khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (pangasius hypophthalmus) bằng enzyme neutrase

LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm, đề tài “Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra Pangasius hyphophthalmus bằng enzyme Neutrase

NGUYỄN HỮU TÀI

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA

NGUYỄN HỮU TÀI

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA

2014

LỜI CẢM ƠN

Sau hơn 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm, đề

tài “Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius

hyphophthalmus) bằng enzyme Neutrase” đã được hoàn thành đúng thời hạn

với sự giúp đỡ, chỉ dẫn và chia sẻ của cán bộ hướng dẫn, các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm cùng tập thể các anh chị và các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm

Nhân đây, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Công Hà cùng cô Phan Nguyễn Trang đã tận tình chỉ dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm cùng những góp ý quý báu trong suốt thời gian học tập và thực nghiệm vừa qua

Bên cạnh đó, em xin được cảm ơn anh Tạ Hùng Cường, chị Nguyễn Tố Mai và tập thể các anh chị Cao học, các bạn cùng lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 37 Đồng thời, em xin được cảm ơn chị Nguyễn Phụng Tiên và các cán

bộ quản lý phòng thí nghiệm cũng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất có thể, cho em những lời động viên giúp em hoàn thành tốt đề tài này Hơn nữa, Em xin được cảm ơn các anh chị phòng thí nghiệm Sinh học Đất đã hỗ trợ và giúp

đỡ em tận tình trong lúc sử dụng các thiết bị, máy móc của phòng thí nghiệm

Em rất biết ơn sự giúp đỡ của các anh chị và các bạn Em xin cảm ơn mọi người rất nhiều

Sau cùng em, xin được cảm ơn Ban quản lý Công ty CP XNK Thủy sản Cần Thơ (CASEAMEX) đã hỗ trợ nguyên liệu cho em để thực hiện đề tài này Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hữu Tài

TÓM TẮT

Nhằm khảo sát quá trình thủy phân trên cơ chất là phụ phẩm cá tra của enzyme Neutrase, từ đó tìm ra các thông số động học Km, Vmax của enzyme và ảnh hưởng của thời gian phản ứng cũng như nồng độ enzyme và cơ chất lên hiệu suất thủy phân, đề tài đã được tiến hành với các nội dung:

 Xác định các thông số động học Km và Vmax của enzyme Neutrase trên

cơ chất là phụ phẩm cá tra, tìm ra tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất (mg enzyme : g protein) tại đó tốc độ phản ứng của enzyme là lớn nhất (trong một thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 là 10 mL)

 Khảo sát tác động của việc tăng tuyến tính đồng thời khối lượng enzyme và cơ chất, dựa trên tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất đã tìm được (trong một thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 là 10 mL) lên hiệu suất thủy phân của enzyme Neutrase

 Sau đó, đề tài đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất thủy phân của Neutrase, nhằm tìm ra thời gian tối ưu để hiệu suất thủy phân đạt cao nhất

Và qua quá trình thực nghiệm, đề tài đã thu được các kết quả như sau:

 Enzyme Neutrase hoạt động trên cơ chất phụ phẩm cá tra với các thông số động học Vmax = 0,190 μmol tyrosine/phút, Km = 0,254 g protein, và với tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất = 0,5 mg enzyme: 0,694 protein thì tốc

độ phản ứng của enzyme là lớn nhất

 Việc tăng đồng thời khối lượng enzyme và cơ chất (với thể tích phản ứng là cố định) trên cơ sở tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất tối ưu đã gây ức chế hoạt động của enzyme nên cặp khối lượng enzyme : cơ chất thích hợp được chọn là 0,5 mg E : 0,694 g Pro

 Khi thời gian phản ứng kéo dài từ 30 đến 240 phút, hiệu quả thủy phân tăng nhanh vào giai đoạn đầu và sau đó tăng chậm lại cho đến khi đạt mức cao nhất tại 240 phút (6,359 % theo tyrosine và 3,244 % theo phương pháp OPA) nên thời gian thủy phân hiệu quả được chọn là 240 phút

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất

cứ luận văn cùng cấp nào khác

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

TS Nguyễn Công Hà ThS Phan Nguyễn Trang Nguyễn Hữu Tài

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

LỜI CAM ĐOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vi

DANH SÁCH HÌNH vii

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về cá tra 2

2.2 Thành phần hóa học của cá tra 4

2.2.1 Protein 5

2.2.2 Thành phần trích ly chứa nitơ phi protein 5

2.2.3 Enzyme 6

2.2.4 Lipid 6

2.2.5 Carbohydrate 6

2.2.6 Vitamin và khoáng chất 6

2.2.7 Phụ phẩm trong chế biến cá tra 7

2.3 Sơ lược về protein 7

2.3.1 Biến tính protein 9

2.4 Sơ lược về enzyme 10

2.4.1 Cấu trúc enzyme 10

2.4.2 Động học enzyme 10

2.4.3 Cơ chế thủy phân của enzyme 11

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme 12

2.4.5 Enzyme Neutrase 16

2.5 Máy quang phổ 17

2.6 Thuốc thử Folin-Ciocalteu 17

2.7 Trichloroacetic acid (TCA) 18

2.8 Phương pháp OPA 19

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Phương tiện nghiên cứu 20

3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 20

3.1.2 Nguyên liệu 20

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ 20

3.1.4 Hóa chất 21

3.2 Phương pháp nghiên cứu 21

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 21

3.2.2 Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme 22

3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm 22

3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số 22

3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid 22

3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng tyrosine tổng số 22

3.2.7 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo lượng tyrosine sinh ra 23

3.2.8 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo hàm lượng đạm amine 23 3.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 23

3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm 23

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các thông số động học của enzyme Neutrase trên cơ chất là phụ phẩm cá tra 23

