- Nguyên tắc: Mẫu thử được đưa vào MT trong hộp Petri đã cấy vi khuẩn kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn kiểm định tạo thành các vòng vô khuẩn.
- Tiến hành:
+ Lấy một vòng que cấy vi khuẩn kiểm định cấy vào MT canh thang (ủ ở
37°c trong 18-24 h đối với vi khuẩn) để tạo thành nhũ dịch vi khuẩn có nồng độ 10"6-10‘7 tế bào/ ml.
+ Cấy hỗn dịch vsv vào MT thạch thường đã tiệt trùng với tỉ lệ 2,5:100 (105tế bào/ml) trên nhiệt độ 45- 50°c, lắc đều đổ vào các đĩa Petri với thể tích 20 ml/lđĩa).
+ Đưa mẫu thử vào MT kiểm định:
Có 3 cách:
Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc vô trùng (đường kính 6 mm) đã tẩm mẫu thử được đặt theo sơ đồ định sẵn, trên MT kiểm định.
Áp dụng: Thử hoạt tính của các dịch chiết kháng sinh dễ bay hơi.
Phương pháp giếng thạch : Đục các giếng thạch đường kính 6 mm trên MT kiểm định, nhỏ 0,05 ml mẫu thử vào mỗi giếng thạch.
Áp dụng: Thử hoạt tính kháng sinh trong dung dịch nước.
Phương pháp khối thạch: Mẫu khử là khối thạch đường kính 6 mm có chứa xạ khuẩn sinh kháng sinh được đặt lên bề mặt MT kiểm định.
- Nuôi cấy: Các đĩa petri trên được nuôi cấy ở 37°c trong 18-24 h. Mỗi mẫu được thử trên 3 đĩa đối với một loại vi khuẩn. Sau khi nuôi cấy đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Pamer có độ chính xác 0,02 mm. Kết quả được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:
Với: D ị: các đường kính vòng vô khuẩn thứ i đo được.
D :đường kính vòng vô khuẩn trung bình,
n: số thí nghiệm song song,
s: độ lệch chuẩn có hiệu chỉnh.
2.2.3. Phương pháp cải tạo giống vi sinh yật [4], [5], [7], [8]
- Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
+ Pha hỗn dịch bão tử: Lấy 1 vòng que cấy bào tử Streptomyces 15.2.9 cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10'1 (định ước), lấy 1 ml hỗn hợp bào tử này cho vào 9 ml nước vô trùng thu được nồng độ 10'2, tiếp tục pha loãng thành nồng độ
10'6.
Dùng Pipet vô trùng hút 0,1 ml các mẫu hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10'4đến 10'6, nhỏ lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử.
Tiến hành làm 3 đĩa Petri cho mỗi độ pha loãng, ủ các đĩa ở 30°c trong 6
ngày rồi lấy ra đem cấy vạch để thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch, 3 giống tốt nhất được nhân giống và giữ lại để chuẩn bị cho đột biến.
- Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV:
+ Pha hỗn dịch bào tử tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 1 ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10'6 làm mẫu chứng, 9 ml còn lại được đưa vào điã Petri vô trùng.
+ Chiếu ánh sáng u v với khoảng cách và thời gian thích hợp vào đĩa Petri để độ sống sót khoảng 0,1% - 1%, để chỗ tối 2-3 h, sau đó dùng Pipet 1 ml vô trùng pha loãng đến nồng độ 10'5.
+ Cấy bào tử sau đột biến:
Tương tự như cấy bào tử ở chọn lọc ngẫu nhiên với mẫu thử là các bào tử sau đột biến ở độ pha loãng 10'4, 10'5, mẫu chứng ở nồng độ 10'6.
Đếm khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:
% độ sống sót = * 100
No
V ớ i:
N m: số khuẩn lạc sau đột biến,
N o: số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên.
Làm song song mẫu chứng.
% biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:
% biến đổi hoạt tính = = * 100
Do
Với:
Di: đường kính vòng vô khuẩn trung bình của biến chủng thứ i,
Do: đường kính vòng vô khuẩn trung bình của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.4. Phương pháp xác định các môi trường nuôi cấy thích hợp [4], [9]
Streptomyces 15.2.9 được cấy vô trùng trong tủ cấy vô trùng trên 7 MT đặc MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7 trong hộp Petri, ủ ở 30°c trong 6 ngày. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Mỗi MT làm 3 mẫu song song.
