Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29

Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29 Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 35 29

p BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI CHỬ VÃN MẾN NGHIÊN CỨU SINH TổNG HỢP k h á n g SINH TỪ STREPTOMYCES 35.29 (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dẫn Noi thực hiện Thời gian thực hiện PGS.TS. CAO VĂN THU B ộ MÔN VI SINH - SINH HỌC 2-5/2006 HÀ NỘI, 5/2006 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Giảng viên, Phó giáo sư, TS. Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy cô ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô, cán bộ kỹ thuật viên trong bộ môn Vi sinh-Sinh học, bộ môn Công nghiệp dược, bộ môn Hoá dược, Phòng thí nghiệm trung tâm, cùng các phòng ban đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tối trong quá trình thực nghiệm. Xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã giúp đỡ và dộng viên tôi trong thời gian qua. Do trình độ bản thân và Ihời gian có hạn nên đề tài khó tránh khỏi những khiếm khuyết. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự đóng góp ý kiến của bạn bè. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày ỉ 9 tháng 5 nãm 2006. Sính viên Chủ Văn Mến MỤC LỤC Đặt vấn để 1 Phầnl: Tổng quan 2 1.1. Kháng sinh 2 1.1.1. Lịch sử 2 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.3. Phân loại kháng sinh 2 1.1.4. Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh 3 1.2. Đại cưcmg về Strepiomyces 3 1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptoiĩiyces 4 1.2.3. Phân loại Streptomyces 5 1.2.4. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 6 1.3. Cải tạo giống vi sinh vật 6 1.3.1. Mục đích 6 1.3.2. Các phương pháp cải tạo giống 7 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.4.1, Lên men bề mặt 8 1.4.2. Lên men chìm 8 1.5. Chiết tách - Tinh chế 10 1.5.1, Chiết xuất u 1.5.2. Tách sản phẩm 11 1.6. Một số thành tựu trong nghiên cứu kháng sinh 12 1.6.1. Komodoquinon A, một anthracyclin móíi từ Streptomyces sp.KS^ 12 1.6.2. Các Pyrrolomycin mới tù môi trường nuôi cấy Streptomyces íumanus 12 1.6.3. Các Anthrabenzoxocinon-Chất gắn thụ thể X ở gan-Chất kháng khuẩn 13 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 15 2.1. Nguyên liệu và phưcmg pháp thực nghiệm 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Phưcmg pháp nghiên cứu 18 2.2. Kếi quả thực nghiệm và nhận xét 26 2.2.1. Kết quả phân loại theo ISP 26 2.2.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35.29 trên môi trường phân lập(MT2) 27 2.2.3. Kết quả lựa chọn mồi trường nuôi cấy thích liợp 27 2.2.4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 29 2.2.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 1 30 2.2.6. Kết quả đột biến bằng ánh sáng u v lần 2 31 2.2.7. Kết quả khảo sát độ bền nhiệt của kháng sinh 33 2.2.8. Đánh giá ảnh hưởng của pH dến dộ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men 34 2.2.9. Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi khác nhau 34 2.2.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng 35 2.2.1 ỉ. Kết quả sắc ký cột 36 2.2.12, Kết quả đo phổ hồng ngoại 37 Phẩn 3: Kết luận và đề xuất 38 3.1. Kết luận 38 3.2. Đề xuất 39 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ADN AIDS ATCC B B. cereus B. pumilus B. subtilis CWI D dmhc E. coli Gn Gy Ha HIV HPLC IR ISP L. DAP MT MTdd N nm P. aeruginosa P. mirabilis RA R RF S s S. aureus S. flexneri S. lutea Acid deoxyribonucleic Acquired Immunodeficiency Syndrome American Type Culture Collection Blue (Xanh da trời) Bacillus cereus ATCC 9964 Bacillus pumilus ATCC 1024] Bacillus subtilis Cell wall I Đưòng kính vòng vô khuẩn trung bình Dung mối hữu cơ Escherichia coli ATCC 25922 Green (Xanh lá cây) Grey (Xám ) Hair (Tóc) Human Immunodeficiency Virus