Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155 29

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 155.29 LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ PHƯƠNG NHUNG NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 155.29 LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60.73.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu HÀ NỘI - 2012 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Cao Văn Thu, người thầy tận tình hướng dẫn tơi từ bước đến hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Phòng Cộng hưởng từ hạt nhân, Viện Hóa Học, Phòng Cấu trúc, Viện Hóa học hợp chất tự nhiên, Viện Khoa học Cơng nghệ Viêt Nam, khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội giúp đỡ thời gian làm thực nghiệm Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Và cuối lời cảm ơn tơi gửi tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Với điều kiện hạn hẹp thời gian, phương tiện nghiên cứu trình độ thân, luận văn chắn có nhiều thiếu sót Tơi mong nhận góp ý thầy cơ, bạn bè để luận văn hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2012 Học viên Trần Thị Phương Nhung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN - 1.1 Đại cương kháng sinh - - 1.1.1 Khái niệm kháng sinh - - 1.1.2 Cơ chế tác dụng kháng sinh - - 1.1.3 Các ứng dụng kháng sinh - - 1.2 Đại cương xạ khuẩn - - 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn: - - 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces - - 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh - - 1.4 Tuyển chọn, cải tạo bảo quản giống xạ khuẩn - - 1.4.1 Mục đích - - 1.4.2 Chọn chủng có HTKS cao phép chọn lọc ngẫu nhiên - - 1.4.3 Đột biến cải tạo giống - - 1.4.4 Bảo quản giống xạ khuẩn - - 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh - - 1.6 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men - - 1.7 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh - - 1.7.1 Phổ tử ngoại - khả kiến - - 1.7.2 Phổ hồng ngoại - 10 - 1.7.3 Phổ khối lượng - 10 - 1.7.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - 10 - 1.8 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15.29 Streptomyces microflavus - 11 1.9 Actinomycin X2, chất kháng sinh lên men từ trình sinh tổng hợp - 12 1.10 Sự phát triển phương pháp sinh học sản xuất Actinomycin D - 13 1.11 Nghiên cứu tối ưu hóa thành phần mơi trường quy trình sinh tổng hợp Actinomycin X2 từ Streptomyces spp JAU4234 - 15 1.12 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện khơng gian đến q trình sinh tổng hợp Actinomycin từ xạ khuẩn Streptomyces plicatus - 16 1.13 Nghiên cứu ảnh hưởng trình sốc nhiệt đến hình thành thành phần nhóm Actinomycin - 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị - 18 2.1.1 Nguyên vật liệu - 18 - 2.1.2 Máy móc thiết bị - 21 - 2.2 Phương pháp thực nghiệm - 22 2.3.1 Nuôi cấy giữ giống xạ khuẩn - 22 - 2.3.2 Phân loại xạ khuẩn theo ISP - 22 - 2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán - 24 - 2.3.4 Sàng lọc ngẫu nhiên - 25 - 2.3.5 Đột biến ánh sáng UV - 25 - 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh - 27 - 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men dung môi hữu - 27 - 2.3.8 Tách thành phần kháng sinh sắc ký lớp mỏng - 28 2.2.9 Thu kháng sinh thô phương pháp cất quay - 29 2.3.10 Tinh chế kháng sinh thô sắc ký cột - 29 2.3.11 Xác định cấu trúc hóa học thành kháng sinh tinh khiết thu - 29 Chương KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT - 31 3.1 Chọn lọc cải tạo giống xạ khuẩn - 31 3.1.1 Xác định tên khoa học Streptomyces 155.29 - 31 3.1.2 Kết sàng lọc ngẫu nhiên - 32 3.1.3 Kết đột biến lần thứ - 33 3.1.4 Kết đột biến lần thứ hai - 35 3.2 Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu - 37 3.2.1 Kết chọn chủng lên men - 37 3.2.2 Kết khảo sát dung môi chiết pH chiết - 38 3.2.3 Kết lên men, chiết cất quay thu kháng sinh thô - 39 3.2.4 Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ - 39 3.2.5 Kết tinh chế kháng sinh lần thứ - 41 3.2.6 Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ hai - 43 3.2.7 Kết tinh chế kháng sinh lần thứ hai - 44 3.3 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh - 46 3.3.1 Kết đo độ nóng chảy - 46 3.3.2 Kết phổ tử ngoại - 47 3.3.3 Kết phổ hồng ngoại - 47 - 3.3.4 Kết đo phổ khối - 47 3.3.5 Kết đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân - 48 Chương BÀN LUẬN - 49 4.1 Chọn lọc cải tạo giống xạ khuẩn - 49 4.2 Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu - 49 4.3 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh - 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 54 - DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên ĐB Đột biến IR Hồng ngoại - Infrared KS Kháng sinh MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại – Ultraviolet Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm SKLM Sắc ký lớp mỏng HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project NMR Nuclear Magnetic Resonance DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định …………………… ……………………………… 18 Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn……………………………………………………18 Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định…………………………………………….19 Bảng 2.4: Các dung môi sử dụng……………………………………………………… 21 Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP Streptomyces 155.29 S krainskii …… 31 Bảng 3.2: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên …………………………………… 32 Bảng 3.3 Tính tốn tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ ……………… ………….33 Bảng 3.4 Kết thử HTKS sau đột biến lần thứ ……………………………… 34 Bảng 3.5 Tính tốn tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai …………………………… 36 Bảng 3.6 Kết thử HTKS sau đột biến lần thứ hai ………………………………….36 Bảng 3.7 Kết chọn chủng lên men …………………………………………………38 Bảng 3.8 Kết chọn dung môi pH chiết (trên P mirabilis) …………………… 39 Bảng 3.9 Thành phần hệ dung môi …………………………………………………40 Bảng 3.10 Kết tách kháng sinh dịch chiết SKLM …………………… 41 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột lần thứ …………………………………………… 42 Bảng 3.12 Tỷ lệ thành phần hệ dung môi cải tiến ……………………………… 44 Bảng 3.13 Kết SKLM với hệ dung môi cải tiến …………………………… 44 Bảng 3.14 Kết thử HTKS phân đoạn sau tinh chế lần ………………………45 Bảng 3.15 Kết SKLM phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai …………………….46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ………………………………….5 Hình 1.2 Cấu tạo hóa học Actinomycin D …………………………………………14 Hình P12a Phổ DEPT chất KS2 Hình P12b Phổ DEPT chất KS2 Hình P9a Phổ 1HNMR chất KS2 Hình P9b Phổ 1HNMR chất KS2 Hình P10a Phổ 13CNMR chất KS2 Hình P10b Phổ 13CNMR chất KS2 Hình P13 Phổ HMBC chất KS2 Hình P13a Phổ HMBC chất KS2 Hình 14 Phổ HSQC chất KS2 Hình 14a Phổ HSQC chất KS2 Hình 14b Phổ HSQC chất KS2 Hình 14c Phổ HSQC chất KS2 Hình 15 Phổ HSQC chất KS2 Hình 16 Phổ HSQC chất KS2 ... hưởng từ hạt nhân - 10 - 1.8 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15 .29 Streptomyces microflavus - 11 1.9 Actinomycin X2, chất kháng sinh lên men từ trình... hợp hoá học, bán tổng hợp sinh tổng hợp ba hướng phát tổng hợp kháng sinh Trong sinh tổng hợp kháng sinh hướng với nhiều ưu điểm sử dụng chủ yếu để tìm kháng sinh Bộ mơn Vi sinh – Sinh học trường... lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 155. 29 làm luận văn thạc sĩ Mục tiêu luận văn hướng đến là: nghiên cứu tìm hiểu chất kháng sinh Streptomyces 155. 29 sinh -1- Chương TỔNG QUAN 1.1