2.2.5. Phương pháp lên men gián đoạn [4], [7], [8], [14], [15]
Sau khi có kết quả xác định được các MT nuôi cấy bề mặt tối ưu cho việc sản xuất kháng sinh, ta dùng giống cấp 1 để lên men gián đoạn trong các MT lỏng tương ứng.
- Tạo giống cấp 1:
Streptomyces 15.2.9 trên thạch nghiêng (MT2) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500 ml chứa 100 ml MT2 lỏng bằng 10 ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở 30°c, tốc độ quay 180 vòng/phút trong 48 h.
Lên men tiến hành trên các MT lỏng tương ứng với các MT bề mặt tạo kháng sinh tối ưu nhất.
Giống cấp 1 được cấy vào bình nón 500 ml chứa 100 ml MT lên men với tỷ lệ Vgiống: Vmôi trường = 1:10
Các bình lên men được lắc ở 30°Cvới tốc độ 180 vòng/phút trên máy lắc tròn trong 120 h.
2.2.6. Phương pháp xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men [4]
Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh
Mục đích: Xác định mức độ ảnh hưởng của các pH khác nhau lên độ bền vững của kháng sinh, từ đó biết được pH có thể tiến hành chiết tách và bảo quản kháng sinh.
Tiến hành: Dịch lọc được cho vào 5 ống nghiệm, mỗi ống 10 ml, điều chỉnh pH trong các ống lần lượt 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản các ống trong tủ lạnh. Sau 5 ngày thử hoạt tính kháng khuẩn của các ống (sau khi điều chỉnh pH về trung tính) bằng phương pháp giếng thạch.
Thử thời gian bảo quản kháng sinh.
Mục đích: Xác định độ bền vững của kháng sinh sau thời gian bảo quản.
Tiến hành: Dịch lọc và dịch chiết kháng sinh được bảo quản ở pH thích hợp trong tủ lạnh (2°C) sau một thời gian đựơc lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch.
2.2.7. Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ [4], [9]
Tiến hành: Ở đây ta dùng phương pháp chiết một lần.
- Dịch lọc được điều chỉnh về các pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 20% và HC1 3 M,
- Chiết dịch lọc đã chỉnh pH với các dung môi hữu cơ khác nhau
+ Dịch lọc và dung môi được cho vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc= 1: 5,
+ Lắc 15 phút, sau đó để phân lớp trong 1 giờ,
+ Tách riêng lớp dung môi và lớp dịch lọc.
- Kiểm tra hoạt tính kháng sinh của lớp dung môi và lớp dịch lọc sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
2.2.8. Tách kháng sinh bằng phương pháp trao đổi ion [5], [10]
- Loại các ion Ca2+, Mg2+ trong dịch lọc: Cho acid oxalic 5% (kl/tt) dư vào dịch lọc. Khuấy 30 phút. Lọc loại tủa. Trung tính bằng bằng NaOH 20% đến pH 7,0 - 7,5.
- Chuẩn bị cột trao đổi ion: Lấy khoảng 15 g nhựa cationid Ambrelite IRC 50, cho vào cột trao đổi ion (dùng buret có lót ở dưới một ít bông thủy tinh) cùng với nước vô ion. Chú ý không để bọt khí lẫn vào, phải luôn luôn cho dung dịch ngập trên cationid ít nhất 0,5 cm trong quá trình chạy cũng như không chạy. Cho dung dịch HC1 1 N chảy qua với thể tích gấp đôi thể tích nhựa. Rửa bằng nước vô ion đến pH 6,5- 7,0. Cho dung dịch NaOH 1 N chảy qua với thể tích bằng 2 lần thể tích nhựa. Rửa bằng nước vô ion đến pH 7,5 - 8,0.
- Hấp phụ- phản hấp phụ: Cho dịch lọc đã chuẩn bị ở trên chảy qua cột. Rửa cột với 15 ml nước vô ion. Phản hấp phụ bằng dung dịch HC1 0,75 N chia dịch phản hấp phụ thành 6 phân đoạn khác nhau.
2.2.9. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào [4], [7], [8]
Sau khi kết thúc quá trình lên men thu được dịch lên men, đem lọc thu được dịch lọc và sinh khối.
- Xác định kháng sinh ngoại bào: Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, nếu có hoạt tính đó là kháng sinh ngoại bào. Tiến hành chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng các phương pháp chiết tách.
- Xác định kháng sinh nội bào: Sinh khối được rửa 3 lần bằng nước cất, sấy khô ở 45- 50°c trong 24 h. Nghiền vỡ sinh khối trong cối sứ với dung môi thích hợp (đã xác định được trong phần chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ, nếu không chọn được dung môi hữu cơ chiết thích hợp ta dùng nước cất). Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc nếu nghiền sinh khối với dung môi hữu cơ hoặc bằng phương pháp giếng thạch nếu nghiền sinh khối với nước.
