng thời gian từ 5-11 ngày, lượng glucose được ghi nhận có xu hướng giảm liên tục từ 0,201- 0,018% (w/v) (Hình 38). Điều này được giải thích dựa trên tỷ lệ giữa lượng glucose sinh ra và lượng bị tiêu thụ bởi vi khuẩn. Theo đó, trong 5 ngày đầu, cơ chất còn mới, phần lớn carbohydrate trong vỏ và một phần glucose sinh ra bị vi khuẩn sử dụng để tăng sinh khối nhưng do hoạt động phân giải cellulose diễn ra mạnh nên lượng glucose vẫn đạt mức cao. Tuy nhiên, ở những khoảng thời gian sau đó, carbohydrate bị tiêu thụ gần hết, cấu trúc cellulose chỉ còn lại những thành phần khó bị phân giải dẫn đến sự giảm hiệu suất sản sinh glucose.
Hình 15. Ảnh hƣởng của chủng vi khuẩn đến hàm lƣợng glucose sinh ra
Kết quả thống kê theo nhân tố loại vi khuẩn chỉ ra rằng chủng PD5 cho hoạt tính phân giải cellulose cao nhất tương ứng với lượng glucose sinh ra là 0,091% (w/v) (Hình 39). Điều này có thể được lý giải thông qua khả năng phát triển nhanh và thích ứng với môi trường mới, đồng thời khả năng di chuyển cũng là một điểm mạnh của chủng PD5.
Hình 16. Hàm lƣợng glucose sinh ra theo thời gian tƣơng ứng với 5 chủng vi khuẩn
Nhìn chung, biểu đồ thể hiện sự thay đổi hàm lượng đường khử của 5 chủng vi khuẩn qua 11 ngày nuôi cấy phù hợp với hàm lượng protein có trong dịch thủy phân (Hình 40).Hàm lượng đường khử đo được qua các ngày cho thấy hoạt tính enzyme tăng từ ngày 0 đến ngày 5, sau đó giảm mạnh. Ở ngày 0 vẫn xác định được một lượng đường khử thấp, lượng đường khử này chính là glucose có sẵn trong vỏ trái ca cao do trong thành phần vỏ trái ca cao có khoảng 1,16- 3,92% (w/w) glucose (Greenwood-Barton, 1965). Lượng đường khử này tăng dần cho đến ngày thứ 5 thì cao nhất do đây là giai đoạn phát triển mạnh nhất của vi khuẩn. Tại ngày 5, chủng vi khuẩn PD5 thủy phân vỏ trái ca cao cho ra lượng đường khử cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các chủng khác với giá trị là 2,244 mg/mL, hiệu suất sinh đường khử tương ứng là 0,2244% (w/v). Những ngày sau đó, lượng đường khử giảm dần và còn rất thấp ở ngày 11 là 0,2 mg/mL. Nguyên nhân có sự sụt giảm trên là do hoạt tính thủy phân của enzyme giảm, vi khuẩn không thể tiêu thụ được cellulose nữa nên đã tiêu thụ phần đường khử sinh ra (Laurent et al., 2000). Sự giảm hoạt tính sau 5 ngày có thể là do sự tích lũy các phân tử cellobiose, được công bố là gây nên sự ức chế hoạt động của cả endoglucanase và β- glucosidase (Singh et al., 1995). Theo Hatakka (1983), sự hình thành của các hợp chất vòng thơm hấp thụ nước cũng ngăn chặn hoạt động thuỷ phân cellulose của enzyme.
Chủng PD5 được chọn là chủng vi khuẩn thủy phân cơ chất cho ra lượng đường khử cao nhất so với các chủng khác với thời gian thích hợp là 5 ngày, đạt 2,244 mg/mL. Kết quả đưa ra từ thí nghiệm này tương đương với nghiên cứu của Singh et al. (2009) khi tiến hành thủy phân rơm từ cây lúa mỳ bằng chủng Aspergillus heteromorphus và thu được lượng đường khử cao nhất là 1,407 mg/mL sau 5 ngày nuôi cấy. Baig et al. (2005) đã tiến hành thủy phân các sản phẩm phụ từ cây chuối bằng chủng nấm mốc
Trichoderma lignorum, lượng đường khử sinh ra bằng 1,34mg/mL sau 24 giờ thủy phân.
Hình 17. Hiệu suất thủy phân vỏ trái ca cao của 5 chủng vi khuẩn
Ghi chú: Các giá trị có cùng chữ khác biệt không ý nghĩa, mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu trong bảng là gí trị của ba lần lặp lại
Hiệu suất thủy phân của 5 chủng vi khuẩn sau 11 ngày thủy phân được thể hiện ở Hình 41. Chủng PD5 thủy phân vỏ trái ca cao hiệu quả nhất và có giá trị khác biệt có ý nghĩa ở mức độ thống kê 5% so với 4 chủng vi khuẩn được chọn và có giá trị là 28,07% trọng lượng khô vỏ quả. Nghiên cứu của Võ Văn Phước Quệ và Cao Ngọc Điệp (2011) đã tiến hành thủy phân rơm rạ bằng 2 chủng vi khuẩn yếm khí được phân lập từ dạ cỏ bò, Cellulomonas flavigena và chủng Bacillus megaterium,kết quả cho thấy, sau 10 ngày hiệu suất thủy phân từ 53,6-55,93% .
Kết quả hiệu suất thủy phân nêu trên cho thấy chủng vi khuẩn PD5 có tiềm năng trong việc phân giải vỏ trái ca cao. Đồng thời lượng chất khô mất đi sau quá trình thủy phân (28,07%) lớn hơn lượng glucose ghi nhận được (22,44%). Điều này có thể khẳng