Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn streptomyces 15 2 9

Ngày càng có nhiều kháng sinh được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hay bán tổng hợp nhưng con người vẫn không quên tìm kiếm các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên.. Các ứng dụng của kh

(KHÓA LUẬN TỐT NGHỆP DUỢC s ĩ KHÓA 1999 - 2004)

Giáo viên hướng dẫn : TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội

Thời gian thực hiện : 15/10/2003 -15/05/2004

m

HÀ NỘI, 05-2004

í Mít âu i/ỉp II< 11/ lời dein, ạửi lềi eâtn ổn tói (títe ihàịỊ ííô tịiáo, Uịị thuật

tùêtt Oĩồ tuồn (¿ồtiíỊ (ìịụíỉiêp f/)u'ổet eáe phũtụ/ ban trümj ^ỉrtiỉimỊ (£)ai UC)Ọe

■ t)tiổe '3f)ỀL xjfatt’ tìiêti 3£h.ơ€L ^7ỗọe 3Cụ, CJhuät eùtiự bạn bè từi ạÙL đinh (Tã (Ịttíp itõ', ta& điều kiên thuẠn Iđi chíì tỗi tr&ttự m ốt thài tịian họe tập lại

trtíÝUiỊỊ eũ m ị nhu' th itc h iên lú iố a luân

tjỗi dtin ehăn thành, (iảni tín

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2004

Sinh, Iiìêỉi

Quách Thị Lê Hà

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về kháng sinh 2

1.1.1 Định nghĩa .2

1.1.2 Các ứng dụng của kháng sinh 2

ỉ 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh 2

1.2 Đặc điểm của xạ khuẩn (Actinomycetes) 4

1.2.1 Đặc điểm chung 4

1.2.2 Phân loại Streptomyces 4

1.3 Tuyển chọn và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 5

1.3.1 Phân lập giống xạ khuẩn 5

1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên 5

1.3.3 Đột biến cải tạo giống 5

1.3.4 Bảo quản giôhg xạ khuẩn 6

1.4 Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi sinh yật 6

1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .7

1.5.1 Bản chất của quá trình lên m e n 7

1.5.2 Các phương pháp lên m en 8

1.6 Tách và thu nhận các sản phẩm của quá trình lên m en 10

ỉ 6.1 Mở đầu 10

1.6.2 Các phương pháp chiết tách 10

1.7 Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong một số nghiên cứu sinh tổng hợp

kháng sinh gần đây 12

1.7.1 Kỹ thuật P C R 12

1.7.2 Nghiên cứu tiểu phẩn 20- kDa của enzym 2- Deoxy- scyllo- inosose (DOI) synthase 13

1.7.3 Nghiên cứu lên men Streptomyces ỉividans biến đổi gen sản xuất quy mô lớn tác nhân hoại tử khối u chuột a (m T N F a ) 14

1.8 Dùng sinh khối v s v để thu hồi ion Zn2+ 15

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16

2.1 Nguyên liệu 16

2.1.1 Giống xạ khuẩn 16

2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định 16

2.1.3 Môi trường 16

2.1.4 Dụng cụ và hoá chất 19

2.2 Phương pháp thực nghiệm 21

2.2.1 Phương pháp giữ giống 21

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuy ếch tán 21

2.2.3 Phương pháp cải tạo giống vi sinh vật 22

2.2.4 Phương pháp xác định các môi trường nuôi cấy thích hợp 24

2.2.5 Phương pháp lên men gián đ o ạ n 24

2.2.6 Phương pháp xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men .25

2.2.7 Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 26

2.2.8 Tách kháng sinh bằng phương pháp trao đổi ion 26

2.2.9 Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào 27

2.2.10 Tách kháng sinh bằng phương pháp sắc k ý 27

2.2.11 Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP .28

2.3.1 Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 15.2.9 sinh tổng hợp.29