3.3.2 Thí nghiệm 2 : Xác định khối lượng enzyme và cơ tối ưu dựa trên tỷ lệ enzyme : cơ chất tối ưu 25

3.3.3 Thí nghiệm 3 : Xác định thời gian thủy phân tối ưu 27

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 30

4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu 30

4.2 Các thông số động học của của enzyme Neutrase trên cơ chất phụ phẩm cá tra 31

4.3 Xác định khối lượng enzyme : cơ chất tối ưu dựa trên tỷ lệ khối lượng enzyme : cơ chất tối ưu của Neutrase trên cơ chất phụ phẩm cá tra 32

4.4 Xác định thời gian phản ứng tối ưu của quá trình thủy phân bởi enzyme Neutrase 34

Chương 5 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 41

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Phần trăm các phần thu được trong chế biến cá tra (Pangasius

hypophthalmus) phi lê 7

Bảng 4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu 30

Bảng 4.2 Thành phần hóa học của cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê 31 Bảng 4.3 Thành phần hóa học của phụ phẩm cá tra (Pangasius

hypophthalmus) 31

Bảng 4.4 Hiệu suất thủy phân (tính theo hàm lượng tyrosine) của Neutrase ở các hệ số nhân khác nhau 33Bảng 4.5 Hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) của Neutrase ở các hệ số nhân khác nhau 33Bảng 4.6 Hiệu suất thủy phân của Neutrase theo thời gian phản ứng 34Bảng 5.1 Công thức hóa chất để xây dựng đường chuẩn tyrosine 43Bảng 5.2 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân (tính theo

tyrosine) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau 48Bảng 5.3 Kiểm định LSD Hiệu suất thủy phân theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau 48Bảng 5.4 Phân tích phương sai hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau 49Bảng 5.5 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau 49Bảng 5.6 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo

tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm 3 49Bảng 5.7 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm 3 49Bảng 5.8 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo pp OPA theo thời gian phản ứng 50Bảng 5.9 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo pp OPA theo thời gian phản ứng 50

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Sản phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) nguyên con 3

Hình 2.2 Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) 3

Hình 2.3 Cá Ba sa (Pangasius bocourti) 3

Hình 2.4 Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis-Menten 11

Hình 2.5 Phản ứng xúc tác đơn giản của enzyme 12

Hình 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng 13

Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme vào nhiệt độ 14

Hình 2.8 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng enzyme vào pH 15

Hình 2.9 Trichloroacetic acid 19

Hình 2.10 Phản ứng theo phương pháp OPA 19

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 25

Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) 27

Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) 28

Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào lượng cơ chất 32

Hình 4.2 Hiệu suất thủy phân của Neutrase theo thời gian phản ứng 35

Hình 4.3 Ảnh chụp gel chạy điện di của dịch protein thủy phân bởi Neutrase 35 Hình 5.1 Đường chuẩn tyrosine 44

Chương 1

GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, cá tra đã và đang trở thành mặt hàng chế biến

và xuất khẩu vượt trội hơn rất nhiều so với các loài thủy sản khác ở nước ta Con cá tra đã góp phần giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động với sự xuất hiện ngày càng nhiều các nhà máy, xí nghiệp chế biến và xuất khẩu mặt hàng thủy sản này Tuy nhiên, bên cạnh thu về cho đất nước nguồn thu từ việc xuất khẩu cá tra phi lê và các sản phẩm khác từ cá tra, sự tăng lên cả ở lĩnh vực nuôi trồng lẫn chế biến cá tra xuất khẩu cũng đồng thời tạo ra một lượng phụ phẩm, những phần còn lại sau khi thu lấy phần phi lê cá để xuất khẩu, rất lớn Do đó, khi quy mô sản xuất và chế biến mặt hàng cá tra ngày càng mở rộng, lượng phụ phẩm được thải ra ngày càng nhiều hơn Nếu lượng phụ phẩm này không được xử lý đúng cách sẽ gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường Mặt khác, nguồn phụ phẩm này vẫn còn giá trị dinh dưỡng tương đối cao Nếu tận dụng được nguồn phế liệu này sẽ tạo ra nguồn thu nhập cho người sản xuất, giảm thiểu lãng phí và tăng hiệu suất thu hồi chất dinh dưỡng trong sản xuất, chế biến sản phẩm từ cá tra

Về hướng xử lý phụ phẩm các mặt hàng thủy sản, có thể sử dụng phần

bỏ đi sau khi chế biến cá tra phi lê để chế biến bột cá dùng trong chăn nuôi, bong bóng cá dùng làm thực phẩm, dầu cá giàu dinh dưỡng và không chứa cholesterol, nhiên liệu sinh học (biodiesel), … Tuy nhiên, các hướng xử lý này vẫn chưa tận dụng được nguồn protein còn lại một cách hiệu quả Gần đây một hướng xử lý mới đang được quan tâm là chế biến các sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm cá, tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có thể sử dụng ngay cả trong thực phẩm Tuy nhiên, các nghiên cứu về hướng xử

lý mới này trên các loài cá khác là khá phổ biến nhưng trên cá tra vẫn còn hạn chế

Vì vậy, đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein phụ phẩm cá tra

(Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase” đã được tiến hành

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài “Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius

hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase” được tiến hành nhằm mục tiêu tìm ra

các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất, khối lượng enzyme và cơ chất tối đa có thể sử dụng (trên một thể tích phản ứng) và thời gian thủy phân tối ưu để thu được hiệu suất thủy phân cao nhất

Chương 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cá tra

Cá tra thuộc họ Pangasiidae Họ Pangasiidae (họ cá Tra) có 3 chi: chi

Sinopangasius (1 loài), chi Helicophagus (3 loài) và chi Pangasius (27 loài)

