Dịch lọc đã được chiết bằng một số dung môi hữu cơ (cloroíorm, dicloromethan, aceton, ethylacetat, butylacetat, methanol, n- butanol, n- propanol) ở các pH 3, 5, 7, 9, 11. Sau khi chiết pha nước và pha dung môi hữu cơ được chỉnh lại pH về 7, rồi thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả cho thấy chiết với tất cả các dung môi hữu cơ và ở mọi pH pha dung môi hữu cơ đều không có hoạt tính kháng sinh hoặc hoạt tính kháng sinh không đáng kể. Như vậy kháng sinh do Streptomyces 15.2.9 sinh tổng hợp tan rất kém trong các dung môi hữu cơ đã khảo sát, ta không tìm được dung môi để chiết kháng sinh từ dịch lọc.
Chiết bằng trao đổi ion.
Dịch lọc cho chạy qua cột trao đổi ion với nhựa cationid Amberlite IRC 50, phản hấp phụ bằng dung dịch HC1 0,75 M, tốc độ chảy chung của các dịch qua cột là 4,5 ml/phút. Thu lấy dịch ở các phân đoạn khác nhau, chỉnh về pH 7, đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch với vi khuẩn kiểm định là Ec, kết quả ở bảng 11.
Bảng 11: Kết quả chiết dịch lọc bằng phương pháp trao đổi ion với nhựa cationỉd Amberlỉte IRC 50.
Phân đoạn V (ml) pH D(mm) s Dich loc 200 7,5 17,24 0,14 Dich đã hấp phu 200 7,5 0 0 Dich phản hấp phu 1 10 7,0 12,96 0,08 2 15 7,0 21,91 0,23 3 20 6,0 24,28 0,42 4 20 6,0 22,99 0,24 5 10 3,0 9,28 0,27 6 5 2,0 0 0
Nhận xét: Dịch đã hấp phụ không còn hoạt tính kháng sinh. Phương pháp chiết tách kháng sinh trong dịch lọc bằng sắc ký trao đổi ion là hiệu quả. Phân đoạn 2, 3, 4 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, thu lấy dịch ờ các phân đoạn này chỉnh về pH 3, bảo quản trong tủ lạnh để nghiên cứu tiếp. Các phân đoạn có hoạt tính kháng sinh còn lại xử lý lại qua cột trao đổi ion cùng với các mẻ sau.
Sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy
Dịch lọc sau khi chiết tách kháng sinh bằng trao đổi ion ta thu được một dung dịch khá sạch. Tiến hành sắc ký trên giấy Whatman và sắc ký lớp mỏng Silicagel F254, thử triển khai với nhiều hệ dung môi, thu được 2 hệ độc lập cho kết quả triển khai tốt. Các kết quả sắc ký được giới thiệu ở bảng 12.
Bảng 12: Kết quả sắc Ấrý.(Hình 8 phần phụ lục) Hệ dung môi Phương pháp
Rf
vsv Hiệnmẩu
Hệ 1
Qoroform : methanol: amonihydroxyd 25% ( 2 : 2 : 1 ) Sắc ký lớp mỏng 0,78 0,78 Sắc ký giấy 0,72 0,72 Hệ 2
N- butanol: pyridine : nước : acid acetic (6 :4 :3 : 1) Sắc ký lớp mỏng 0,36 0,36 Sắc ký giấy 0,32 0,32 Nhận xét:
- Với cả 2 hệ dung môi đều cho kết quả triển khai trên cả sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy,
- Kết quả hiện vết kháng sinh bằng vsv và hiện màu bằng thuốc thử Ninhydrin 1% trong cồn là tương đương,