High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Infrared (Hồng ngoại) International Streptomyces Project L. Diaminopimelic Mồi trường Môi trường dung dịch Pha nước nanomet Pseudomonas aeruginosa Vm 201 Proteus mirabilis BV 108 Retinaculiaperti (Móc câu, xoắn đofn) Red (Đỏ) Rectiflexibiles (Thẳng, uốn cong) Spỉrales ( Xoắn) Sai số chuẩn có hiệu chỉnh Staphylococcus aureus ATCC 1228 Shigella flexneri DT 112 Sarcina lutea Sm Smooth( Nhãn) sp Spiny( Gai) STT SỐ thứ tự S. typhi Salmonella typhi DT 220 V Violet (Tim) V Volumn(Thể tích) v sv Vi sinh vật Wa Warty (Sần sùi) w White (Trắng) Y Yellow (Vàng) ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều chất kháng sinh được tạo thành bằng con đường tổng hợp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn luôn được thế giới quan tâm. Hàng năm, vẫn có nhiều kháng sinh mới được phát hiện. Trong tổng số hơn 10.000 chất kháng sinh đã được phát hiện và còng bố, có tới 66% là do xạ khuẩn sinh ra. Các còng trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là chi xạ khuẩn lớn, gổm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và đặc điểm kháng khuẩn, một số loài trong chi này còn có khả năng sinh tổng hợp các chất chữa ung thư, điều trị HIV/AIDS. Bộ môn Vi sinh-Sinh học trong thời gian qua đã tiến hành phân lập và nghiên cứu một số chủng Streptomyces có trong đất, bùn ở Việt Nam. Những nghiên cứu ban đầu cho thấy Streptomyces 35.29 là chủng xạ khuẩn có đặc tính di truyền ổn định, khả nãng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, có nhiều tiềm năng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Do đó chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomỵces 35.29" với các mục tiêu: - Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35.29 bằng đột biến cải tạo giống kếl hợp với sàng lọc ngẫu nhiên. - Bước đầu lựa chọn mói trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy. - Nghiên cứu sơ bộ về tách chiết và tinh chế. - Nghiên cứu các đạc điểm hình thái và sinh lý nhằm phân loại, xác định tên khoa học của chủng Streptomyces 35.29 theo khoá phân loại ISP. PHẤN 1 TỔNG QUAN l.L Kháng sinh(2), (3), (6), (7), (9). 1.1.1. Lịch sử. Tác dụng kháng sinh đầu tiên của penicilin do Alexander Fleming: nhà khoa học người Anh phát hiộn T'd năm 1928. Năm 1941, penicilin được lên men trên quy mô công nghiệp để phục vụ điều trị thương binh. Năm 1944, Streptomycin được phát minh, tiếp đó, nhiều kháng sinh khác lần lượt được phát minh và nhanh chóng đưa vào sử dụng điều tộ trong y học. Kháng sinh không chỉ được sử dụng trong y học, nó còn được sử dụng trong nông nghiệp, trong chăn nuôi và trong công nghiệp thực phẩm. Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn tới hiện tượng kháng thuốc. Những kháng sinh được coi là “thần dược” của những nãm 70 của thế kỷ XX đã không còn hiệu quả điều trị như trước nữa. Chính vì vậy, đi kèm với việc sử dụng hợp lý kháng sinh thi việc tìm ra kháng sinh mới để bổ xung phổ tác dụng là việc cần thiết. 1.1.2. Định nghĩa(2). Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguổn tự nhiên khác, có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc nên một nhóm vi sinh vật xác định ( vi khuẩn, vi nấm, nguyên sinh động vật ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp, 1.1.3. Phân loại kháng sinh(2), (3), (10). Kháng sinh được phân loại theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hoá học. Trong đó, phân loại theo cấu trúc hoá học được xem là phân loại khoa học nhất. Theo cấu trúc hoá học, kháng sinh được phân loại thành các nhóm: * Nhóm ß-lactam: penicilin, cephalosporin * Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin Nhóm amphenicol: choramphenicol, thiamphenicol * Nhóm tetracyclin: tetracyclin, Oxytetracyclin * Nhóm macrolid: erythromycin, spiramycin * Nhóm rifamicin: rifampicin * Nhóm quinolon: ciprofloxacin, oflofloxacin.,. Trong đó nhóm p-lactam là nhóm kháng sinh quan trọng nhất. 1.1.4. Sơ đồ lên men sản xuất kháng sinh. Giống truyền ủ trong PTN 1 r Nhân giống cấp 1,11, III Lên men tạo kháng sinh Dịch lé:n men Sinh khối Bã Giải phóng vật chất Lọc lọc Dịch lọc Chiết bằng dung mỏi Chiết bằng trao đổi ion Chiết bằng kết tủa Dịch chiết Chiết bằng dung mòi Chiết bằng trao đổi ion Qiiết bằng kết tủa Dịch chiết Tinh chế Sản phẩm kết tinh Kiểm nghiệm,đóng gói Sản phẩm Hình 1: Giới thiệu sư đổ tổng quát sản xuất kháng sinh (PTN: Phòng thí nghiệm) 1.2. Đại cưưng về Streptomyces(S), (10), (11). 