Tuy nhiên chi và loài Sinopangasius, theo vài tài liệu như FishBase và một số

bảng từ đồng nghĩa (trích dẫn của https://voer.edu.vn), được coi là từ đồng

nghĩa của Pangasius Kempfi (cá Bông Lau) Ngoài ra, trong chi Pangasius,

trong 2 bảng phân loại khoa học nêu trên có 3 cặp tên đồng nghĩa Như vậy, có

thể kể họ Pangasiidae có 2 chi và chi Pangasius có 24 loài

Ở Việt Nam, cá tra sống chủ yếu ở lưu vực sông Cửu Long và lưu vực các sông lớn cực Nam Loại cá này có thân dẹp, da trơn và râu ngắn

Cá tra (theo Từ điển tiếng Việt, Nhà xuất bản Khoa học Xã hội, 1997, trích dẫn của https://voer.edu.vn) là loài cá nước ngọt, không vảy, giống cá trê nhưng không ngạnh Sự so sánh giữa cá tra và cá trê càng thêm tối nghĩa vì hai nhóm cá này có nhiều điểm khác biệt Bên cạnh đó, trong phân loại khoa học

chúng thuộc 2 họ khác nhau là Pangasiidae và Clariidae

Cá thuộc họ Pangasiidae (họ cá Tra) với tên Việt có những loài sau :

Helicophagus waandersii – cá Tra Chuột

Pangasius gigas – cá Tra Dầu

Pangasius kunyit – cá Tra Bần

Pangasius hypophthalmus – cá Tra nuôi

Pangasius micronema – cá Tra

Pangasius polyuranodon – cá Dứa

Pangasius krempfi – cá Bông Lau

Nhóm cá Cá Tra nuôi (Pangasius hypophthamus) có hình dáng đặc trưng

như trên các hình sau :

Hình 2.1 Sản phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) nguyên con

Helicophagus Ngoại trừ 3 loài : cá Hú, cá Dứa và cá Bông Lau, những loài cá

trong họ cá Tra có 3 nhóm : nhóm cá Tra, nhóm cá Vồ và nhóm cá Xác

Trở về nguồn gốc tên Việt của 3 nhóm cá này: tên cả 3 nhóm đều thuộc vào từ ngữ vay mượn từ tiếng Khmer : cá Tra từ chữ Trey Pra, cá Vồ từ chữ Trey Po và cá Xác từ chữ Trey Chhwaet Còn 3 loài còn lại thì cá Hú trong tiếng Khmer thuộc Trey Pra (cá Tra) và cá Dứa được gọi là Trey Chhwaet (cá Xác) Chỉ riêng cá Bông Lau, tiếng Khmer gọi là Trey Bong Lao

Tuy còn nhiều điểm chưa thống nhất giữa hai ngôn ngữ Việt-Khmer, nhưng việc gọi tên từng nhóm cá của người Khmer và người Việt đã khơi màu

cho vấn đề đặt tên phân chi cho chi Pangasius

Trong số 13 loài cá này, có hai loài cá đã được ghi vào sách đỏ Việt Nam

Loài cá Vồ Cờ (Pangasius sanitwonsei) được ghi tên trong sách đỏ từ năm

1996 Loài cá Tra Dầu (Pangasius gigas) có tên trong sách đỏ từ năm 2002

Ngoài ra, có một số loài đã trở thành cá nuôi, vài loài được nuôi với tầm vóc qui mô

Trong họ cá Tra có một số loài được nuôi trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là

cá Tra (cá Tra nuôi) Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một ngành công nghiệp nuôi và chế biến mà họ cá Tra là trọng điểm

Đối với 2 loài có tên trong sách đỏ, đã có những dự kiến bảo vệ bằng cách cấm hoàn toàn việc săn bắt và nghiên cứu phương thức để nuôi

Về sản lượng nuôi trồng, vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt mức 400.000 tấn cá Tra và cá Xác Bụng vào năm 2005 và còn nhiều tiềm năng để gia tăng trong giai đoạn tới (https://voer.edu.vn)

2.2 Thành phần hóa học của cá tra

So với cơ thịt động vật máu nóng, cơ thịt cá có sự khác biệt ở một số điểm sau:

 Hàm lượng mô liên kết trong cơ thịt cá thấp hơn

 Nhiệt độ collagen hóa ở cá thấp hơn nhiệt độ này ở thịt hàng chục độ

 Myosin chiếm 40% protein tổng số và rất khó tách ra khỏi actin Protein này rất nhạy với biến tính nhiệt và rất dễ bị thủy phân bởi protease hơn myosin ở động vật máu nóng

 Hiện tượng cứng và chín của thịt cá diễn ra nhanh hơn Đặc biệt, sau khi cá chết, pH giảm ít hơn (từ 7 xuống 6,5-6,2) Do đó, cá rất không bền đối

với vi sinh vật (Lê Ngọc Tú và ctv., 2003)

Protein chất cơ :

Protein chất cơ bao gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm khoảng 25-30% hàm lượng protein trong cá Các protein này hòa tan trong nước, trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp (dưới 0,5 M) Bên cạnh đó, hầu hết các protein chất cơ bị đông tụ khi đun nóng ở nhiệt độ trên 50 0C (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

Protein mô liên kết :

Protein mô liên kết gồm có các sợi collagen, elastin Hàm lượng collagen

ở cơ thịt cá thấp hơn ở động vật có vú, thường khoảng 1-10% tổng lượng protein Các protein này có trong mạng lưới ngoại bào Chúng không tan trong nước, trong dung dịch kiềm hoặc trong dung dịch muối có nồng độ cao

Khi so sánh về khả năng hòa tan trong nước giữa 3 nhóm protein của cá, các protein tương cơ là dễ hòa tan nhất Vì vậy, khi rửa, ướp muối hoặc tan giá, … không đúng cách có thể làm thất thoát một lượng protein đáng kể, làm mất giá trị dinh dưỡng (Phan Thị Thanh Quế, 2006) Protein của cá có điểm đẳng điện pI (isoelectric point) nằm trong khoảng pH 4,5-5,5 Do đó, độ hòa tan của protein của cá có giá trị thấp nhất trong khoảng pH này (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.2.2 Thành phần trích ly chứa nitơ phi protein