2.3.2 Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 30

2.3.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên giống xạ khuẩn 31

2.3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống 32

2.3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 33

2.3.6 Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sin h 35

2.3.7 Độ ổn định của dịch lọc theo thời gian 35

2.3.8 Kết quả chiết xuất và tinh ch ế 35

2.3.9 Kết quả thử kháng sinh nội bào 38

2.3.10 Hình thái và phân loại xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9 38

2.4 Bàn lu ậ n 39

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 40

3.1 Kết luận .40

3.2 Đề xuất 40

CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT

ADN: Acid deoxyribonucleic

AET: Anionic Enzym Tension active

Be: Bacillus cereus ATCC 9946

Bp: Bacillus pumilus ATCC 6633

Bs: Bacillus subtilis ATCC 6633

D(mm): Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn tính theo milimet

Ec: Escherichia coli ATCC 25922

ISP: (The International Streptomyces Project) Chương trình Streptomyces quốc tế

MT: Môi trường

mTNFa: (Murine Tumor Necrosis Factor a) Tác nhân a hoại tử khối u chuột

PCR: The Polymerase Chain Reaction

Pseu: Pseudomonas aeruginosa VM 201

Pro: Proteus mirabiỉis BV 108

s: Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

f O \ Sãh/Salmonella typhi DT 220

Shi: Shigella flexneri DT 112

SI: Sarcina lutea ATCC 9341

Sta: Staphylococcus aureus ATCC 1228

V: Thể tích

VSV: Vi sinh vật

ĐẶT VÂN ĐỂ

Trên thị trường Dược phẩm Việt Nam, gần như 100% thuốc kháng sinh được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hoặc thành phẩm Nhu cầu sử dụng kháng sinh hiện nay rất lớn vì vậy chúng ta không thể để ngỏ thị trường này cho các hãng dược phẩm nước ngoài Muốn thế cần có sự đầu tư nghiên cứu sản xuất kháng sinh mà trước hết là ở quy mô phòng thí nghiệm

Vi sinh học hiện đại phát triển mạnh mẽ vào cuối thế kỷ XIX, đầu thế kỷ

XX Việc phát hiện ra penicillin của Alexander Fleming năm 1928 được coi là khởi đầu cho kỷ nguyên kháng sinh Ngày nay cùng với sự phát triển của các ngành khoa học khác, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh được đẩy mạnh Ngày càng có nhiều kháng sinh được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hay bán tổng hợp nhưng con người vẫn không quên tìm kiếm các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên Trong hơn 8000 kháng sinh được biết hiện nay thì 60% có

nguồn gốc từ xạ khuẩn và 80% số đó là thuộc chi Streptomyces Nước ta có khí

hậu nhiệt đới nóng ẩm tạo nên một hệ vi sinh vật phong phú, trong đó có các xạ

khuẩn chi Streptomyces sinh kháng sinh đã và đang được nghiên cứu.

Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9 được Bộ môn Công Nghiệp Dược

Trường đại học Dược Hà Nội phân lập từ đất bùn ao Vĩnh Bảo Hải Phòng có hoạt tính kháng sinh phổ rộng và tương đối ổn định, có tiềm năng ứng dụng trong thực

tế Bởi vậy chúng tôi đã lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sình

từ xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9” cho khoá luận tốt nghiệp, với các mục tiêu:

- Nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh

- Sơ bộ nghiên cứu chiết tách kháng sinh và một vài tính chất của kháng sinh đã được sinh tổng hợp

- Phân loại Streptomyces 15.2.9.

1.1.2 Các ứng dụng của kháng sinh [5], [9]

Hầu hết các kháng sinh sản xuất là để chống lại vi khuẩn nhưng một số kháng sinh có những ứng dụng khác: chống ung thư, chống nấm, điều trị bệnh trên thực vật, bảo quản thực phẩm, trong hoá sinh và sinh học phân tử Các ứng dụng rộng rãi này làm cho kháng sinh ngày càng có giá trị thương mại lớn nhưng đồng thời cũng thúc đẩy tỉ lệ kháng kháng sinh tăng cao Cần phải kiểm soát việc