2.2.10. Tách kháng sinh bằng phương pháp sắc ký [4], [10]
Mục đích: Xác định thành phần các kháng sinh có trong dịch lọc.
Dùng sắc ký lớp mỏng:
- Bản mỏng có kích thước thích hợp, được hoạt hoá ở 110°c trong 30 phút.
- Dung môi được pha theo đúng tỉ lệ và cho vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1 cm).
- Dùng Micropipet đường kính 0,5 mm chấm dung dịch sắc ký lên bản mỏng 10-20 lần, để khô tự nhiên sau mỗi lần chấm hay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ
- Đặt bản mỏng vào bình sắc ký theo quy định cho dung môi chạy 3/4 bản mỏng, lấy ra đánh dấu vết dung môi chạy, sấy khô bản mỏng xác định vết bằng các phương pháp tiếp theo.
+ Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn đã được trộn với 1 chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi đèn tử ngoại vết chất thử sẽ sẫm màu.
+ Phương pháp hiện hình VSV: Đặt bản mỏng sắc ký vào đĩa petri vô trùng, đổ MT thạch thường đã cấy vi khuẩn kiểm định phủ lên bề mặt của bản mỏng, ủ 18-24 h ở 37°c. Vòng vô khuẩn xuất hiện nếu có kháng sinh.
+ Phương pháp hiện màu hoá học: Bản mỏng được phun thuốc thử hiện màu, sấy ở 100°c trong 10 phút để phát hiện vết.
a + Tính hệ số tốc độ Rf: Rf = “k
a: Quãng đường vết hoạt chất di chuyển được.
b: Quãng đường dung môi di chuyển được.
Dùng sắc ký giấy tương tự như sắc ký lớp mỏng, thay bản mỏng bằng giấy sắc ký.
2.2.11. Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP [17]
Chuẩn bị giống gốc Streptomyces 15.2.9 được phân lập, nguyên gốc. Xác định đặc điểm hình thái và sắc tố hoà tan:
- MT xác định: ISP1, ISP2, ISP3, ISP4 đã được hấp tiệt trùng đổ vào hộp Petri, mỗi MT làm 4 đĩa, cấy vạch bào tử của Streptomyces 15.2.9 lên bề mặt thạch, ủ ở 30°c, tiến hành quan sát sau khi nuôi cấy 7, 14, 21 ngày.
+ Màu của bề mặt khuẩn lạc: Quan sát trực tiếp bề mặt khuẩn lạc.
+ Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát mặt sau của khuẩn lạc.
+ Chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại cao.
- Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), uốn cong (RF), móc câu (RA), lò xo (S). Nếu chuỗi bào tử có nhiều đặc điểm thì ghi đầy đủ (ví dụ SRA).
- Bề mặt bào tử có dạng sau:
Phẳng nhẵn (Sm), gai (Sp), mụn cơm (Wa), tóc (Ha).
- Sắc tố hoà tan: nằm trong MT có màu đỏ, vàng, xanh lá cây, xanh da trời, nâu, tím.
Xác định sắc tố melanoid: Nuôi cấy xạ khuẩn trên M TISP6, ISP7. Phát hiện sắc tố melanoid ở ngày thứ 2, ngày thứ 4. Nếu có ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0).
-$■ Khả năng tiêu thụ nguồn cacbonhydrat: Nuôi cấy chủng xạ khuẩn sau chọn lọc ngẫu nhiên trên MT ISP9 và các MT D*ISP9. Đánh giá ở ngày thứ 10, 16, dùng mẫu xạ khuẩn phát triển trên MT D*ISP9 chứa đường glucose làm chứng dương và mẫu xạ khuẩn phát triển trên MT ISP9 làm chứng âm. Nếu mẫu phát triển mạnh hơn đáng kể chứng dương thì đánh dấu (++), nếu mẫu phát triển tương đương chứng dương thì đánh dấu (+), nếu mẫu phát triển yếu hơn đáng kể so vói chứng dương nhưng phát triển mạnh hơn chứng âm thì đánh dấu (±), nếu mẫu phát triển yếu hơn hoặc bằng chứng âm thì đánh dấu (-).
2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.3.1. Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 15.2.9 sinh tổng hợp
Phổ tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 15.2.9 gốc sinh tổng hợp được giới thiệu ở bảng 3.