Các chất trích ly chứa nitơ phi protein là nhữngthành phần hòa tan trong nước, có vai trò rất quan trọng trong chế biến thủy sản vì chúng ảnh hưởng đến mọi tính chất của thực phẩm như màu sắc, mùi vị, trạng thái cấu trúc, dinh

dưỡng, sự an toàn và sự hư hỏng sau thu hoạch Các chất này chiếm khoảng 18% tổng hàm lượng protein ở cá xương và khoảng 33-38% ở cá sụn Nhóm chất này có thành phần chính bao gồm các chất bay hơi (ammonia, amine, trimethylamine, dimethylamine), trimethylamine N-oxide (TMAO), dimethylamine N-oxide (DMAO), creatine, các amino acid tự do, nucleotide, urea (có nhiều trong cá sụn), … (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

9-2.2.3 Enzyme

Enyme tham gia vào quá trình trao đổi chất ở tế bào, quá trình tiêu hóa thức ăn và quá trình tê cứng ở cá Sau khi cá chết, enzyme vẫn còn hoạt động nên gây ra quá trình tự phân giải của cá

Trong nguyên liệu cá có nhiều enzyme khác nhau Các nhóm enzyme chính ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu là enzyme thủy phân và enzyme oxy hóa khử Nhiều loại protease được tách từ cơ thịt cá và có tác dụng làm mềm mô cơ Các enzyme thủy phân protein quan trọng trong nguyên liệu gồm: cathepsin, protease kiềm, collagenase, pepsin, trypsin, chimotrypsin Còn các enzyme thủy phân lipid quan trọng trong cá gồm có lipase và phospholipase Chúng tồn tại trong các cơ quan nội tạng và trong cơ thịt (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.2.6 Vitamin và khoáng chất

Cá là nguồn cung cấp chính vitamin nhóm B (B1, B2 và B12) Ngoài ra, vitamin A và D có chủ yếu trong các loài cá béo Vitamin A và D tích lũy chủ yếu ở gan, vitamin nhóm B có nhiều trong cơ thịt cá

Thông thường, các vitamin rất nhạy cảm với oxy, ánh sáng và nhiệt độ Ngoài ra, các quá trình chế biến thực phẩm như sản xuất đồ hộp, tan giá, ướp muối, … ảnh hưởng lớn đến thành phần vitamin Vì vậy, cần phải chú ý để tránh tổn thất vitamin trong các quá trình chế biến

Về thành phần khoáng, chất khoáng của cá phân bố chủ yếu trong mô xương, đặc biệt trong xương sống Trong đó, calcium và phosphorus là hai nguyên tố chiếm nhiều nhất trong xương cá còn thịt cá là thì giàu sắt, đồng, lưu huỳnh và iodine Ngoài ra còn có nickel, cobalt, chì, arsenic, kẽm (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.2.7 Phụ phẩm trong chế biến cá tra

Cá tra sau khi phi lê, qua các công đoạn chỉnh sửa và đi đến công đoạn thành phẩm thì hiệu suất thu hồi chỉ đạt khoảng 38,6% (Nguyen Phuoc Minh,

2014, Bảng 2.1) Điều này có nghĩa là 61,4% còn lại của con cá tra, được xem

là phụ phẩm bao gồm đầu, xương, da, nội tạng,… chiếm một khối lượng rất lớn

Bảng 2.1 Phần trăm các phần thu được trong chế biến cá tra (Pangasius

hypophthalmus) phi lê

(Nguyen Phuoc Minh, 2014)

Do vậy, nếu không có biện pháp xử lý lượng phụ phẩm này đúng cách

sẽ gây nguy hại đến môi trường và gây lãng phí rất nhiều, bởi vì ngoài phần phi lê, các phần còn lại sau quá trình sản xuất cá phi lê vẫn chứa những giá trị dinh dưỡng đáng kể

Tuy nhiên, thực trạng trên cũng đã và đang được xã hội quan tâm Bằng chứng là việc tạo ra được những sản phẩm giá trị gia tăng từ những phần phụ phẩm của con cá tra như bột cá dùng cho chăn nuôi, mỡ cá, xăng sinh học (biodiesel), bao tử cá, bong bóng cá, vây cá,… Thế nhưng, những nhà máy chế biến phụ phẩm vẫn còn hạn chế và những sản phẩm trên vẫn chưa phát huy hết được tiềm năng vốn có của phụ phẩm từ con cá tra Hiện nay, những sản phẩm

từ quá trình thủy phân phụ phẩm cá là xu hướng mới đang được quan tâm

2.3 Sơ lƣợc về protein

Các amino acid bên cạnh tồn tại ở dạng tự do còn liên kết với nhau thông qua liên kết peptide tạo nên những đoạn peptide Tùy thuộc vào số lượng các amino acid trong mạch peptide mà có di-, tri-, tetra-,… oligopeptide Khi số lượng amino acid trong chuỗi peptide lớn hơn 10 thì chuỗi này được gọi là polypeptide Protein cũng được tạo thành từ các amino acid qua liên kết

peptide khi số amino acid trong mạch polypeptide đạt khoảng 100 đến trên

900, với khối lượng phân từ tương ứng từ 10 đến trên 100 kDa

Về phân loại, các protein có thể được phân loại dựa vào tính đồng thể (homoprotein và heteroprotein) hay dựa vào chức năng của chúng trong các bộ phận, các cơ quan sinh học (protein cấu trúc, protein chức năng và protein dự trữ) Enzyme là những protein chức năng Bên cạnh các protein chỉ có các amino acid trong thành phần (protein đơn giản), còn có một số loại protein phức tạp khác như: phosphoprotein – chứa các gốc ester với phosphoric acid (như casein, phosvitin của lòng đỏ trứng), glycoprotein – chứa một hoặc nhiều monosaccharide hoặc oligosaccharide trong thành phần (như một số protein trong lòng đỏ và lòng trắng trứng, collagen của các mô liên kết, serum ở một

số loài cá) (Hoàng Kim Anh, 2007)