sử dụng kháng sinh và cải thiện những kháng sinh sẵn có để tăng hoạt tính kháng sinh, giảm độc tính, giảm tác dụng phụ, mở rộng phổ, tác dụng chọn lọc với các tác nhân gây bệnh và hoàn thiện các đặc tính dược lý Những cải tiến này có thể thu được bằng phương pháp hoá học hoặc sinh học (thay đổi quá trình tổng hợp,

kỹ thuật tái tổ hợp ) Tuy nhiên những kháng sinh có cấu trúc hoàn toàn mới chỉ có thể hi vọng tìm được từ việc sàng lọc, đặc biệt là sử dụng quá trình thử nghiệm mới và nghiên cứu trên những nhóm vi sinh vật mới

1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh [5], [9]

Hình 1 giới thiệu sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp một kháng sinh

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN (ACTINOMYCETES)

1.2.1 Đặc điểm chung [2], [7], [8], [17]

Xạ khuẩn là vi khuẩn thật (Eubacteria), đa số thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) hiếu khí, sống hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi (khuẩn ty) phân nhánh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên Sơ đồ phân loại xạ khuẩn:

Actinomycetales

Actinoplanaceae Actinomycetaceae Streptomycetaceae Micromonosporaceae

Streptomyces Nocardia

Hình 2 : Sơ đồ vị trí phân loại của chi Streptomyces

1.2.2 Phân loại Streptomyces [3], [17]

Có nhiều khoá phân loại Streptomyces khác nhau Tại hội nghị vi sinh thế

giới lần X (tổ chức tại Mexico vào năm 1970), khoá phân loại của Shilling và

Gottlieb được chọn làm khoá phân loại chính để phân loại chi Streptomyces và

đặt tên là ISP ( The International Streptomyces Project) Khoá phân loại ISP dựa trên các đặc điểm:

- Màu khuẩn ty khí sinh, màu khuẩn ty cơ chất,

- Hình dạng chuỗi bào tử,

- Bề mặt, hình dạng, kích thước bào tử,

- Khả năng tạo sắc tố melanoid,

- Khả năng tạo sắc tố hoà tan,

- Khả năng tiêu thụ nguồn cacbonhydrat

1.3 TUYỂN CHỌN VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH [4], [5], [6], [7], [8], [9]

1.3.1 Phân lập giống xạ khuẩn

Để phân lập xạ khuẩn sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ các nguồn

cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, bùn, nước cống Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những xạ khuẩn sinh kháng sinh mà ta mong muốn bằng các phương pháp đặc trưng và trên các MT chọn lọc

Các phương pháp phân lập giống xạ khuẩn: phương pháp cấy dịch chiết lên

bề mặt thạch, phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn v s v kiểm định, phương pháp làm giàu đất, phương pháp thêm kháng sinh vào MT phân lập, phân lập vsv sinh kháng sinh chống ung thư

1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên

Các v s v có sự biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, tạo ra các biến chủng khác nhau, trong đó có biến chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10%- 20% những biến chủng khác Cần phải chọn lấy các biến chủng có hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp

1.3.3 Đột biến cải tạo giống

Các chủng mới phân lập gọi là các chủng nguyên thuỷ hay chủng hoang dại Các chủng này kể cả sau chọn lọc ngẫu nhiên đều không có khả năng siêu

tổng hợp Để khắc phục hạn chế này các phương pháp đột biến đã được áp dụng Những tác nhân đột biến chia 3 nhóm:

- Hoá học: etylenimin, nitrit, hyđroxylamin

-V ật lý: ánh sáng tử ngoại (UV), tia X, tia nơtron hay electron

Trong đó tác nhân vật lý hay được dùng vào mục đích này là ánh sáng tử ngoại (ƯV) Khả năng đột biến phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