1.2.1. Một số đặc điểm chung của Streptomyces. Streptomyces là một chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi ■ ' . ^ trong tự nhiên như: đất, bùn ao, nước và các chất thải hữu cơ. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram(+), hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phán nhánh (khuẩn ty). Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn, số lượng xạ khuẩn trong một gam đất ở các mẫu đất khác nhau là khác nhau, phụ thuộc vào độ ẩm, nhiệt độ, pH, dinh dưỡng Một số đặc điểm của xạ khuẩn: - Đường kính khuẩn ty xấp xỉ khoảng từ 0,2-1,0 đến 2-3 |am. - Mầu sắc khuẩn ty rất phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu đen - Thành tế bào xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10,0 nm, không có cellulose, kitin. - Phân chia tế bào theo kiểu phân bào vô tính. - Nhuộm màu Gram (+). Phân loại: ĩởp xạ khuẩn Actinomycetes bao gồm bộ Actinomycetales và các vi sinh vật giống thế. Bộ Actinomycetales gồm các họ Actinoplanaceae, Actinomycetaceae, Streptomycetaceae, Nocardiaceae, Micromonosporaceae 1.2.2. Đặc diêm hình thái và sinh lý của xạ khuẩn chi Streptomyces. - Khuán lac: + Bề mặt: thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ, vì vậy mới có tên xạ khuẩn. + Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách ra khỏi môi trường nuôi cấy. - Khuẩn ty cơ chất: + Mọc sâu trong môi trưcmg nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển. + Bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. + Khuẩn ty cơ chất tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố hoà tan trong nước, có sắc tố chỉ hoà tan trong dung môi hữu cơ. - Khuẩn ty khí sinh: + Khuẩn ty cơ chất phát triển một thòi gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh. + Có đường kính từ 1-1,4 micromet. - Chuỗi bào tử: + Được hình thành từ khuẩn tỵ khí sinh, có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong hoặc xoắn lò xo. - Bào tử: ^ + Cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn là bào tử trần. f [...]... 0 D 0 Ü 0 0 0 0 0 s 0 0 0 0 0 0 0 s typhi Nhân xét: - Streptomyces 35. 29 sinh tổng hợp kháng sinh trên tất cả 7 loại môi trường nuòi cấy - Trên mỏi trường 3,4,6,7 cho hoạt tính kháng sinh yếu 28 - Streptomyces 35. 29 phát triển tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh trên MTl, MT2, MT5 Trong đó MT2 là môi trường Streptomyces 35. 29 sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất - Qua bảng trên chọn hai chủng Bacilhis... Streptomyces 35. 29 có tên là Streptomyces krainskii 2.2-2 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35. 29 trên mói trường phân lập (MT2) Hoạt tính của kháng sinh do chủng Streptomyces 35. 29 sinh tổng hc^ trên MT2 được thử trên một số v s v kiểm định Kết quả được trình bày ở bảng 3 Bảng 3 Hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 35. 29 trên một sù v s v kiểm định v sv B B B S kiểm cereus pumilus... điểm sinh lý: - Khả năng tạo sắc tố hoà tan - Khả năng tạo sắc tố melanoid - Khả nàng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn 1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyce(3),(7), (9), (10) Một số lượng lớn các kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng hợp được nghiên cứu và sử dụng thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau: aminoglycosid, macrolid, tetracyclin, phenicol Nhóm kháng sinh Kháng. .. 