Về cấu trúc không gian, protein được phân thành 4 loại như sau:

đó, có thể dự đoán cấu trúc không gian cho một chuỗi polypeptide khi đã biết trình tự các amino acid

Ngoài ra, nhiều cấu trúc xoắn α và cấu trúc tấm xếp gấp β-sheet có thể kết hợp lại với nhau để tạo thành siêu cấu trúc bậc hai, như trường hợp các cuộn xoắn nhỏ nằm trong một đoạn xoắn lớn hay trường hợp cấu trúc tấm nối tiếp cấu trúc xoắn… (Hoàng Kim Anh, 2007)

hydro và liên kết kỵ nước (hydrophobe) Tuy nhiên, cũng tồn tại cả liên kết tĩnh điện và liên kết disulfide (Hoàng Kim Anh, 2007)

Cấu trúc bậc bốn :

Một phân tử protein có thể có một hoặc nhiều tiểu đơn vị (còn được gọi

là các subunit hay những chuỗi peptide độc lập – single peptide chain) Các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau nhờ các liên kết không đồng hóa trị tạo thành cấu trúc bậc bốn của protein Các tiểu đơn vị này có thể cùng loại hoặc khác loại và các liên kết tạo nên cấu trúc bậc bốn bao gồm các liên kết đã tạo nên cấu trúc bậc ba (trừ các cầu đồng hóa trị sulfide) Chính cấu trúc bậc bốn

sẽ thể hiện hoạt tính sinh học của các protein chức năng (Hoàng Kim Anh, 2007)

2.3.1 Biến tính protein

Biến tính là hiện tượng thay đổi thuận nghịch hoặc không thuận nghịch cấu trúc không gian ban đầu của protein nhưng không làm biến đổi các liên kết hóa trị trong phân tử (trừ liên kết disulfide) Các liên kết bị phá vỡ có thể là các cầu hydro, liên kết kỵ nước hoặc liên kết ion Khi protein bị biến tính, các tính chất của chúng cũng bị thay đổi Hiện tượng biến tính xảy ra khi có mặt tác nhân gây biến tính và phục hồi lại (một phần hay hoàn toàn) các tính chất của protein khi loại bỏ các tác nhân này được gọi là sự biến tính thuận nghịch Ngược lại, biến tính không thuận nghịch không có khả năng phục hồi lại các tính chất ban đầu và thường xảy ra khi các cầu disulfide bị phá vỡ

Khi các protein bị biến tính, chúng dễ bị thủy phân bởi các protease hơn khi ở dạng chưa biến tính, còn các protein có hoạt tính sinh học như các enzyme thì thường sẽ bị mất hoạt tính (Hoàng Kim Anh, 2007)

Các tác nhân gây biến tính protein có thể gồm những loại sau:

 Đun nóng: Đun nóng ở nhiệt độ cao sẽ dẫn đến sự phá vỡ các liên kết hydro, làm cấu trúc bậc hai, ba và bốn của protein bị thay đổi Hệ quả là các tính chất lý hóa học và hoạt tính sinh học đặc hiệu cũng bị thay đổi

 Làm lạnh: Vài enzyme bền ở nhiệt độ phòng nhưng trở nên kém bền ở

0 0C (như L-threonine deaminase) Một số protein cũng sẽ bị biến đổi khi ở nhiệt độ thấp hoặc ở nhiệt độ đóng băng

 Áp suất: Xử lý áp suất cao có thể dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc bậc bốn của protein tạo thành các tiểu đơn vị ở áp suất từ 1000-2000 bar Các protein cấu tạo từ một sợi polypeptide sẽ bị mất một phần cấu trúc bậc ba ở áp suất trên 3000 bar (có thể là do làm yếu tương tác kỵ nước và phá vỡ các cầu muối)

 Tác nhân hóa học: Ở pH cực trị, khả năng tích điện của protein bị ảnh hưởng dẫn đến sự giãn mạch Urea và guanidine thì tác dụng lên liên kết hydro

và tương tác kỵ nước Còn các chất tẩy rửa tổng hợp sẽ phá vỡ tương tác kỵ nước và làm tăng xu hướng tháo cuộn Bên cạnh đó, các chất khử (β-mecapto ethanol) phá vỡ liên kết cầu disulfide

Sự biến tính protein thường không thuận nghịch trừ trường hợp tác nhân gây biến tính nhẹ hoặc đối với protein có phân tử lượng thấp (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2009)

2.4 Sơ lƣợc về enzyme

Hầu hết các phản ứng trong tế bào sống đều đòi hỏi sự có mặt của một enzyme cụ thể Chúng là những chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Các enzyme này có chức năng xúc tác cho việc tạo ra và phá vỡ các liên kết hóa học Do đó, giống như bất kỳ chất xúc tác khác, các enzyme làm gia tăng tốc độ phản ứng mà không làm thay đổi về mặt hóa học của bản thân nó (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

tử hay enzyme phức tạp Đối với enzyme đa cấu tử, phần protein được gọi là

“feron” hay “apoenzyme” còn phần phi protein được gọi là nhóm ngoại

“agon” Khi nhóm ngoại được tách khỏi phần protein, tồn tại độc lập, chúng được gọi là “coenzyme”

Thông thường, các enzyme trong tế bào tồn tại dạng cấu trúc bậc bốn Khi chịu tác động bởi một số yếu tố nhất định, chúng sẽ phân ly thành các tiểu đơn vị và hoạt tính của enzyme lúc này bị mất hoàn toàn Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme có thể được phục hồi nếu các tiểu đơn vị này kết hợp lại với nhau khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