- Sinh học: tác nhân sinh học biến đổi gen

1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn

Bảo quản giữ giống v s v là một việc hết sức cần thiết, không phải chỉ với các trung tâm giữ giống quốc gia mà ngay cả đối với từng phòng thí nghiệm công tác này cũng hết sức quan trọng Các giống v s v rất dễ bị thoái hoá, nhầm lẫn, mất nếu không được bảo quản một cách khoa học, đúng kỹ thuật Nhiệm vụ của công tác giữ giống v s v là thực hiện các thao tác kỹ thuật cần thiết để giữ cho giống v s v có tỉ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các v s v lạ

Hiện nay có rất nhiều phương pháp khác nhau để giữ giống v s v Tuỳ theo các trang thiết bị và loại v s v cần giữ mà chúng ta có thể sử dụng phương pháp nào Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm đơn giản nhất có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong tủ lạnh

1.4 DINH DƯỠNG VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT [5], [7], [8], [9]

Trong quá trình sống, tế bào v s v tiến hành trao đổi chất không ngừng với MT xung quanh Tế bào v s v tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ

trao đổi chất của chúng là rất lớn Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được chuyển hoá thành những chất riêng biệt cần thiết cho việc xây dựng tế bào Nhờ quá trình đồng hoá và dị hoá các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng tăng sinh khối, đồng thời sinh ra các sản phẩm trao đổi chất.

Những vsv dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các giống dị dưỡng Để phát triển vsv cần một lượng lớn các nguyên tố c, H, o, N, p, s. .và một lượng nhỏ hơn nhiều các nguyên tố vi lượng như Mn, B, Mo, Zn, Cu, Co

MT dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và tạo thành sản phẩm của vsv Thông thường các MT nuôi cấy này không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất Trong một số quá trình lên men, người ta có thể thêm một

số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất với tư cách là chất đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất acid phenoxyacetic trong lên men sản xuất penicillin V Ở đây cũng cần lưu ý rằng, một MT nuôi cấy thuận lợi cho sự phát triển của một v s v không nhất thiết sẽ là MT đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất cao nhất MT lên men tốt nhất phải là MT đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn và chi phí thấp với chủng v s v cho trước

Thành phần MT và chế độ tối ưu hoá được xác định theo 2 cách: chọn lọc thực nghiệm lâu dài qua nhiều giai đoạn và sử dụng phương pháp toán học mô hình hoá thử nghiệm

1.5 LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH [4], [5], [7], [8], [9], [11], [14], [15]

1.5.1 Bản chất của quá trình lên men

Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động sống của vi sinh vật nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng

Có 2 phương pháp lên men chính:

Phương pháp lên men bề mặt

MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hoặc thể lỏng tuỳ từng loại vsv vsv hấp thu dinh dưỡng của MT và sử dụng 0 2 không khí để hô hấp trên bề mặt

MT dinh dưỡng Vì vậy yêu cầu của phương pháp này là bề mặt MT lên men phải rộng, thoáng, không quá sâu (2-10 cm), trong quá trình lên men cần quạt để tảng độ thoáng khí, giảm nồng độ C 02, ổn định nhiệt độ, duy trì độ ẩm khoảng 90%

Đây là phương pháp cổ điển có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng MT thấp, khó cơ giới hoá Nhưng cũng có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị phức tạp Ngày nay không dùng phương pháp bề mặt để lên men sản xuất mà chỉ sử dụng trong giữ giống và chọn giống

^ Phương pháp lên men chìm

Khi lên men chìm vsv được nuôi cấy ở MT lỏng, phát triển theo cả 3 chiều theo đường cong sinh trưởng (Hình 3 phần phụ lục)

Đầu tiên chúng làm quen với MT, lớn lên về kích thước ở pha tiềm phát Ở pha logarit số lượng v s v tăng nhanh, sản phẩm trao đổi chất được hình thành, chất dinh dưỡng giảm nhanh, khí C 02 tạo ra nhiều, hiện tượng toả nhiệt làm MT nóng lên, bọt khí nổi lên bề mặt Trong trường hợp bọt khí quá nhiều trào ra ngoài thì phải dùng các chất phá bọt để tránh sự nhiễm trùng làm hỏng quá trình lên men Ngoài ra, do các v s v có khả năng làm thay đổi pH MT nên thường phải cho thêm vào MT lên men 2% - 3% CaC03, để ổn định pH hoặc thêm ure hay NH4OH để điều chỉnh pH