Bảng 3: Kết quả thử tác dụng của kháng sinh do Streptomyces 15.2.9 gốc sinh tổng hợp với các vỉ khuẩn kiểm định
Vi khuẩn Gram(+) D(mm) Vi khuẩn Gram(-) D(mm) Bc 14,00 Ec 12,34 Bp 13,62 Pro 19,90 Bs 11,58 Pseu 13,62 SI 14,14 Shi 19,92 Sta 10,42 Ơ VpĩP 14,58
Nhận xét: Kháng sinh do xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9 tạo ra có phổ tác dụng rộng trên cả vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-) nhưng tác dụng trên vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn hẳn. Chọn 2 loại vi khuẩn kiểm định đại diện có độ nhạy cảm thích hợp với kháng sinh sinh tổng hợp là Bs và Ec.
2.3.2. Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp
Sau thời gian nuôi cấy 6 ngày ở 30°c, Streptomyces 15.2.9 không phát triển trên các MT3, MT4, MT5, MT7 và phát triển tốt trên các MT1, MT2, MT6, tiến hành thử hoạt tính kháng sinh được sinh tổng hợp ra trên các MT này bằng phương pháp khối thạch, kết quả giới thiệu ở bảng 4.
B ảng 4: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy
MT Bs Ec D(mm) s D(mm) s 1 9,87 0,70 9,53 0,93 2 14,06 0,92 13,93 0,68 6 13,04 1,00 11,68 0,42
Nhận xét: Streptomyces 15.2.9 không phát triển trên các MT3, MT4, MT5, MT7, phát triển tốt trên các MT1, MT2, MT6 và khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh khi nuôi cấy trên MT2 (MT phân lập) là tốt nhất. MT2 được chọn làm MT cấy giống. Khi chọn MT lên men sẽ thử trong các MT1, MT2, MT6 lỏng.
2.3.3. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên giống xạ khuẩn
Giống xạ khuẩn Streptomyces 15.2.9 được sàng lọc ngẫu nhiên để chọn biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất. Thử bằng phương pháp khối thạch, kết quả được giới thiệu ở bảng 5.
Bảng 5: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 15.2.9
Biến chủng Bs Ec Biến chủng Bs Ec D(mm) s D(mm) s D(mra) s D(mm) s 1 12,25 0,31 11,91 1,14 m ;; 1433 1 (I) 0,35 14,20 ; á ) ' ọ>18 2 12,18 0,29 13,03 0,76 19 12,07 0,94 11,83 0,43 3 %3M ....m .... I 0,47 13,20 ; ■ ¡ ¡ ■ l i ; 0*56 20 12,10 0,87 10,62 1,02 4 13,38 (4) 0,52 12,25 0,55 21 11,59 1,50 11,85 0,89 5 12,33 1,4 11,25 0,51 22 12,93 0,29 12,55 0,94 6 12,77 0,1 12,35 1,67 23 12,19 0,53 12,06 0,76 7 9,85 0,34 10,17 0,78 24 12,17 0,92 13,81 (3) 0,37 8 10,98 0,73 11,85 1,23 25 Ị; 1339 1...m ... 0,59 14,45 (1) ! : 0,06 9 11,95 0,80 10,91 0,97 26 11,52 0,45 10,31 0,46 10 11,74 0,64 11,27 0,50 27 12,42 0,47 11,39 1,17 11 13,07 0,59 12,13 0,42 28 12,37 0,35 11,17 0,10 12 11,79 0,88 11,32 0,79 29 13,44 (2) 0,46 11,20 0,52 13 12,00 0,09 12,30 0,86 30 11,30 0,10 12,14 0,42 14 10,57 0,68 11,99 0,74 31 10,40 0,68 9,73 0,38 15 13,02 (6) 0,20 11,59 1,05 32 10,88 0,28 9,97 1,06 16 10,68 0,48 9,71 0,26 33 10,50 0,57 10,71 1,12 17 12,44 1,22 12,91 0,23
Nhận xét: Từ kết quả trên ta chọn 3 biến chủng 18, 25, 3 đem nhân giống sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống
Tiến hành đột biến các bào tử của biến chủng Streptomyces 15.2.9- 25 (thu được sau chọn lọc ngẫu nhiên) bằng ánh sáng ƯV với các tham số: À,=254 nm, khoảng cách chiếu 60 cm, trong thời gian 5 phút. Tỉ lệ sống xót sau đột biến là 0,18%. Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh bằng phương pháp khối thạch của các biến chủng sau đột biến được giới thiệu ở bảng 6.