2.4.2 Động học enzyme

Động học của enzyme là những thông tin về cơ chế cơ bản và những tham số khác của enzyme đặc trưng cho tính chất của chúng Hai tham số quan trọng trong quá trình nghiên cứu động học enzyme là Vmax và Km Km chính là

hằng số phân ly hiệu quả (dissociation constant), nó thể hiện độ nhạy của một phản ứng enzyme còn Vmax là tốc độ phản ứng cực đại Km nhỏ chỉ ra rằng enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt trạng thái bão hòa Do đó, tốc độ phản ứng cực đại Vmax đạt được tại một nồng độ cơ chất tương đối thấp Ngược lại, Km lớn nói lên rằng phản ứng của enzyme cần một lượng cơ chất lớn để có thể đạt đến tốc độ cực đại Vmax (Hình 2.4)

Các thông số động học của enzyme được biểu diễn thông qua nhiều phương trình động học khác nhau Trong đó, phương trình Michaelis-Menten được sử dụng phổ biến hơn cả do dễ sử sụng trong việc đánh giá các thông số động học của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Hình 2.4 Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis-Menten

(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

2.4.3 Cơ chế thủy phân của enzyme

Bản chất của cơ chế tác động bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn Đặc biệt, khi có sự xúc tác của enzyme thì phản cần một năng lượng hoạt hóa nhỏ hơn

so với trường hợp không có mặt enzyme Quá trình xúc tác của enzyme gồm

ba giai đoạn:

Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo

thành phức hợp enzyme - cơ chất không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh

và cần một ít năng lượng

Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi dẫn đến làm căng và phá vỡ các

liên kết đồng hóa trị

Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng,

trở lại trạng thái tự do (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme :

Trong trường hợp có đầy đủ cơ chất, vận tốc của phản ứng enzyme sẽ tỷ

lệ thuận với nồng độ enzyme tham gia Nồng độ enzyme càng lớn thì lượng cơ chất bị biến đổi càng nhiều Tuy nhiên, cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng enzyme chậm (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011) Mối liên hệ giữa vận tốc phản ứng của enzyme và nồng độ enzyme tham gia

có thể được biểu diễn qua biểu thức sau :

v = k[E]

Trong đó : v : vận tốc phản ứng

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất :

Mischaelis và Menten đã giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và lập được phương trình biểu diễn sự liên quan giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) tham gia quá trình xúc tác thông qua phức hợp enzyme –

cơ chất (ES), tạo thành một sản phẩm (P), phản ứng sẽ xảy ra như minh họa trên Hình 2.5

Hình 2.5 Phản ứng xúc tác đơn giản của enzyme

(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Trong đó: K1 : hằng số vận tốc phản ứng tạo phức hợp ES

K2 : hằng số vận tốc phân ly phức hợp ES về cơ chất ban đầu và enzyme

K3 : hằng số vận tốc phản ứng phân ly phức hợp ES tạo sản phẩm P

Phương trình Mischaelis – Menten biểu thị sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất có dạng sau :

v = V max [S]/(K m +[S]) với K m = (K2+K3)/K1

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào nồng độ cơ chất theo phương trình Mischaelis – Menten có dạng nhánh hypecbol vuông góc (Hình 2.6), trong đó v là hàm số của [S] (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Hình 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng

(Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Ảnh hưởng của nhiệt độ :

Tốc độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng khi nhiệt độ tăng Tuy nhiên,

do có bản chất là protein nên enzyme kém bền với tác dụng của nhiệt độ Đa

số enzyme bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70 0C Tại khoảng nhiệt độ mà enzyme có thể tồn tại, khi nhiệt độ tăng 10 0C thì vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 đến 2 lần (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Bên cạnh các enzyme chịu nhiệt như các enzyme được phân lập từ những

vi sinh vật ưa nhiệt, cũng có các enzyme dễ bị biến tính bởi nhiệt Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), nhiều protein bắt đầu bị biến tính tại nhiệt độ 45 đến 50 0C Ngoài ra, đối với một phản ứng enzyme,

độ hoạt động của enzyme sẽ tăng từ 50 đến 100% nếu gia tăng nhiệt độ 10 0C Tuy nhiên, tốc độ phản ứng enzyme không tăng mãi khi nhiệt độ tăng, nó chỉ tăng đến khi đạt tốc độ cực đại và sau đó bị giảm (Hình 2.7) Các phản ứng enzyme cực kì nhạy cảm với nhiệt độ, chỉ cần thay đổi nhiệt độ phản ứng từ 1 đến 2 0C sẽ làm thay đổi từ 10 đến 20% kết quả về hiệu quả phản ứng

Bên cạnh đó, các enzyme nên được tồn trữ dưới 5 0C Tuy nhiên, một số enzyme cũng bị mất hoạt tính ở chế độ cấp đông (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme vào nhiệt độ

(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Ảnh hưởng của pH :

Enzyme bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH Mỗi enzyme hoạt động mạnh nhất ở một pH nhất định gọi là pH tối thích (Hình 2.8) Giá trị pH thấp hay cao ngoài điểm tối ưu sẽ dẫn đến kết quả giảm hoạt tính của hầu hết enzyme một phần hay hoàn toàn Đặt biệt, tại điểm đẳng điện pI (isoelectric point), enzyme

bị biến tính và không còn hoạt tính sinh học Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme vào pH có thể là do :

 Enzyme được cấu tạo từ các amino acid

 Amino acid có các nhóm chức có khả năng tích điện dương hay âm ở bất kỳ độ pH nhất định

 Enzyme được hoạt hóa khi mỗi amino acid ở trung tâm hoạt động sở hữu một điện tích nhất định Do đó sự hoạt hóa trung tâm hoạt động của enzyme phụ thuộc vào pH (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Tăng hoạt tính