Trong quá trình lên men có thể lấy mẫu dịch lên men phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) trong các lần lên men sau

1.5.2 Các phương pháp lên men

- Sử dụng được MT dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của

vsv,

- Hiệu suất sử dụng không gian cao, hiệu suất lên men cao,

- Các thiết bị dễ cơ giới hoá và tự động hoá, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công

Tuy nhiên phương pháp lên men chìm đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật ( các thiết bị chịu áp lực và điều kiện vô trùng tuyệt đối)

Lên men chìm chia làm 4 kiểu chính:

- Lên men gián đoạn (lên men mẻ):

Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín Tại thời điểm ban đầu, ta cấy giống v s v vào MT lỏng trong bình lên men, rồi tiến hành lên men trong điều kiện sinh lý tối ưu Trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung thêm gì, ngoài cấp oxy (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), chất diều chỉnh pH Trong quá trình lên men các thành phần trong dịch lên men biến đổi không ngừng

- Lên men có bổ sung:

Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kỳ phát triển của v s v khi ta cho thêm

MT mới vào dịch lên men một cách ổn định, thay đổi hay định kỳ nhưng không lấy bớt dịch lên men ra

- Lên men liên tục :

Quá trình lên men MT dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời cùng lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men Quá trình này được xem như một hệ mở

ư u điểm của phương pháp lên men chìm so với phương pháp lên men bề

- Lên men bán liên tục:

Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm MT dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian nhất định

1.6 TÁCH VÀ THU NHẬN CÁC SẢN PHẨM c ủ a q u á t r ìn h l ê n m e n [5], [7], [8], [10], [19]

1.6.1 Mở đầu

Một trong những khía cạnh giới hạn của quá trình lên men sản xuất là việc thu nhận và tinh chế sản phẩm Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30 g/1), để tách và tinh chế sản phẩm này đòi hỏi phải có những phương pháp chiết tách thích hợp Số lượng các bước, phương pháp được sử dụng phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu, nồng độ ban đầu và sự ổn định về mặt sinh hóa học của sản phẩm cũng như yêu cầu về độ tinh khiết của sản phẩm

1.6.2 Các phương pháp chiết tách

Lọc: Lọc là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc, bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chui qua do áp suất dư so với áp suất bên dưới vật ngăn

Ly tâm: Là phương pháp tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường là tách pha rắn ra khỏi pha lỏng nhờ lực ly tâm

Lắng: Là quá trình cơ học để phân riêng một hỗn hợp không đồng nhất, có khối lượng riêng khác nhau bằng trọng lực hoặc lực ly tâm

Trích ly bằng dung môi: Nguyên lý của phương pháp chiết “lỏng/lỏng”, được ứng dụng để chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng các dung môi hữu cơ

Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện

Nhược điểm: sử dụng các dung môi hữu cơ thường đắt, dễ cháy, độc nên một số trường hợp được thay bằng các phương pháp kết tủa hoặc hấp phụ.

Một số phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh:

- Sắc ký giấy

Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng phân bố khác nhau của chúng giữa hai dung môi không hoà lẫn vào nhau, luôn tiếp xúc với nhau: một dung môi tĩnh và một dung môi động Dung môi tĩnh được thấm trên giấy (gọi là chất mang trơ về mặt hoá học với các chất cần tách)

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM)

Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi Chọn dung môi và chất hấp phụ tuỳ thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân cực Chất phân cực ta chọn ngược lại

- Sắc ký trao đổi ion

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng

Phương pháp chiết bằng trao đổi ion cũng dựa trên nguyên tắc này

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10 |am) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh.

& Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong chân

không trước khi kết tinh

1.7 KỸ THUẬT PCR VÀ ÚNG DỤNG TRONG MỘT s ố NGHIÊN c ứ u SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH GẦN ĐÂY [13], [16], [18]

1.7.1 Kỹ thuật PCR [13]

Qúa trình PCR có 2 giai đoạn cơ bản:

- Giai đoạn sàng lọc: xảy ra trong suốt những chu kỳ đầu tiên để lựa chọn được đoạn ADN mong muốn bằng cách gắn đoạn mồi đặc hiệu

- Giai đoạn khuy ếch đại: xảy ra trong các chu kỳ tiếp theo, sao chép đoạn ADN đích và nhân lên theo cấp luỹ thừa

Bước 1: ADN đích, d NTPs (4-nucleotide triphosphate), taq ADN polymerase và những đoạn mồi tạo hỗn hợp trong một dung dịch đệm pH=8,4 và t°=94-95°c

trong thời gian 1 phút Sợi đôi ADN sẽ tách thành 2 sợi đơn

Bước 2: Nhiệt độ hạ xuống 55°c trong 1 phút, những đoạn mồi tới gắn vào đầu 5’ của 2 sợi đơn, quá trình sao mã xảy ra từ đầu 5’—>3’, các điểm chính trên 2 sợi đích được sao chép

Bước 3: Nhiệt độ tăng lên 72°c trong 2 phút, cho phép enzym taq ADN polymerase tham gia sao chép sợi mới, bằng cách kéo dài đoạn mồi, sử dụng sợi ADN đích làm mẫu

Bước 4: Qúa trình sao chép tiếp tục lặp lại các bước từ 1—>3 với số lần n = 15-»40, làm tăng số lượng ADN đích theo cấp luỹ thừa s*2n, trong đó s là số lượng ADN đích mẫu

Bước 5: Theo dõi kết quả PCR

1.7.2 Nghiên cứu tiểu phần 20- kDa của enzym 2- Deoxy- scyllo- inosose (DOI) synthase [18]

Nghiên cứu này được tiến hành trong quá trình sinh tổng hợp kháng sinh

butirosin từ Bacillus circulans, DOI synthase có trong Bacillus circulans, là

enzym then chốt để sinh tổng hợp 2- doexystreptamin (DOS)- một trong hai cấu trúc cơ bản của kháng sinh nhóm aminoglycosid DOI synthase cấu tạo bởi 2 tiểu phần, tiểu phần nhỏ 20-kDa và tiểu phần lớn 40-kDa Tiểu phần 20-kDa của DOI synthase được mã hoá bởi gen BtrC2

Dùng kỹ thuật PCR đã xác định được trình tự các bazơ nitơ của gen mã

hóa tiểu phần 20-kDa (BtrC2), cho thấy nó tương tự HisH trong Bacillus subtilis

Các bước trong PCR:

— là một gen mã hóa tiểu phần gắn amido của enzym imidazol glycerol phosphat synthase Phá vỡ BtrC2 bằng cách gắn vào nó đoạn gen kháng tetracyclin Các

thực nghiệm cho thấy Bacillus circulans có BtrC2 đã bị phá vỡ không sản xuất

butirosin ngay cả trên MT sinh tổng hợp butirosin

1.7.3 Nghiên cứu lên men Streptomyces lividans biến đổi gen sản xuất quy

mô lớn tác nhân hoại tử khối u chuột a (mTNFa) [16]

mTNF a là một protein cấu trúc trime, có phân tử lượng xấp xỉ 52 kDa,

được Streptomyces lividans sinh tổng hợp mTNFa gây chết định trình trên dòng

tế bào viêm xơ ở chuột, đầu tiên nó ức chế sự phát triển của các tế bào này rồi gây chết tế bào ngay ở nồng độ thấp 1 ng/ml Nhận thấy protein này có khả năng ứng dụng được trên lâm sàng Charalambos Pozidis và cộng sự đã tiến hành

nghiên cứu lên men sản xuất quy mô lớn mTNFa nhờ Streptomyces lividans đã

biến đổi gen áp dụng kỹ thuật tái tổ hợp ADN và kỹ thuật PCR

Biến đổi gen: Gen pSelm TNFcc mã hoá mTNFa được khuyếch đại nhờ kỹ thuật PCR với đoạn mồi Mam TNF và mTNFSTOP rồi gắn với gen pETmTNFa

(gen mã hoá nhân tố ức chế subtilisin của Streptomyces venezuelae) tạo thành plasmid pCBS2mTNFa+2 Plasmid vector này được biến nạp trong Streptomyces

lividans Ta thu được giống xạ khuẩn đích.