5 Đảng 5 Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả nãng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 35. 29 khi lên men chìm Hoạt lực kháng sinh Môi trường Proteus mirabilis Bacillus pumilus D(mm) s D (mm) s MTlđd 14,09 0,08 14,47 0,06 MT2dd 15,23 0,12 15,27 0,12 MTdd 14,57 0,22 13,10 0,10 Nhãn xét: - Trên MT2, Streptomyces3 5 .29 sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất khi nuôi cấy bề mặt, khi lên men chìm MT2dd... để làm v s v kiểm định vì với 2 chủng này: hoạt tính kháng sinh ổn định, vòng vô khuẩn rõ ràng, chọn MT2 là mối trường nuôi cây bể mặt chủng Streptomyces 35. 29 - Sau khi nuôi cấy bể mặt, chúng tôi tiến hành lên men trên máy lắc để khảo sát khả nãng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 35. 29 trên các môi trường khác nhau Đánh giá hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau khi lên men bằng phưcfng pháp... trên nhiều chủng vi khuẩn kiểm định, Streptomyces 35. 29 tác dụng trên 6 trong 10 vi khuẩn thử là cơ sở để tiến hành nghiên cứu tiếp 2.2.3 Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy và các v s v kiểm định của chủng Streptomyces 35. 29 Streptomyces 35. 29 được cấy trên các môi trường khác nhau: MTl, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MTV ủ ở 30"C trong 6 ngày, lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phưcmg pháp khối thạch Kết... tetracyclin 5 Nhóm lincosamid 6 Kháng sinh chống nấm 7 Kháng sinh khác 1.3 Cải tạo gỉống vi sinh vật(l), (2),(6),(10) 1.3.1 Mục đích(2) Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ cơ chất thiên nhiên thường có hoạt tính thấp Vì vậy, để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất, đòi hỏi phải cải tạo chọn giống bằng các biện pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp ^ ‘ 1.3.2 Các phương... hiệu lá (±) 2,2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1 Kết quả phân loại theo ISP Chủng Streptomyces 35. 29 được nuôi cấy trên các môi trường ISP, kết quả được trình bày ồ bảng 2 Bảng 2, So sánh đặc điểm của Streptomyces 35. 29 vớỉ Streptomyces krainskii Streptomyces 35. 29 Streptomyces krainskii Màu của khuẩn ty khí sinh Y Y Sắc tố melanoid 0 0 Màu khuẩn ty cơ chất 1 1 Sắc tố hoà tan 1 1 Chuỗi bào tử RF... nhân sinh học Các tác nhân trên với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các vi sinh vật Những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi ờ nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng, dẫn đến hoặc là mất khả năng tạo ra kháng sinh (đột biến âm tính), hoặc là làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên (đột biến dưcíng tính) + Ánh sáng ư v có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế báo vi sinh. .. chế(2),(4),(6),(7),(9) + Kháng sinh tà sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, kết thúc quá trình lên men, kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin ), hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penicilin, streptomycin, ) tuỳ theo đặc điểm của loài Vì vậy, khi chiết tách để lấy kháng sinh phải lựa chọn phưcíng pháp thích hợp Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh + Một số phương . nãng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, có nhiều tiềm năng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Do đó chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomỵces 35. 29& quot; với. năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyce(3),(7), (9), (10). Một số lượng lớn các kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng hợp được nghiên cứu và sử dụng thuộc nhiều nhóm kháng sinh. suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 35. 29 bằng đột biến cải tạo giống kếl hợp với sàng lọc ngẫu nhiên. - Bước đầu lựa chọn mói trường phù hợp cho quá trình nuôi cấy. - Nghiên cứu