Nhiệt độ tối ưu

Biến tính xảy ra

Tốc độ phản ứng (µmol/

phút)

Nhiệt độ phản ứng (0C)

Hình 2.8 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng enzyme vào pH

(Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Ảnh hưởng của chất hoạt hóa :

Các chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động trở thành hoạt động hoặc từ hoạt động yếu trở nên hoạt động mạnh hơn Những chất hoạt hóa thường là các ion kim loại Trong quá trình hoạt hóa, các ion kim loại có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động Chúng làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc làm nhiệm vụ ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác của enzyme (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Các anion, các ion kim loại tham gia hoạt hóa có thể nằm ở ô thứ 11 đến

ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleev Ngoài ra, các chất hoạt hóa có thể là các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phần tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Ảnh hưởng của các chất kìm hãm:

Chất kìm hãm là chất có khả năng làm yếu hoặc làm chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme Các chất kìm hãm có thể là các ion kim loại, các anion, các hợp chất hữu cơ có phân tử nhỏ hoặc protein Các chất kìm hãm có khả năng kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc:

Diện tích tiếp xúc là yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân Do vậy, để tạo điều kiện tốt hơn cho phản ứng thủy phân của enzyme, cần làm

tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Muốn vậy, có thể làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân, đồng thời, thời gian thủy phân do đó cũng được rút ngắn (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2011)

2.4.5 Enzyme Neutrase

Enzyme Neutrase có mã số EC là 3.4.24.28 Neutrase, một sản phẩm

ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis, được phân lập lần đầu tiên vào những

năm 1950 từ loài này

2.4.5.1 Đặc tính của enzyme Neutrase

Neutrase là một protease kim loại Chúng phân cắt fibronectin, collagen

IV đến một mức độ thấp hơn là collagen I Bên cạnh đó, Neutrase không phân cắt collagen V hoặc laminin Khi thực hiện quá trình thủy phân liên kết peptide, Neutrase xuất phát từ đầu nhóm amine (N-terminal) không phân cực của amino acid và ưu tiên thủy phân các protein biến tính

Đặc biệt, trên mỗi đơn vị Neutrase, chúng liên kết với một ion kẽm và bốn ion calcium Ngoài việc sản sinh ra Neutrase (protease trung tính),

Bacillus subtilis còn tạo ra các protease kiềm tính Một trong những loài vi

khuẩn khác cũng có khả năng tổng hợp Neutrase là Paenibacillus polymyxa

2.4.5.2 Thành phần của Neutrase

Enzyme Neutrase có chứa kẽm Nếu thành phần kẽm này được lấy đi bởi EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) hoặc EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid) thì sẽ thu được một apoenzyme không hoạt động Song song

đó, calcium cũng có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và ngăn ngừa sự tự phân của enzyme này

2.4.5.3 Đặc điểm phân tử Neutrase

Neutrase có các đặc điểm đáng chú ý sau :

Trọng lượng phân tử : 32,5 kDa

2.5 Máy quang phổ

Máy quang phổ được dùng trong thí nghiệm là máy quang phổ đo phổ hấp thụ Cơ sở của quang phổ hấp thụ là định luật Lambert-Beer Theo đó, khi chùm sáng có cường độ I0 truyền tới một môi trường có độ dày l, do ánh sáng

bị hấp thụ một phần nên chùm sáng đi ra có cường độ còn lại là I Độ hấp thụ theo định luật Lambert-Beer là :

A = Log(I0/I) = αCl

Với : α là hệ số hấp thu phân tử, phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng

và bản chất môi trường (M-1.cm-1)

C là nồng độ dung dịch trong môi trường ánh sáng đi qua (M)

l là chiều dày lớp dung dịch ánh sáng đi qua (cm) (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2013)

Do đó, bằng cách pha loãng từ dung dịch chuẩn thành một dãy các dung dịch với nồng độ biết trước Tiếp theo, đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp và dựng đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ ánh sáng vào nồng độ dung dịch (đường chuẩn) Từ đó, khi xác định được độ hấp thụ ánh sáng ở cùng bước sóng của dung dịch khảo sát và dựa trên đường chuẩn, có thể xác định được nồng độ dung dịch khảo sát

2.6 Thuốc thử Folin-Ciocalteu

Thuốc thử Folin-Ciocalteu (The phenol reagent) là dung dịch thuốc thử

có chứa thành phần phosphotungstic-phosphomolypdic Thuốc thử Ciocalteu được dùng trong việc định lượng phenol và các dẫn xuất của chúng, trong đó có amino acid tyrosine

Folin-Theo Folin and Denis (1912a), dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa 10% sodium tungstate, 2% phosphomolypdic acid và 10% phosphoric acid Để được 1 L dung dịch thuốc thử, hòa tan 100 g sodium tungstate, 20 g phosphomolybdic acid và 50 mL phosphoric aicd (85%) với 750 g nước Sau

đó, đun trong 2 giờ, để nguội và pha loãng thành 1 L dung dịch

Thuốc thử Folin-Ciocalteu được sử dụng trong định lượng các dẫn xuất của phenol như tyrosine trên cơ sở chúng bị khử bởi phenol thành phức chất màu xanh trong môi trường kiềm Tuy nhiên, phức màu tạo thành rất không bền trong môi trường kiềm, dung dịch có tính kiềm càng mạnh thì sự phai màu

sẽ diễn ra càng nhanh (Folin and Denis, 1912a)