Lên men: Giống Streptomyces lividans đã biến đổi gen nhân giống trên

bình dung tích 2 lít, chứa 1 lít MT Lên men trong bình 50 lít chứa 30 lít MT (hoặc bình 20 lít chứa 15 lít MT) ở 28°c, các điều kiện về nguồn đường và pH đã được khảo sát, cho thấy khả năng tiết mTNFa tốt nhất với nguồn đường dextrose

và lên men gián đoạn có bổ sung 10 g/1 dextrose (nồng độ dextrose trong MT 200- 300 mg/1), pH= 7,0- 9,3 là điều kiện lên men tối ưu

1.8 DÙNG SINH KHỐI v s v ĐỂ THU HỒI ION Zn2+ [12]

Các phương pháp thu hồi kinh điển như thuỷ phân và kết tủa hoá học chỉ

có hiệu quả khi nồng độ ion cao hoặc vừa phải, không có tác dụng khi nồng độ ion thấp Nguyên liệu sinh học được sử dụng để thu hồi các ion kim loại vì chúng

có khả năng gắn kết tốt với các ion kim loại độc hoà tan trong nước bằng cách

hấp phụ Ở đây các nhà nghiên cứu dùng sinh khối của xạ khuẩn Streptomyces

rimonus, là sản phẩm thải loại từ quá trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh

Oxytetracyclin, được xử lý để thu hồi ion Zn2+ Các hạt sinh khối đã sử dụng có

thể tái tạo lại dễ dàng mà không làm thay đổi độ cứng và không làm giảm khả năng gắn Zn2+ của hạt sinh khối

Xử lý sinh khối: Các thí nghiệm đã tiến hành xử lý sinh khối bằng các dung dịch CjHjOH, NaCl, NH4OH, KOH, NaOH và AET (Anionic Enzym Tension active), kết quả cho thấy xử lý bằng AET cho kết quả tốt nhất Khi nồng

độ AET tăng thì khả năng gắn Zn2+ cũng tăng nhưng khối lượng sinh khối lại giảm và đã xác định được tỉ lệ tối ưu là 10 g sinh khối khô trong 1 lít AET lg/1

Chu kỳ hấp phụ - phản hấp phụ: Sinh khối đã xử lý, rửa bằng dung dịch HC1 0,1M với tỉ lệ 5 g sinh khối khô trong llít HC1, rửa lại bằng nước cất, rồi cho vào dung dịch cần thu hồi ion Zn2+ (dung dịch ZnCl2 0,100 g/1) tạo dạng huyền phù, chỉnh về pH =6,4, cho thời gian hấp phụ là 30 phút Sau đó phản hấp phụ thu hồi Zn2+ đồng thời tái tạo lại sinh khối bằng acid HCl ở các nồng độ khác nhau

Ở nồng độ 0,1 M cho hiệu suất thu hồi Zn2+ đạt tới 90%, khối lượng sinh khối sau khi tái tạo giảm khoảng 20% so với trước Nếu sinh khối đã xử lý được nhồi trong cột, các hạt sinh khối tụ tập xít nhau thì khả năng hấp phụ Zn2+ kém hơn so

với khi hấp phụ ở dạng huyền phù.