Do phản ứng màu cần môi trường kiềm nhưng phức màu tạo ra lại dễ bị phân hủy bởi chính trong dung dịch kiềm đó nên việc sử dụng lượng tương đối

dư thuốc thử được cho là cần thiết để sự tạo màu xảy ra hoàn toàn (Folin and Ciocalteu, 1927) Khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, độ màu của dung dịch đạt cực đại và kết quả định lượng càng chính xác Tuy nhiên, khi sử dụng lượng

dư thuốc thử lại gây ảnh hưởng xấu đến việc đo độ hấp thu ánh sáng của dung dịch Dung dịch bị đục và xuất hiện tủa bởi lượng dư thuốc thử Để khắc phục hiện tượng này, muối lithium được bổ sung vào thành phần của dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu

Để chuẩn bị pha dung dịch thuốc thử có thành phần muối lithium, theo Folin and Ciocalteu (1927), cho 100 g sodiumtungstate, Na2WO4.2H2O và 25

g sodium molybdate, Na2MoO4.2H2O với 700 mL nước vào bình Florence

1500 mL Sau đó, thêm 50 mL phosphoric acid 85% và 100 mL HCl đậm đặc

và đun trong 10 giờ Sau khi đun đủ thời gian, thêm 150 g lithium sulfate, 50

mL nước và vài giọt bromine Tiếp tục đun khoảng 15 phút để khử hết lượng bromine dư Sau cùng, để nguội và pha loãng thành 1 L rồi đem lọc Dung dịch thuốc thử thu được không được có màu lục nhạt

Thuốc thử Folin-Ciocalteu có thể định lượng được amino acid tyrosine ở trạng thái tự do và ngay cả khi chúng tồn tại trong liên kết peptide trong phân

tử protein hay mạch peptide Chính vì vậy, dù thời gian thủy phân ngắn hay có kéo dài cũng không ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của dung dịch thủy phân tạo thành có chứa tyrosine Như trong thí nghiệm của Folin and Denis (1912b), các tác giả đã định lượng được hàm lượng tyrosine trong 1 g lông cừu (sheep’s wool) sau khi đun với 25 mL dung dịch HCl 20% trong 1 giờ là 6% Cũng cùng lượng cơ chất đó, khi thời gian thủy phân được kéo dài đến 5,

12 và 20 giờ, lượng tyrosine xác định được vẫn là 6%

Bên cạnh đó, phương pháp quang phổ sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu

để định lượng các hợp chất phenol nên được tiến hành ở bước sóng ánh sáng

thích hợp Theo Schofield et al (2001, trích dẫn của Blainski et al., 2013), độ

hấp thụ quang cực đại của phức màu tạo thành của phản ứng sẽ phụ thuộc vào môi trường kiềm sử dụng và nồng độ của hợp chất phenol khảo sát

2.7 Trichloroacetic acid (TCA)

Trichloroacetic acid (TCA) là một dẫn xuất của acetic acid, trong đó 3 nguyên tử hydro của acetic acid được thay thế bằng 3 nguyên tử chlorine Cấu tạo hóa học của trichloroacetic acid có dạng như trên hình 2.9

CCl Cl

COOH

Về ứng dụng, trichloroacetic acid trên thực tế thường được sử dụng trong lĩnh vực sinh hóa Người ta dùng trichloroacetic acid để kết tủa những đại phân tử như protein, DNA và RNA Song song đó, dung dịch có chứa thành phần trichloroacetic acid cũng được sử dụng nhiều trong lĩnh vực thẩm mỹ (www.en.wikipedia.org)

Hình 2.10 Phản ứng theo phương pháp OPA

(Nguyễn Huỳnh Quang Diệu, 2013)

Chương 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Địa điểm : Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm D106, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần thơ

Thời gian : Từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2014

 Enzyme thủy phân thương mại được chọn sử dụng là Neutrase (Trung Quốc)

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ

 Tủ lạnh (SANAKY, Trung Quốc)

 Tủ đông (Panasonic MDF-U334-PE, Nhật Bản)

 Cân phân tích 0-210 g, ±0,0001 g (OHAUS, Mỹ)

 Tủ sấy (Lab Companison)

 Máy xác định ẩm nhanh bằng hồng ngoại

 Máy xay thịt cá

 Hệ thống Kjeldahl, hệ thống Soxhlet

 Máy lắc vortex

 Máy đo pH (pH meter TOA HM-12P, Nhật)

 Máy đo quang phổ UV-Vis Multiskan spectrum (Thermo Scientific, Mỹ)

 Bể điều nhiệt (C20 CP LAUDA)

 Bếp hồng ngoại (SANAKY, Trung Quốc)

 Một số dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm

 Dung môi petroleum ether 30-60

Các hóa chất được sử dụng trong phản ứng enzyme và định lượng tyrosine :

 Tyrosine chuẩn

 Dung dịch đệm phosphate 1/15M (Na2HPO4-KH2PO4)

 Các dung dịch HCl 0,2 N, NaOH 0,5 N, trichloroacetic acid (TCA) 5% và thuốc thử Folin-Ciocalteu

Các hóa chất được dùng trong phân tích đạm amine :

 Sodium dodecyl sulfate (SDS)

 Borax (disodium tetraborate) (Trung Quốc)

 Ortho-phthaldialdehyde (OPA) (Trung Quốc)

 Dithiothreitol (DTT) (Trung Quốc)

 Serine (Merck) và cồn tuyệt đối (ethanol)

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Phụ phẩm cá tra, phần còn lại sau khi đã tách đi phần phi lê, gồm đầu, xương, da, nội tạng,… được giữ lạnh bằng nước đá trong thời gian vận chuyển

từ nhà máy Công ty CASEAMEX về phòng thí nghiệm, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Sau đó, phụ phẩm được rửa sạch, tách bỏ nội tạng và được hấp trong 15 phút Tiếp theo, tiến hành tách lấy thịt, bỏ xương và da Phần thịt cá tách được được đem xay nhuyễn bằng máy xay và cho vào những túi nhựa có ghép miệng Lượng mẫu được cấp đông ở - 20 0C cho đến khi sử dụng