PHẦN 2

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Giống xạ khuẩn

Giống xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9 đã qua phân lập và tuyển chọn có khả

năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, do phòng thí nghiệm kỹ thuật vi sinh kháng sinh Bộ môn Công Nghiệp Dược, Trường Đại Học Dược Hà Nội cung cấp

2.1.2 Chủng vi khuẩn kiểm định [4]

Vi khuẩn Gram (-):

Escherichia coli ATCC 25922 (Ec)

Proteus mirabilis BV 108 (Pro)

Pseudomonas aeruginosa VM201(Pseu)

Salmonella typhi DT220 (Sal)

Shighella flexneri D 112 (Shi)

(Sta)

Vi khuan Gram (+):

Bacillus cereus ATCC 9946 (Be) Bacillus pumilus ATCC 6633 (Bp) Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs) Sarcina lutea ATCC 9341 (SI)

Staphylococcus aureus ATCC 1228

2.1.3 Môi trường [4], [12]

-$• Các MT nuôi cấy xạ khuẩn:

Các MT nuôi cấy xạ khuẩn được trình bày ở bảng 1

Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

MTThành p h ầ n ^ " " - ^

Chú thích: - Đơn vị tính theo gam,

- Tiệt trùng MT bằng hơi nước ở latt/30 phút

Các MT lên men (MT lỏng): Có thành phần tương ứng MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch

Các MT sử dụng nuôi cấy vi khuẩn kiểm định: Tiệt trùng bằng hơi nước ở latt/30 phút.

Bảng 2: Các môi trường kiểm định

Thành phần

MT

NaCl(%)

CaoThịt(%)

Pepton(%)

Thạch(%) pH

ISP4: Tinh bột 10,0 g, K2HP04 l,0g ,MgS04.7H20 l,0g, NaCl 1,0 g

(NH4)2S04 2,0 g, CaC03 2,0 g dung dịch muối vi lượng 1,0 ml, Thạch 20,0

g, nước cất 1000 ml, pH= 7,0-7,4

ISP5: L- asparagine 1,0 g, glycerin 10,0 g, K2HP04 1,0 g, dung dịch muối

vi lượng 1,0 ml, thạch 20 g, nước cất 1000 ml, pH= 7,0-7,4

ISP7: Glycerin 15,0 g; L- tyrosine 0,5 g, L-asparagin 1,0 g, K2HP04 0,5 g

, MgS04.7 H20 0,5 g, NaCl 0,5 g, FeS04.7H20 0,01 g, dung dịch muối vi lượng 1,0 ml, thạch 20,0 g, nước cất 1000 ml, pH= 7,2-7,4

ISP9:

+ Các nguồn đường đã tiệt trùng bằng phương pháp Tyndal (A)

1 D- glucose 4 D- mannitol 7 Raffinose

2 Inositol 5 D- fructose 8 Rhamnose

3 D-xylose 6 L- arabinose 9 Saccarose

+ Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B) CuS04.5H20 0,69 g,

FeS04.7H20 0,11 g, MnCl2 4H20 0,79 g, ZnSƠ4 7H2Ơ 0,15 g, nước cất

- Nguyên liệu dùng trong sắc ký:

+ Các dung môi hữu cơ, amonihydroxyt 25%,

+ Bản mỏng sắc ký Silicagel 60 p254( Merck), giấy sắc ký Whatman,

+ Thuốc thử hiện màu: dung dịch 2% H2S0498% trong cồn 90°, dung dịch Ninhydrin 1% trong cồn, I2 thăng hoa

- Tác nhân đột biến:

Ánh sáng u v (X= 254 nm) nguồn phát Toshiba 60 w.

- Máy móc thiết bị thí nghiệm:

+ Hộp Petri đường kính 9 cm,

+ Máy lắc Taitec Bio-ShaKer BR-300LF Nhật,

+ Tủ cấy vô trùng: Sanyo clean bench,

+ Máy ly tâm Rotofix 32 Hettich,

+ Máy đo Toledo MP220 pH METTLER,

+ Cân phân tích Sartorius BP 21 OS,

+ Cân kỹ thuật Sartorius GM 152,

+ Nồi hấp vô trùng: HiRayama Model HL3030e,